酶组织化学的应用

组化示脱氢酶分为不需辅酶和必需辅酶二种
1. 瑚珀酸脱氢酶（SDH）
SDH是属于琥珀酸氧化酶系统的酶。 不需辅酶的存在 SDH存在于所有有氧呼吸的细胞，以心肌、肾曲 管上皮细胞、肝细胞含量最丰富，和线粒体膜牢固结 合 最适PH 7.
【显示方法】Pearson 二甲亚砜法 【基本原理】 琥珀酸盐 + 受氢体（四唑盐） 富马酸+还原的受氢体
5′Nase
磷酸+铅
5′Nase
磷酸铅
硫化铅（黑色）
【注意】 5′核苷酸酶在作用上和碱性磷酸酶相似 AKP 仅肾小管刷状缘(+)
(+)
1. 肾组织中分布 肾小管刷状缘(+), 所有
基膜也(+)
2. β-甘油磷酸钠 作为底物 (—)
(四)wk.baidu.com葡萄糖-6-磷酸酶(glucose-6-phosphatase,
涂片-腹腔巨噬细胞 酸性磷酸酶 X400
(三) 5′核苷酸酶(5′nucleotidase)
催化核糖核苷和脱氧核糖核苷在C-5′位置水解磷酸 酯的水解酶
OH HO P O CH2 O OH H H
OH 碱基(嘌呤、 嘧啶） H
Pi
H
HO-CH2 H H
O
H
碱基 H
+ H2 O
5′Nase
OH （ H）
【操作步骤】
1. 新鲜组织低温冰箱切片
2. 不固定或吹干后丙酮固定15分钟
3. 用孵育液置于37℃水浴箱1~2小时 4. 流水洗, 晾干(1~2分钟)
5. 用Mayer苏木精或1%甲基绿复染
6. 流水洗10分钟 7. 常规脱水透明, 中性树胶封片
【结果】酸性磷酸酶活性处呈桔红色. 胞核兰色(苏木 精复染)或绿色(甲基绿复染)
乙酰胆碱酯酶
硫代胆碱 + 乙酸
（-SH）
铁氰化钾
亚铁氰化钾
Cu++
亚铁氰化铜沉淀
氧化还原酶 -----这是一类转移电子，催化作用物的氧化还 原反应的酶 脱氢酶 氧化酶
如琥珀酸脱氢酶、乳酸脱氢酶 如DOPA氧化酶、细胞色素氧化酶
（一）脱氢酶 脱氢酶的显示：底物为脱氢酶氧化，从底物释放
出氢，经氢传递系统，使受氢体还原而显色 常以四唑盐和铁氰化钾作为受氢体
2. 膜性腺苷三磷酸酶
又称钠-钾离子激活腺苷三磷酸酶 最适PH7.2 ~ 7.5 激活剂: Mg++, Na +, K + 抑制剂: Ca ++, 苦毒毛旋花子甙 常存在于细胞膜, 特别是分泌功能活跃的细胞膜。
3. 线粒体腺苷三磷酸酶
心肌最丰富， 肝脏次之
心肌的线粒体ATP酶被Mg++激活，而被Ca ++抑制
【结果】酶活性处出现红色无定形的沉淀, 核呈蓝绿色
酶的种类
1. 氧化还原酶 2. 转移酶 3. 水解酶 4. 裂合酶 5. 异构酶 6. 合成酶
水解酶--一类增加或去除水，催化水解反应的酶 AB+H2O AH+BOH
（一）碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）
又称碱性磷酸单酯酶（EC3.1.3.1） 在碱性环境下催化多种醇和酚的磷酸酯水解 最适PH 9.2~9.4 激活剂: 如Mg++, Mn++, 某些氨基酸等 抑制剂: 氰化物、砷酸盐等 分布：广泛存在于机体组织，常见于具有活跃转运功 能的细胞膜内，如毛细血管及毛细血管动脉部分的内皮细 胞，肾近曲小管刷状缘和肠上皮纹状缘 应用：1. 肝脏病、白血病的研究诊断 2. 骨的发生和代谢疾病的研究中
酶组织化学
---水解酶及氧化还原酶
组织化学原理及方法
组织化学
狭义 应用化学和物理学原理在组织切片上，加 入某种试剂使其与组织切片中欲检测的物 质发生反应，最终形成有色沉淀，在显微 镜下观察，以研究组织细胞结构与功能之 间的关系。
1. 基本原理
细胞内的酶催化分解合适的底物，生成 中间产物（即初级反应产物） 然后其中之一再与辅助物（或捕捉剂） 反应，生成有色不溶性的终反应产物 该反应产物沉积在原位，以显示酶的存 在
【结果】酶活性处为蓝紫色沉淀
小鼠心肌冰冻切片-琥珀酸脱氢酶 X400
2. 乳酸脱氢酶（LDH）
需辅酶的脱氢酶
广泛分布的可溶性酶，为糖原分解的酶系
最适PH 7.4
肝、骨骼肌的酶活性高于心肌
【基本原理】催化乳酸和丙酮酸的互变反应 乳酸盐 + NAD
（辅酶Ⅰ） LDH
丙酮酸盐 + （NADH+H+）
2. 钙激活的ATP酶法(钙钴法): 在ATP酶活性处, 出现黑
色硫化钴沉淀。主要用于显示肌球蛋白ATPase，区分红肌 纤维和白肌纤维
（六）非特异性酯酶
酯酶可分为三类——非特异性酯酶、脂酶、胆碱酯酶 非特异性酯酶---水解短链脂肪酸的酯 脂酶---水解长链脂肪酸的酯 胆碱酯酶---水解胆碱的酯酶
显示碱性磷酸酶的常用方法:
1. 钙钴法(Gomori-Takamatsu法)
【基本原理】 甘油磷酸钠 AKP 磷酸酯+Ca++ 磷酸钙 磷酸钴 硫化钴
【孵育液】2%巴比妥钠, 3%β-甘油磷酸钠, 2%无水氯化钙,
5% 硫酸镁
【操作步骤】
1. 新鲜组织低温冰冻切片 2. 不固定切片直接进作用液, 或用1%氯化钙Formalin(Fca)固定5分钟~2 小时, 4℃, 蒸馏水洗 3. 作用液10~60分钟, 37℃ 4. 蒸馏水洗 5. 2%硝酸钴1分钟 6. 蒸馏水洗 7. 1~2%硫化铵1分钟 8. 蒸馏水洗
肝细胞线粒体ATP酶可同时被Mg++、 Ca ++激活
心肌和肝的线粒体ATP酶均可被对-氯汞苯甲酸 （PCMB）抑制
种类 定位 最适PH 激活剂 抑制剂
肌球蛋白ATP酶
膜性ATP酶 线粒体ATP酶
腺苷三磷酸酶的显示方法 1. 镁激活的ATP酶法(铅法): 在ATP酶活性处, 出现棕黑
色的硫化铅沉淀。主要用于显示膜性ATPase，也可示线粒 体ATPase
非特异性酯酶—
最适PH 5.0 ~ 8.0
定位在溶酶体和内质网, 在肝、肾、胰和小肠具有较 高的酶活性
应用----单核巨噬细胞、T淋巴、中性粒细胞都有非 特异性酯酶反应 1. 在急性白血病分类诊断时，非特异性酯酶含量多少、有无颗
粒及颗粒大小，都有一定的诊断价值 2. 可作为T、B淋巴细胞的鉴别
显示非特异性酯酶法---同时偶联法
分布: 主要位于溶酶体内
应用: 前列腺癌和其他脏器的转移性前列腺癌(+++) Hodgins淋巴, 胃癌, 肺癌, 乳腺癌等(+++) 尤文氏瘤, 成骨肉瘤等(-)
显示酸性磷酸酶的常用方法
1. 酸性磷酸酶硝酸铅法
【基本原理】与碱性磷酸酶钙钴法的原理相似 ACP 甘油磷酸钠 磷酸酯+铅 磷酸铅
硫化铅（黑色）
OH
OH （ H）
最适PH因组织而异。小鼠肾为7.5, 睾丸、脑、肝分 别为8.5、7.5~8.5、8.0
激活剂：Mg++，Mn ++ 抑制剂：氟化钠（0.1M NaF），硼酸钠
5′核苷酸酶存在于胞膜，为胞膜的标志酶
5′核苷酸酶的显示----铅法
【基本原理】5′Nase水解底物5′单磷酸腺苷
AMP
【基本原理】过氧化物酶作用于底物（3，3-二氨基联苯胺， DAB），催化底物被H2O2氧化，生成棕色的沉淀
【作用液】DAB，Tris-cl缓冲液， H2O2 【结果】酶活性处呈棕色
小鼠腹腔巨噬细胞-过氧化物酶
*400
白血病涂片-过氧化物酶 X400
【孵育液】硝酸铅，巴比妥-硝酸盐缓冲液，β-甘油磷酸钠 【结果】酸性磷酸酶活性处呈棕黑色
2. 同时偶联法
【基本原理】ACP在酸性条件下水解萘酚AS-TR磷酸酯为萘酚ASTR和磷酸, 萘酚AS-TR和六偶氮对品红偶联, 在酶活性处形成红 色的不溶性复合物 【孵育液】萘酚AS-TR磷酸酯, 六偶氮对品红
9. 甘油明胶封片, 或脱水, 透明, 中性树胶封片
【结果】碱性磷酸酶活性处有黑色的硫化钴沉淀
肾曲管碱性磷酸酶---钙钴法 X100
肾曲管碱性磷酸酶---钙钴法
X200
(二)酸性磷酸酶(acid phosphatase, ACP)
在酸性条件下催化醇和酚类磷酸酯的水解
最适PH 为4.8~5.2
抑制剂因组织差异而不同: 酒石酸, 氟化物, 0.5%甲醛
用乙酸-α-萘酯或萘酚AS衍生物为底物，在酶作用下，释出 α-萘酚，与固蓝B或六偶氮对品红偶联，生成紫黑色或红棕 色不溶的偶氮染料
（七）胆碱酯酶
乙酰胆碱酯酶---神经组织、肌肉、红细胞中 胆碱酯酶---血浆中含量丰富 显示乙酰胆碱酯酶的方法—Karnovsky-Rotts亚铁氰 化铜法
【基本原理】 碘化乙酰硫化胆碱
【孵育液】 α-萘基磷酸钠, 蒸馏水, 5%四硼酸钠, 10%硫酸镁, 固蓝 B盐
⑵ 六偶氮对品红与α-萘酚偶联---以萘酚AS-BI磷酸酯或 萘酚AS-TR磷酸酯与六偶氮对品红。（偶联人工合成的 磷酸萘酚盐经碱性磷酸酶水解后释放出萘酚，后者立即 与重氮盐偶联生成不溶性偶氮色素）
【孵育液】萘酚AS-BI磷酸钠, 二甲基甲酰胺(DMF)或二甲基亚砜 (DMSO), Tris-cl或巴比妥醋酸缓冲液, 六偶氮对品红
（还原型辅酶Ⅰ）
（二）过氧化物酶
催化各种物质被过氧化氢（H2O2）所氧化
见于乳腺、甲状腺、唾液腺、肥大细胞等
髓过氧化物酶见于中性和嗜酸性白细胞及其前体 细胞中，对造血系统疾病的鉴别诊断极为重要
免疫组化中常用辣根过氧化物酶（HRP）作为大 分子示踪剂
【显示方法】二氨基联苯胺法示过氧化物酶
(五) 腺苷三磷酸酶
又称ATP酶 ATP
ATPase
ADP + Pi + 能量
根据所用激活剂、抑制剂以及酶定位的不同，可分 为三类ATP酶 1. 肌球蛋白腺苷三磷酸酶
定位于骨骼肌
最适PH为9.0 ~ 9.4
被Ca++激活, 而被Mg++抑制
常用作区分二型肌纤维:
Ⅰ型(红肌)----收缩慢, 活动持久, 其酶活性高, 染色深 Ⅱ型(白肌)----收缩快, 活动不持久, 其酶活性低, 染色淡
显示酶的组织化学方法
1.金属沉淀法：磷酸酶的显示
甘油磷酸钠
酸性磷酸酶
磷酸酯+铅 酶
磷酸铅
硫化铅
2.偶氮偶联法：显示各种酶类最重要的方法
底物 重氮盐 初级反应产物-不易扩散 最终反应产物-呈色
偶氮偶联法
⑴ Gomori萘酚磷酸酯法---AKP在碱性条件下将α-萘基磷 酸钠水解出α-萘酚, 随后α-萘酚与固蓝B盐在酶活性部位 偶联, 形成紫红至紫黑色的不溶性沉淀
（无色）
（蓝色沉淀）
【作用液】0.1M 琥珀酸钠, 0.1M 磷酸盐缓冲液 PH 7.6 NBT(硝基蓝四唑), 二甲亚砜(DMSO) 【步骤】 1. 新鲜组织低温冰冻切片
2. 作用液15~35 分钟 3. 生理盐水洗
4. Fca(氯化钙Formalin)固定10分钟
5. 入80%乙醇5分钟 6. 甘油明胶封固或脱水、透明、中性树胶封片
【操作步骤】
1.小块组织液氮骤冷, 低温冰箱切片 2. 甲醛钙液(Fca)固定5分钟, 4℃, 然后蒸馏水洗, 也可不固定 3. 作用液5~60分钟, 37℃或室温 4. 蒸馏水洗 5. 4%甲醛固定15分钟~2小时, 室温 6. 自来水洗, 蒸馏水洗 7. 1%甲基绿(氯仿洗过)5~10分钟, 蒸馏水洗 8. 甘油明胶封片, 或丙酮-丙酮甲苯-DPX封固
G-6-p-酶)
肝细胞特有的功能性酶, 分解糖原, 维持血糖浓度, 是糖代谢的关键酶 PH6时活性最强, PH8时最稳定, PH5时易变性 组化反应PH6.5~6.7 抑制剂: 氟化物, 锌和氰离子 酒精固定, 石蜡包埋后, G6p酶被完全抑制; 经甲醛 固定而失活 硝酸铅法显示G6p酶:
葡萄糖-6-p G6p酶 葡萄糖+磷酸 磷酸铅 硫化铅