第五章 原生质体培养 PPT课件
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植物原生质体培养(PPT)
杨树原生质体培养植株再生
Liquid MS+5 M 2,4-D;
MS+10 M KT or 1 M TDZ.
杨树原生质体培养植株再生
1/2 MS
原生质体的培养方法
•1. 液体浅层培养
将含原生质体的培养液倒入培养皿底部， 使其成一薄层，封口后进行培养。
含原生质体的液体 培养基
特点： 操作简单，对原生质体的损伤小； 容易添加新鲜培养基和转移培养物；
材料与酶解液的比例：2-10g/100ml酶 解液。
一般在25±2℃、黑暗中酶解，期间轻 轻摇动几次，或放在50rpm的摇床上。 酶解时间因材料而异，2小时~十几小时。
苜蓿叶片的酶解法分 离原生质体
三、原生质体的收集与纯化
1. 过滤：酶解结束后，将酶解物通过孔径为2080µm的不锈钢筛网过滤，除去未被酶解的组 织块和细胞团。
苜蓿叶片原 生质体的纯 化
完整的原生质体
5. 收集原生质体：
完整的原生质体
四、原生质体活力的测定
原生质体活力的高低对后来的原生质 体培养和融合影响极大。原生质体分离 过程中的任何一个步骤都会影响到原生 质体的活力，因此，必须十分小心。测 定原生质体活力的方法常用荧光素双醋 酸酯（FDA）染色法。
2. 离 心 ： 滤 液 转 到 离 心 管 中 在 50×g 下 离 心 5min。
3. 反复洗涤：离心结束后，弃去上清液，用培 养基和原生质体洗液重新悬浮沉淀的原生质 体，再离心。如此反复2-4次，就可以将残留 的酶液去掉。
4. 纯化：用含高浓度（21%）蔗糖的培养基进 行离心、纯化，完整的原生质体漂浮在上清 液的上部。
一、 材料的选择
用于分离原生质体的植物材料应是细胞分 裂旺盛的材料，如幼嫩小苗的根、胚轴、子
《原生质体育种》课件
化学诱变
使用化学诱变剂处理原生 质体，诱发基因突变，筛 选具有优良性状的新品种 。
细胞融合
将不同物种或同一物种不 同品系的原生质体进行融 合，以获得具有杂种优势 的新品种。
原生质体育种的应用
培育抗逆性强的新品种
改良作物的品质
通过原生质体育种技术，可以筛选出具有 较强抗逆性的新品种，如抗旱、抗寒、抗 盐碱等。
详细描述
物理法包括电融合、激光融合等，这些方法利用物理能量来诱导原生质体的融 合。化学法则是利用化学物质如聚乙二醇等诱导原生质体的融合。这些方法的 选择取决于实验条件和目的。
原生质体融合的应用
总结词
原生质体融合在植物育种、基因工程和生物技术等领 域有广泛的应用。
详细描述
在植物育种方面，原生质体融合可以用于创造新的植物 品种，通过将不同亲本的原生质体融合，可以产生具有 优良性状的杂种细胞，进而培育出新的植物品种。在基 因工程领域，原生质体融合可以用于基因转移和基因编 辑，通过将外源基因导入原生质体，可以实现基因的转 移和表达。此外，原生质体融合还可以用于研究细胞融 合的机制和细胞生物学特性，为生物技术的发展提供重 要的理论支持和实践经验。
现植物的遗传改良。
细胞融合
02
将不同植物的原生质体进行融合，创造新的植物品种或改良现
有品种。
细胞培养生产有用次生代谢产物
03
利用原生质体培养生产具有药用、工业或其他用途的次生代谢
产物。
02
原生质体融合
原生质体融合的定义
总结词
原生质体融合是将两种或多种植物细胞原生质体通过物理或化学方法融合，形成一个杂种细胞的技术 。
原生质体育种
目录
• 原生质体培养 • 原生质体融合 • 原生质体育种技术 • 原生质体育种的优势与挑战 • 原生质体育种案例分析
植物原生质体组织培养PPT课件
Organogenesis
Somatic genetics
Protoplast system
Cell physiology
Cell fusion
Organelle, DNA uptake
第3页/共83页
Cell cloning
意义
• 植物细胞育种中的核质替换 • 细胞质杂种的获得 • 远缘杂交创造新物种细胞 • 细胞器的互作研究
• 酚藏花红染色法（0.1%)
• 酚藏花红能使无活力的原 生质体染成红色，有活力 的原生质体不着色。
❖ 伊凡蓝(Evan’s blue)染色法(0.025%) 有活力但受损伤的细胞和死细胞能 够摄取这种染料，活细胞不摄取。
第23页/共83页
影响原生质体数量和活力的因素
• 供试材料及预处理方法 • 酶解条件：
第6页/共83页
原生质体分离的方法
酶解分离法 机械分 离 法
第7页/共83页
机械分离法：先将细胞放在高渗糖溶液
中预处理，待细胞发生轻微质壁分离，原 生质体收缩成球形后，再用机械法磨碎组 织，从伤口处可释放出完整的原生质体。
• 缺点：获得完整的原生质体的数量比较少，能够用此法产生原生质体的植物种 类受到限制。
第4页/共83页
植物原生质体的分离和培养
Flash
❖ 材料预处理 ❖ 原生质体分离的方法 ❖ 原生质体纯化 ❖ 原生质体活力测定 ❖ 影响原生质体数量和活力的因素 ❖ 原生质体培养方法 ❖ 影响原生质体培养的因素 ❖ 原生质体再生过程
第5页/共83页
用于分离原生质体的材料
材料预处理
用黑暗处理、低温处理和不同光质照射等方法，可提高某 些材料原生质体的产量和活力。 ☆ 龙胆试管苗的叶片用4℃处理较好。 ☆ 甘蔗植株必须先在黑暗下培养12h后分离的原生质体才 能分裂。 ☆ 马铃薯试管苗叶片需在黑暗下处理48h后分离原生质体， 才能获得高产量。
植物原生质体培养与体细胞杂交 PPT
常用得 PEG 和高 pH高Ca 相结合诱导融合得 具体操作程序:
混合双亲原生质体悬液,吸一小滴悬液于小 培养皿中,5~15min后原生质体沉到底面形成薄层;
每一小滴悬液慢慢加3小滴PEG溶液。PEG 溶液得组成:2难度ml 溶液(内含0、1 mol 葡萄糖、 10、5 mmol CaCI2、0、7 mol KH2PO4,KOH调节 pH到 5、5)加1g PEG-1560(或4000、6000,其她浓度)
45%,温度为19-21 度条件下生长得叶片可得到理想得原生
质体。
2、酶得种类
植物细胞壁就是由纤维素(25%~50%)、半纤维 素(50%左右)、果胶质(5%)组成。因此常用三种相 应得酶来降解细胞壁。一般认为纤维素酶和果胶 酶就是必需得,有些材料要加半纤维素酶。
商品酶制剂常含有杂质,对原生质体有不良影响, 有时要纯化。常用得方法就是将酶液在4 oC下过 Bio-Gel P6 或 Sephadex G-25。
3、渗透压得调控
如果溶液得渗透压和细胞内得渗透压不同,原生 质体有可能被涨破或收缩。因此在酶液、洗涤液和 培养液中渗透压应和原生质体内得相等或略大一些。 广泛使用得渗透压调节剂就是山梨醇和甘露醇,此 外还有蔗糖、葡萄糖、和麦芽糖,浓度约在0、40~0、 80mol/L。加入CaCl2、KH2PO4等能够提高原生质 膜得稳定性,增加完整原生质体得数目和活力。
6、原生质体得活力鉴定
(1)细胞壁染色法:
荧光增白剂——细胞壁染色剂,既可以鉴定细 胞壁就是否除净,也可检查原生质体细胞壁得再生 情况。染色后在荧光显微镜下观察(360~440nm), 染料与细胞壁形成显眼得绿色荧光,无细胞壁处则 无荧光反应,略带红色。
(2) 原生质体活力得测定:
第五章 植物原生质体的分离与培养
八. 原生质体融合
（二）杂种细胞的选择与细胞杂种的鉴定 1. 杂种细胞的选择方法 （1）培养基促进异核体生长的选择方法 （2）叶绿素缺失互补选择法 （3）机械分离，肉眼分辩法 （4）双突变系选择法 （5）荧光标记选择法
八. 原生质体融合
2. 体细胞杂种的鉴定
这种鉴定不但在于确认细胞杂种的杂种
八. 原生质体融合
八. 原生质体融合
八. 原生质体融合
原生质体的融合过程
八. 原生质体融合
原生质体的融合过程
八. 原生质体融合
八. 原生质体融合
（一）原生质体融合的方法 1. 无机盐诱导融合 用来做融合剂的无机盐是硝酸钠，1972年
Carlsony就是用它来融合烟草的原生质体，并 首次获得种间的体细胞杂种。其原理是硝酸钠 的作用是中和了质膜的负电荷，使原生质体不 再相互排斥，而紧密结合在一起，但硝酸钠对 原生质体有害作用，且诱导频率也很低，所以 目前很少有人采用。
二. 植物原生质体的基本特点与作用
5.植物原生质体为研究细胞壁的生物合成
提供了方便。 6.植物原生质体为研究细胞膜与信息的传 递，能量的转换，物质的运输等基本现 象之间的密切联系提供了可能。 7.植物原生质体不但是良好的受体，同时 又是分离细胞内各种细胞器，如细胞核、 叶绿体、线粒体等的好材料。 见图1：
融合技术要点：
P1 P2
混合静止1min
P1 P2
加入PEG
选 择
培 养
高Ca2+高pH
加入培养基
融 合
洗 涤
电场下形成原生质体凝聚体
八. 原生质体融合
3. 电融合技术
就是使用电融合仪，其优点在于避免了
第五章：原生质体培养
细胞融合的过程
膜融合
胞质融合
核融合
植物体细胞杂交 过程示意图
(1) (2) (1) (5) (3)
(4)
2、不对称细胞杂交
除了用双亲完整的原生质进行诱导融合外，也 有用一个亲本的原生质体与另一亲本原生质 体的衍生系统 如： 原生质体与胞质体 原生质体与核质体
甘蓝白化苗下胚轴胞质体和甘蓝型油菜原生 质体诱导融合得到胞质杂种。
1、机械法分离原生质体时期
1892年由Klercker用于从质壁分离的 Stratiotes aloides 细胞分离原生质体；随 后 为 Chambers 和 Hofler（1931） 将 洋 葱 表皮组织的薄片浸在1.0mol/L 蔗糖溶液中， 当原生质体收缩脱离壁时用快的刀片切开 表皮细胞，获得了少量表皮细胞的原生质 体。
3、原生质体再生植株的遗传特性
原生质体再生植株往往在形态和性状方面出现 变异，如出现白化苗、“玻璃苗”、叶发生变异、 性别、育性及发育期等发生变异。除形态和性状发 生变异外，染色体的倍性和数目也常常发生变化。 造成变异的原因是多方面的，一种是分离原生质体 的材料本身所存在的，这在使用长期无性繁殖的植 物材料时更易发生。另一方面更重要的原因可能在 于原生质体操作本身引起的。
小结
原生质体分离
原生质体纯化
原生质体培养 胞壁再生 细胞分裂形成细胞团 再生植株
第二节 原生质体融合和细胞杂交
细胞融合（细胞杂交） 两种异源（种、属间）原生质体， 在诱导剂诱发下相互接触，从而发生膜 融合，胞质融合和核融合并形成杂种细 胞，进一步发育成杂种植物体，称为细 胞融合或细胞杂交。
一、细胞融合的类型
3、渗透压的稳定剂：
酶液、洗液和培养液中渗透压应和原生质体内的相 同或接近，渗透压略大些有利于原生质体的稳定，过大 会使原生质体收缩并阻碍原生质体的启动分裂。 广泛使用的渗透压调节剂使甘露醇和山梨醇、蔗 糖、葡萄糖和麦芽糖，其浓度约在0.4～0.6mol/L。 加入CaCl2、KH2PO4、葡聚糖硫酸钾都可以提高原 生质膜的稳定性，增加完整的原生质体数目和活力。葡 聚糖硫酸钾是通过降低酶液中核糖核酸酶活性，而有利 于原生质膜的稳定。
植物原生质体培养ppt课件
界面法：利用比重不同的溶液，经离心后使完整无 损的原生质体处在两液相的界面之间，而细胞碎片 等杂质沉于管底。
20
苜蓿叶片原生 质体的纯化
完整的原生 质体
21
苜蓿叶 片的原 生质体
22
4、原生质体活力的测定
荧光素双醋酸酯（fluorescein diacetate，FDA） 染色法
活细胞
FDA
紫外光照射
分离植物原生质体的酶根据作用分为:纤维素酶、 半纤维素酶和果胶酶
12
② 酶溶剂 无机离子：提高质膜的稳定性；也可以提高原生质
体活力
牛血清白蛋白：防止酶解过程对细胞膜和细胞器的 破坏
pH缓冲剂：保持酶解液的酸碱环境的稳定，增加原 生质体的释放量和原生质体的稳定性。
13
③ 渗透压调节剂 目的：维持等渗环境，保证释放出来的原生质
植物原生质体培养
1
01 植物原生质体培养的 定义及其应用 2
原生质体概况
植物原生质体 (protoplast)：植 物细胞除去细胞 壁后所剩下的部 分。即是没有细 胞壁的裸露细胞
3
• 植物原生质体研究进展
➢ 1960年，Cocking首次应用酶法制备番茄根原生质体获 得成功。
➢ 1968年，Takebe et al.首次获得烟草叶肉原生质体培 养再生植株。
质体悬浮液倒入或滴入固体培养基表面。 特点：固体培养基中的营养可以缓慢释放到液体培
养基中 如果在固体培养基中加入活性炭，还可以吸附培养
物分泌的有毒物质，促进原生质体的生长和分裂
34
（4）琼脂糖珠培养： 用移液管吸取含原生质体的琼脂糖培养基，
滴在三角瓶中，待其凝固后，再加入适量 的液体培养基进行振荡培养。 特点：改进了培养物的通气和营养环境，从 而促进可以促进原生质体的分裂及细胞团 的形成。
20
苜蓿叶片原生 质体的纯化
完整的原生 质体
21
苜蓿叶 片的原 生质体
22
4、原生质体活力的测定
荧光素双醋酸酯（fluorescein diacetate，FDA） 染色法
活细胞
FDA
紫外光照射
分离植物原生质体的酶根据作用分为:纤维素酶、 半纤维素酶和果胶酶
12
② 酶溶剂 无机离子：提高质膜的稳定性；也可以提高原生质
体活力
牛血清白蛋白：防止酶解过程对细胞膜和细胞器的 破坏
pH缓冲剂：保持酶解液的酸碱环境的稳定，增加原 生质体的释放量和原生质体的稳定性。
13
③ 渗透压调节剂 目的：维持等渗环境，保证释放出来的原生质
植物原生质体培养
1
01 植物原生质体培养的 定义及其应用 2
原生质体概况
植物原生质体 (protoplast)：植 物细胞除去细胞 壁后所剩下的部 分。即是没有细 胞壁的裸露细胞
3
• 植物原生质体研究进展
➢ 1960年，Cocking首次应用酶法制备番茄根原生质体获 得成功。
➢ 1968年，Takebe et al.首次获得烟草叶肉原生质体培 养再生植株。
质体悬浮液倒入或滴入固体培养基表面。 特点：固体培养基中的营养可以缓慢释放到液体培
养基中 如果在固体培养基中加入活性炭，还可以吸附培养
物分泌的有毒物质，促进原生质体的生长和分裂
34
（4）琼脂糖珠培养： 用移液管吸取含原生质体的琼脂糖培养基，
滴在三角瓶中，待其凝固后，再加入适量 的液体培养基进行振荡培养。 特点：改进了培养物的通气和营养环境，从 而促进可以促进原生质体的分裂及细胞团 的形成。
原生质体融合育种PPT课件
是保藏时间很短。
第35页/共62页
（二）原生质体再生
• 原生质体融合试验之前必须摸索出最佳的再生条件和完 成再生实验，为融合体再生和复原做好准备。
• 原生质体必须重新合成细胞壁物质，恢复至完整细胞形 态，才能进一步生长、分裂和增殖，这一过程就是原生 质体的再生。
第36页/共62页
影响原生质体再生的因素（略）
• 菌体生理状态 • 稳定剂 • 酶浓度与酶作用时间 • 再生培养基的组成 • 原生质体的密度
……
第37页/共62页
三、原生质体融合
（一）融合剂和融合手段
• 化学融合剂，普遍采用PEG介导的化学融合法。
✓在PEG介导融合时，通常需要一定浓度的Ca2+和Mg2+，能更有 效地促进融合。
PEG法 原 生 质 体 的 融 合 图 示
c) 利用杂交育种往往还可以消除某一菌株在经过长期诱变处 理后所出现的产量上升缓慢的现象。
d) 杂交育种有助于总结遗传物质的转移和传递规律，丰富和 促进遗传学理论的发展。
第5页/共62页
杂交育种缺陷：
a) 只能利用已有的基因组，并不能产生新的基因； b) 杂交进程缓慢，过程繁琐，育种时间长； c) 只能进行本物种或亲缘关系较近的物种杂交，不能克服远源
3. 利用灭活原生质体检出融合体 A A
AB
4. 利用荧光染色法选择融合体5. 利用双亲对碳源利用不同而检出×融
√
合体
B
BB
×
第43页/共62页
1．利用营养缺陷型标记选择融合体
• 融合的双亲带有不同营养缺陷型标记，在基本培养基上 只有融合体生长而双亲本原生质体不能形成菌落。
• 此法较为准确可靠，缺点是易使部分表型延迟的融合体 漏选、工作量大，且营养缺陷型标记会使亲本的优良性 状丧失或降低。
第35页/共62页
（二）原生质体再生
• 原生质体融合试验之前必须摸索出最佳的再生条件和完 成再生实验，为融合体再生和复原做好准备。
• 原生质体必须重新合成细胞壁物质，恢复至完整细胞形 态，才能进一步生长、分裂和增殖，这一过程就是原生 质体的再生。
第36页/共62页
影响原生质体再生的因素（略）
• 菌体生理状态 • 稳定剂 • 酶浓度与酶作用时间 • 再生培养基的组成 • 原生质体的密度
……
第37页/共62页
三、原生质体融合
（一）融合剂和融合手段
• 化学融合剂，普遍采用PEG介导的化学融合法。
✓在PEG介导融合时，通常需要一定浓度的Ca2+和Mg2+，能更有 效地促进融合。
PEG法 原 生 质 体 的 融 合 图 示
c) 利用杂交育种往往还可以消除某一菌株在经过长期诱变处 理后所出现的产量上升缓慢的现象。
d) 杂交育种有助于总结遗传物质的转移和传递规律，丰富和 促进遗传学理论的发展。
第5页/共62页
杂交育种缺陷：
a) 只能利用已有的基因组，并不能产生新的基因； b) 杂交进程缓慢，过程繁琐，育种时间长； c) 只能进行本物种或亲缘关系较近的物种杂交，不能克服远源
3. 利用灭活原生质体检出融合体 A A
AB
4. 利用荧光染色法选择融合体5. 利用双亲对碳源利用不同而检出×融
√
合体
B
BB
×
第43页/共62页
1．利用营养缺陷型标记选择融合体
• 融合的双亲带有不同营养缺陷型标记，在基本培养基上 只有融合体生长而双亲本原生质体不能形成菌落。
• 此法较为准确可靠，缺点是易使部分表型延迟的融合体 漏选、工作量大，且营养缺陷型标记会使亲本的优良性 状丧失或降低。
植物的原生质体培养PPT课件
其它
酶液中加入葡聚糖硫酸钾、CaCl2等盐类
保护细胞膜、提高原生质体稳定性和活力
.
19
3）原生质体分离过程：一步法 （以烟草叶片为例）
▪ 第一步：预处理即对烟草植株限制供水
▪ 第二步：取幼叶常规表面消毒后在无菌条件下剥 去外表皮切成4cm的小块
▪ 第三步：制作混合酶液（纤维素酶2%和果胶酶 0.5 % ）并加入的0.7 mol甘露醇0.1 m mol
5、稳定性较差: 失去了细胞壁的保护作用，稳定性较差，易
于受到渗透压等条件变化的影.响。
6
原生质体用途
信息传递、能量转换 细胞壁合成机理 膜的结构与功能 核质关系 杂交或自交不亲和的机理 细胞间的相互作用 植物激素的作用机理
融合产生体细胞杂种 分离各种细胞器 引入各种细胞器 导入外源基因 诱发突变体
.
12
2）酶解法
1960年英国诺丁汉大学的科金第一次用酶解法从番 茄幼苗根尖中大量制备出原生质体；
常用酶：纤维素酶类、果胶酶类、半纤维素酶、蜗 牛酶等；
优点：条件温和、原生质体完整性好、活力 高、得率高，而且几乎所有的植物或它们的器 官组织或细胞均可用酶解法获得原生质体。
缺点：酶制剂中均含有核酸酶、蛋白酶、过 氧化物酶以及酚类物质，影响所获原生质体的 活力。
.
8
二、 原生质体的制备
不同的植物细胞，由于细胞壁的组成、结 构和性质有所不同，原生质体的制备方法也不 一样。
1、用于分离原生质体的材料准备：选取生长旺盛 的细胞，幼嫩的组织。
无菌试管苗叶片
上胚轴和子叶
培养细胞（愈伤组织）
.
9
2、原生质体的分离 1）、机械法：利刃机械切割 2）、酶解法：果胶酶和纤维素酶处理
酶液中加入葡聚糖硫酸钾、CaCl2等盐类
保护细胞膜、提高原生质体稳定性和活力
.
19
3）原生质体分离过程：一步法 （以烟草叶片为例）
▪ 第一步：预处理即对烟草植株限制供水
▪ 第二步：取幼叶常规表面消毒后在无菌条件下剥 去外表皮切成4cm的小块
▪ 第三步：制作混合酶液（纤维素酶2%和果胶酶 0.5 % ）并加入的0.7 mol甘露醇0.1 m mol
5、稳定性较差: 失去了细胞壁的保护作用，稳定性较差，易
于受到渗透压等条件变化的影.响。
6
原生质体用途
信息传递、能量转换 细胞壁合成机理 膜的结构与功能 核质关系 杂交或自交不亲和的机理 细胞间的相互作用 植物激素的作用机理
融合产生体细胞杂种 分离各种细胞器 引入各种细胞器 导入外源基因 诱发突变体
.
12
2）酶解法
1960年英国诺丁汉大学的科金第一次用酶解法从番 茄幼苗根尖中大量制备出原生质体；
常用酶：纤维素酶类、果胶酶类、半纤维素酶、蜗 牛酶等；
优点：条件温和、原生质体完整性好、活力 高、得率高，而且几乎所有的植物或它们的器 官组织或细胞均可用酶解法获得原生质体。
缺点：酶制剂中均含有核酸酶、蛋白酶、过 氧化物酶以及酚类物质，影响所获原生质体的 活力。
.
8
二、 原生质体的制备
不同的植物细胞，由于细胞壁的组成、结 构和性质有所不同，原生质体的制备方法也不 一样。
1、用于分离原生质体的材料准备：选取生长旺盛 的细胞，幼嫩的组织。
无菌试管苗叶片
上胚轴和子叶
培养细胞（愈伤组织）
.
9
2、原生质体的分离 1）、机械法：利刃机械切割 2）、酶解法：果胶酶和纤维素酶处理
第五章-药用植物原生质体培养
原生质体培养发展简史
1880 年 ， Hanstein 首 次 起 用 原 生 质 体 (protoplast)一词。
1960年，Cocking首次应用酶法制备番茄根原 生质体获得成功。
1971年，Takebe et al.首次得到烟草叶肉原生 质体培养的再生植株。
1985年，Fujimura et al.第一例禾谷类作物－ 水稻原生质体培养再生植株。
缺点：由于原生质体沉积于试管底部，造成 相互挤压，常引起原生质体的破碎。
2.1.2 漂浮法
原理：应用渗透剂含量较高的洗涤液（如蔗 糖浓度21%）使原生质体漂浮在液体的表面 。
步骤： ✓ 400目网筛过滤。离心。 ✓ 吸取上层液，洗涤液重悬，离心沉淀。重复
2－3次。 ✓ 收集溶液表面原生质体，用培养液洗1次。
酶分离法使用的酶
种类：纤维素酶类、果胶酶类、半纤维素酶 类、 崩溃酶、 蜗牛酶
果胶酶：是从根霉、黑曲霉中提取的,使细胞 间的果胶质降解,把细胞从组织内分离出来。
纤维素酶：是从绿色木霉中提取的，降解细 胞壁中纤维素的酶。
酶
来源
生产厂家
果胶酶类
Macerozyme R-10
Pectinase Pectolyase Y-23
2.5 微悬滴法培养
方法：吸取原生质体的悬浮液，滴于6cm直径 的培养皿的盖上，液滴大小 20-50µl左右，悬滴 培养。原生质体在液滴的中央生长。
为了防止培养基迅速蒸发，可以在培养基的 底皿里加液体培养基保湿。
3. 培养条件
KM-8p培养基，25℃－27℃，最初两周暗培 养（壁的形成和细胞再生）；分化时补充光照 培养（光照16h/d，注意KM-8p在强光下对植物 有毒）最初几天经常摇动，以助透气。
第五章 原生质体培养
图示原生质体分离过程（以叶片为例）
加果胶酶 和纤维素酶
过滤、离心
二、 原生质体纯化
• 酶解处理后得到混合液包括原生质体、细胞团 和组织碎片等，必须将杂质和酶液除去，才可 以继续培养。清除这些杂质的过程称为原生质 体纯化。 • 原生质体纯化方法有：沉降法、漂浮法和不连 续梯度离心法三种
1、 沉降法
• 这些材料不受外界环境的影响，试验重 复性好，产生的原生质体产量、活性和 稳定性等比较理想。
④ 花粉细胞
• 花粉原生质体具有单倍体和原生质体的双 重优点，花粉具有群体数量大、一致性好 和取材方便等优点，是细胞工程中一种特 殊的试验体系。
2. 酶的种类、组合和酶解时间
• 不同植物种类、组织和细胞由于细胞壁 结构、组成不同，分解细胞壁所需酶的 种类、浓度、组合及酶解时间也不同。
一、 概念： • 原生质体的概念 • 原生质体培养的概念
原生质体（Protoplast）
• 1880, Hanstein：质壁分离时，能够与细胞壁分开 的那部分细胞物质。
• 含义：去掉细胞壁的由质膜包裹、具有生活力的裸 露细胞。
植物原生质体培养的概念
指将植物细胞游离成原生质 体，在适宜的培养条件下，依据 细胞的全能性使其再生细胞壁， 进行细胞的分裂分化，并发育成 完整植株的过程。
3.酶液渗透压
原生质体由于细胞壁的解除和壁压的消失将 引起破碎。因而在酶液、原生质体洗涤液、培养 液中必须调整渗透压，维持细胞内外平衡，防止 细胞吸水涨破和脱水邹缩（破坏内部结构）。
糖醇系统
• 常用的渗透压稳定剂是糖醇系统，包括甘露醇、 山梨醇、葡萄糖、蔗糖等。
• 目前大多数使用甘露醇或山梨醇，它们能稳定 地维持渗透浓度。浓度一般为0.4-0.8 mol/L。 而蔗糖等易被原生质体吸收利用，降低渗透浓 度，故不常用。但有的植物分离原生质体又是 蔗糖的效果最好。
《原生质体的制备》课件
选取动物组织
选择健康的动物组织作为制备 原生质体的材料。
酶解消化
将动物组织放入酶液中，在适 宜的温度和pH条件下进行酶 解消化。
洗涤和保存
清洗原生质体去除残留的酶液 和其他杂质，然后进行保存备 用。
微生物原生质体制备的步骤
选取微生物菌株
选择生长旺盛、无污 染的微生物菌株作为 制备原生质体的材料 。
成功案例2
在蓝细菌原生质体制备实验中，通过选择合适的酶种类和浓度，以及优化酶解和再生过程，成功制备 出可用于遗传转化实验的原生质体。
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实验过程中的注意事项
1 操作规范
在操作过程中，要严格遵守无菌操作规程，避免交叉污 染。
2 酶液处理
在操作过程中，要严格遵守无菌操作规程，避免交叉污 染。
3 离心条件
在操作过程中，要严格遵守无菌操作规程，避免交叉污 染。
4 温度控制
在操作过程中，要严格遵守无菌操作规程，避免交叉污 染。
实验后的处理事项
02
原生质体制备的实验材料
植物细胞原生质体制备所需的材料
酶
用于分解细胞壁，常用的酶包括 纤维素酶、果胶酶和离析酶等。
渗透压稳定剂
用于保持原生质体的稳定形态， 常用的渗透压稳定剂包括甘露醇 、山梨醇等。
01
植物组织
用于制备原生质体的材料，通常 选用幼嫩的叶片、茎段或根尖等 部位。
02
03
缓冲液
用于维持细胞内的酸碱平衡，常 用的缓冲液包括Tris-HCl和MES 等。
微生物原生质体制备所需的材料
微生物菌落
用于制备原生质体的材料，可以根据 实验需求选择不同的微生物菌落。
酶
用于分解细胞壁，常用的酶包括溶菌 酶、蜗牛酶等。
原生质体的培养与融合详解演示文稿
步骤： 第一步原生质体溶液用400目网筛过滤。 第二步离心（500-1000r/min，离心5-
6min）。 第三步吸去上清液，洗涤液重新悬浮，再离心
沉淀。如此2-3次。 第四步用原生质体培养液洗1次，收集原生质
体。
当前16页，共44页，星期日。
2、漂浮法
➢ 原理：应用渗透剂含量较高的洗涤液使原生质体漂浮在 液体的表面。
当前32页，共44页，星期日。
PEG法示意图
-- + + 桥梁
-+ +-
PEG被洗掉
+- +-
膜接触
+- +-
电荷重排
当前33页，共44页，星期日。
（四）PEG结合高钙-高pH诱导法
最为常用。
具体做法：在无菌条件下混合双亲原生质体----滴 加PEG溶液，摇匀，静置---滴加高钙-高pH溶液， 摇匀，静置---滴加原生质体培养液洗涤数次---离心 获得原生质体细胞团---筛选---再生杂合细胞
毒性较低
植物+植物 植物+动物 动物+酵母
当前31页，共44页，星期日。
PEG法原理
PEG是一种带负电性的高分子化合物，在原生质 体融合中起到一种桥梁作用，可以使原生质体凝聚。 在洗脱过程中，PEG将被洗掉，导致质膜表面电荷重 排。粘连的质膜大面积紧密相连，电荷的重排导致 一个原生质体的负性电荷部位与另一原生质体的正 性电荷部位相连而导致融合。
死细胞能够摄取这种染料，活细胞不摄取
2）双醋酸盐荧光素(FDA)染色法：在荧光显微镜下有 荧光的即为有活性的原生质体。
当前19页，共44页，星期日。
第二节 原生质体培养
一、培养基
6min）。 第三步吸去上清液，洗涤液重新悬浮，再离心
沉淀。如此2-3次。 第四步用原生质体培养液洗1次，收集原生质
体。
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2、漂浮法
➢ 原理：应用渗透剂含量较高的洗涤液使原生质体漂浮在 液体的表面。
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PEG法示意图
-- + + 桥梁
-+ +-
PEG被洗掉
+- +-
膜接触
+- +-
电荷重排
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（四）PEG结合高钙-高pH诱导法
最为常用。
具体做法：在无菌条件下混合双亲原生质体----滴 加PEG溶液，摇匀，静置---滴加高钙-高pH溶液， 摇匀，静置---滴加原生质体培养液洗涤数次---离心 获得原生质体细胞团---筛选---再生杂合细胞
毒性较低
植物+植物 植物+动物 动物+酵母
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PEG法原理
PEG是一种带负电性的高分子化合物，在原生质 体融合中起到一种桥梁作用，可以使原生质体凝聚。 在洗脱过程中，PEG将被洗掉，导致质膜表面电荷重 排。粘连的质膜大面积紧密相连，电荷的重排导致 一个原生质体的负性电荷部位与另一原生质体的正 性电荷部位相连而导致融合。
死细胞能够摄取这种染料，活细胞不摄取
2）双醋酸盐荧光素(FDA)染色法：在荧光显微镜下有 荧光的即为有活性的原生质体。
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第二节 原生质体培养
一、培养基
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来源
绿色木霉 绿色木霉 Irpex lutens
生产厂家
Yakult Honsha Co. Ltd., Tokyo, Japan Calbiochem., San Diego, CA 92037, USA Kayowa Hakko Kogyo Co., Tokyo, Japan
果胶酶类
Macerozyme R-10 根霉 Pectinase 黑曲霉
第五章 原生质体培养
一、原生质体的制备 基础材料准备 预处理与酶解 原生质体收集与纯化
原生质体活力测定
1、用于分离原生质体材料的准备
无菌试管苗叶片
培养细胞
2、预处理与酶解 材料预处理：子叶、下胚轴;叶片;愈伤组织或 胚性悬浮细胞
叶肉原生质体
原生质体分离常用的商品酶
酶
纤维素酶类 onozuka R–10 Cellulysin Driselase
Purified protoplasts
4、原生质体活力检测
目测法：在显微镜下观察，根据细胞形态、流动性确定
原生质体活力。
FDA法：FDA（二乙酸荧光素）是一种非极性物质，能
自由地穿越细胞质膜，在活细胞内，FDA被酯酶裂解即发 荧光（荧光素），由于荧光素不能自由通过质膜，因而可 以在荧光显微镜下通过具荧光的细胞的观察确定细胞活性 。
建立细胞悬浮系
叶肉原生质体分离纯化
Leaves were cut in thin stripes and digested in an enzyme solution with mannitol
Purification of protoplasts from leaf debris on sucrose gradient.
琼脂糖珠培养
将含有原生质体的液态琼脂糖培养基用吸
管以大约50ul一滴的量滴于直径6cm的培养皿，
待其固化后向其中添加3ml液体培养基并于摇床
上低速旋转培养。培养过程中，通过调整液体
培养基的渗透压来调节培养物的渗透压以利于
其进一步的生长和发育。这种方法由于改善了
培养物的通气和营养环境，从而促进了原生质
体的分裂和细胞团的形成。
3、原生质体发育和植株再生
细胞壁再生 细胞分裂与生长 愈伤组织形成 植株再生
细胞壁的再生
原生质体培养数小时后开始再生新的细胞壁， 一至数天内便可形成完整的细胞壁。 电镜观察发现，原生质体培养数小时后新壁开 始形成，先是质膜合成形成细胞壁主要成分的微 纤维，然后转移到质膜表面进行聚合作用产生多 片层的结构，以后在质膜与片层之间或在膜上产 生小纤维丝，逐渐形成不定向的纤维团，最后形 成完整的细胞壁。
二、原生质体培养 1、原生质体培养基
无机盐：大量元素浓度；NO3－和NH4+的比例；Ca2+浓度
有机成分：维生素、氨基酸、糖及糖醇等，酵母提取物、水解酪蛋白。 激素：常用的激素：NAA、IAA、BA与2,4-D 渗透压：常用的渗透压调节剂：甘露醇、山梨醇、蔗糖和葡萄糖等。
原生质体的渗透压原则：培养基渗透压与细胞渗透压等渗
细胞分裂和生长
一般原生质体培养2～7d后开始第一次分裂，
但开始第一次分裂的时间随植物的种类、分离
原生质体的材料、原生质体的质量、培养基的 成分和培养条件而异。 一般用幼苗的下胚轴、子叶、幼根、悬浮
培养细胞、未成熟种子子叶等为材料分离的原
生质体，比用叶分离的原生质体容易诱导分裂，
第一次分裂出现的时间较快。
液体－固体双层培养
在培养皿的底部铺一层琼脂糖固体培养基，
再将原生质体悬浮液滴于固体培养基表面。
优点：
固体培养基中的营养物质可缓慢释放到液体
培养基中，如果在下层固体培养基中加一定量
的活性炭，则还可以吸附培养物产生的一些有
害物质，促进原生质体的分裂和细胞团的形成。
缺点：不易观察细胞的发育过程。
固体平板培养
愈伤组织形成
通常原生质体培养2周后，形成多细胞的细
胞团，3周后形成肉眼可见的小细胞团，约6周
后形成直径1mm的小愈伤组织。 原生质体培养7～10d后需及时添加新鲜培养 基，否则形成的细胞团不继续生长。待小愈伤 组织长至约1mm时应及时转移到固体培养基上使 其进一步生长。
Sigma Chemical Co.,St. Louis, MO 63178,USA
酶溶剂及其渗透压 酶溶剂：原生质体培养基或特殊配制。
渗透压调节剂：葡萄糖、甘露醇、山梨醇等
酶处理： 酶浓度 酶解时间 酶解温度
3、原生质体的收集和纯化 飘浮法：常用的飘浮剂：蔗糖、Percoll、Ficoll。 沉淀法：常用甘露醇作为渗透压调节剂，先将 酶液洗出干净，再用Percoll飘浮一次。
2、原生质体培养方法
液体浅层培养
将含有原生质体的培养液在培养皿底部铺一 薄层，封口后进行培养。 优点： 操作简单，对原生质体的损伤小，且易于添 加新鲜培养基转移培养物。 缺点： 原生质体分布不均匀，常常发生原生质体之 间的粘连现象而影响其进一步的生长和发育。 此外，难以跟踪观察某一个细胞的发育情况。
伊凡蓝法：伊凡蓝不能穿过质膜，只有质膜受到严重损
坏使，细胞才能被染色，因而可以通过细胞被染色与否确 定活性。
5、影响原生质体活力的因素 分离材料的生理状态 酶解条件：酶质量、浓度、酶解温度、酶解时间、酶
溶液的渗透压
分离条件：离心次数、离心速度、纯化方法、分离持 续时间 环境条件：操作环境的温度、分离用具的影响
即琼脂糖包埋培养。低融点的琼脂糖可在约 30℃融化与原生质体混合而不影响原生质体的生 命活动。混合后含有原生质体的培养基铺于培养 皿底部，封口后进行培养。
优点：
可以跟踪观察单个原生质体的发育情况，易于 统计原生质体分裂频率。 缺点：
操作要求严格，尤其是混合时的温度掌握必需 合适，温度偏高则影响原生质体的活力，温度偏 低则琼脂糖凝固太快原生质体不易混合均匀。
Yakylt Honsha Co. Ltd.,Tokyo, Japan Sigma Chemical Co., St. Louit, MO 63178,USA
Pectolyase Y-23
半纤维素酶
黑曲霉
Seishin Pharm. Co. Ltd., Tokyo, Japan
Rhozyme HP-150 黑曲酶Rohm and Hass Co., Philadelphia, PA 19105, USA Hemicellulase 黑曲霉