从酱油生产用菌粉中选诱优良米曲霉菌种的研究

中图分类号：TS201.3；文献标识码：A；文章篇号:1007-2764(2004)01-0005-012

从酱油生产用菌粉中选诱优良米曲霉菌种的研究

周传云 聂明 万佳蓉

（湖南农业大学食品科技学院，长沙410128）

摘要：以酱油酿造用菌粉为出发菌（S），经分离、纯化后再经紫外线诱变（15W，20cm，30min）及控温培养处理后，获得1株变异菌株。结果表明：能在44℃环境中旺盛生长；酶活力可达8158.6u/g（干曲），较出发菌株S酶活力提高了77.84%；遗传稳定性较好；发酵成酱油后经测定，其指标可达“GB18186—2000低盐固态发酵酱油”特级品，明显优于出发菌株酿造的酱油。

关键词：米曲霉；菌种诱变；酱油酿造

酱油酿造过程中主要依赖于米曲霉所产生的丰富的蛋白酶、淀粉酶、酯酶等多种酶系，分解原料中的多种成分，从而形成酱油独特的色、香、味、体[1]。可见，米曲霉菌种的好坏直接关系到酱油的产量和质量。优良的菌种往往在生产中因反复接种、传代及保藏不善等，特别是在高温情况下，常会出现污染杂菌、性状退化等而导致其生产性能下降乃至不能生产。因而，对生产菌种有目的地进行分离筛选、诱变处理，从而筛选出生长速度快、孢子数量多、酶活力高，并且不易被杂菌污染的菌株用于生产，这无疑将会给企业带来巨大的新的活力。本研究以市购酱油生产用孢子粉为材料，进行分离纯化，获得纯菌株后再经紫外线诱变，筛选获得了一株理想的米曲霉菌株。

1 材料与方法

1.1 材料

供试菌:上海某酿造厂生产的酱油曲粉，本试验将其分离、纯化后编号为S，作诱变出发菌株。市购。

主要原材料:麸皮、豆粕、食盐等均市购

诱变剂:紫外线:由从市场新购置的15W的紫外灯产生。

分离纯化及菌种保存用培养基:PDA培养基

初筛蛋白酶活力用培养基（干酪素平板）:干酪素4g、KH2PO4 0.36g、Na2HPO4 1.07g、ZnCl2 0.014g、收稿日期：2003-10-5

周传云，男，1947，2生，副教授，长期从事食品微生物、食品发酵等教学、科研、生产工作。“湖南派派食品有限公司”技术创始人，主持研制、生产“派派酸牛奶”、“派仔腊八豆”系列产品 NaCl 1.2g、CaCl2 0.002g、MgSO4·7H2O 0.5g、FeSO4 0.002g、琼脂20g、蒸馏水1000ml、pH6.5～7.0、121℃灭菌30min。

麸皮菌种培养基(同时供复筛用):豆粕9g、麸皮1g、水11ml，装入250ml的三角瓶，121℃灭菌30min。

酿造酱油用原料:豆粕1600g、麸皮400g、水2200ml、121℃灭菌30min。

1.2 主要仪器与设备

滴定管、凯氏定氮仪、陶瓷发酵罐及三角瓶、试管、培养皿等常规玻璃器皿。电子天平、无菌操作台、台式振荡器、高压蒸汽灭菌器、恒温培养箱、恒温水浴箱、723型分光光度计、显微镜、血球计数板等。

1.3 方法

1.3.1 菌种分离纯化

采用常规“稀释平板涂抹法”[2]与“稀释平板划线法”[2]等两种方法同时对供试菌进行分离纯化，挑取生长速度最快、产孢子量最致密，表面颜色最一致个体形态无异的单个纯菌落一个，移入PDA斜面培养好后备用(即为出发株S)。

1.3.2 孢子悬液制备

取2环S菌株的孢子于盛有100ml并含有玻璃珠的无菌生理盐水三角瓶中，振荡20min，得单孢子悬液。用血球计数板计数其孢子含量，并用无菌生理盐水调整孢子悬浮液浓度分别为105个/1ml、104个/1ml、103个/1ml，并置32℃温箱中培养6 h 后置于4℃冰箱备用。

1.3.3 诱变程序

出发菌→制备孢子悬液→制备含菌平板诱变处理→初筛→复筛→发酵性能测定→生产菌株

1.3.4 诱变方法[2]

各取备好的孢子悬液10ml，放入6个9cm直径的无菌玻璃培养皿中，在磁力搅拌作用下，用紫外灯（15w，20cm距离）取3个不同时间（10min、20min、30min即不同剂量）分别进行照射处理，然后取处理液各0.1ml，涂布于PDA平板表面，每个剂量用3个含菌平板，并立即用黑牛皮纸包扎好（避光），倒置于32℃恒温培养箱中培养3d，对每个平板的菌落数及致死率进行统计，取致死率在99%以上的单个孤立菌落移入PDA斜面，每个菌落5支，培养，备用。

1.3.5 照射菌株的筛选[2]

干酪素平板水解透明圈初筛法：分别从上述照射处理后的PDA斜面上取极少量孢子进行稀释，并

用血球计数板测定稀释至

1010个孢子/1ml稀释液，

取1滴于干酪素平板表面，用玻璃刮铲涂抹均匀，置32℃培养2d，分别测定每皿中透明圈直径和菌落直径（均以每皿中3个菌落的平均数计为该变异株的结果），计算HE值。HE值=透明圈直径/菌落直径，选择HE值较大的菌株移入PDA斜面，培养3d，备用。

控温培养筛选法：将经过初筛后所得菌株分别取少许孢子按上述方法稀释至1010个孢子/1ml，取0.1ml涂布于干酪素平板表面，每株用平板24个，分别置于34℃、36℃、38℃、40℃、42℃、44℃、46℃、48℃等8个不同温度下均培养3d（每个处理设2个平行样，另设1个出发株平板），观察生长情况及孢子致密状况，并分别测定所生长菌落直径及其透明圈直径，按初筛方法计算出HE值，选择能在最高温度中生长而且HE值较大的菌株移植于PDA斜面，用相应温度培养好后，保存以备进行蛋白酶活力测定复筛。

1.3.6 蛋白酶活力测定：Folin—酚法[2]

固态发酵制酶：将经过初筛后所得菌株，分别接种于三角瓶麸皮菌种培养基内，于相应温度恒温箱中培养72h，测定蛋白酶活力。

蛋白酶活力测定：准确称取鲜曲2.00g于内置玻璃珠若干粒的干净三角瓶内，加蒸馏水50ml，振摇三角瓶20min以便将曲充分打散，于40℃水浴中恒温浸提1h，用定性滤纸过滤去渣得酶液。酶液用pH7.2的0.2mol/L磷酸缓冲液进行适当稀释。40℃测酶活力，723型分光光度计680nm比色。同时测定鲜曲水分含量。

蛋白酶活力单位：在40℃，pH7.2条件下，每

min水解酪蛋白产生1µg酪氨酸的酶量为一个酶活

力单位（u）。

1.4 酱油的酿造

1.4.1 方法：低盐固态法[1]

1.4.2 流程

原料（豆粕:麸皮=8:2）→粉碎（2～3mm/粒）→混料、

润料（料:水=1:1.1）→蒸料（121℃，45min）→摊凉℃

(40)→

接种（三角瓶种曲）→通风培养（38℃，48～72h）→成曲+

盐水（含13%的盐水6300ml）→保温发酵（先用45℃保温

发酵7d，后用32℃保温发酵10d）→浸泡、淋油、过滤→取

清液装瓶→巴氏杀菌→检测

1.4.3 酱油测定

按GB18186-2000《酿造酱油》[3]标准要求进行

2 结果与分析

2.1 紫外线诱变致死结果

将S纯菌株经紫外线不同剂量照射处理后，其

致死情况见表1（剂量：照射时间min）。

表1 紫外线诱变致死情况统计表（%）

剂量

10-3 10-4 10-5

存活率致死率存活率致死率存活率致死率

0 100 0 100 0 1000

10 15 85 25 75 20 80

20 10 90 5 95 8 92

30 1 99 0.6 99.4 0.3 99.7

从表1结果看出，照射30min的致死率均在99%

以上，为了确保优良菌株不漏选，本研究从致死率

达99%以上的处理中各选取3个生长速度快、孢子

致密的菌落移入PDA斜面每个菌落2支培养好备用（编号为U1~U9）

2.2 紫外线照射菌株干酪素平板初筛结果

将诱变后挑选出的菌株涂布于干酪素平板，经

培养后，其结果见表2。

表2 诱变株干酪素平板初筛结果

编号S U1U2U3U4U5U6U7U8U9

HE值1.451.70 1.78 1.69 1.90 2.08 2.18 1.91 1.76 2.36从表2可看出变异株的HE值均高于出发株的HE值，于是从9株变异菌株中挑选出EH最大的3

株进行控温培养筛选，即：U5（HE=2.08）、U6（HE=2.18）、U9（HE=2.36）。

2.3 控温培养筛选结果