质粒DNA地提取、纯化和电泳检测

质粒DNA的提取、纯化和电泳检测

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摘要：质粒是细菌细胞中与主染色体共存、可自主复制的一段大多数呈环形的DNA，它是基因工程中一种非常重要的载体。质粒DNA的提取成为分子生物学实验室一项最基本的工作。碱变性提取法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法。电泳是带电物质在电场中向着与其电荷相反的电极移动的现象。凝胶电泳可用于分离、鉴定和纯化DNA片段，是分子生物学的核心技术之一。本次实验利用碱变法对E.coli DH5 受体菌中质粒pUC19的DNA进行提取、纯化和电泳检测，旨在学习并掌握质粒DNA提取的原理、纯化及琼脂糖凝胶电泳技术。通过此次实验，我们达到了预期效果。

关键词：质粒DNA、碱变性提取法、质粒DNA的纯化、DNA凝胶电泳

1.引言

质粒是细菌细胞中与主染色体共存、可自主复制的一段大多数呈环形的DNA。细菌质粒的相对分子质量大小从1kb至200kb以上不等。一些质粒永远独立于染色体之外，另外一些质粒在一定条件下会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。质粒在基因工程中质粒常被用做基因的载体。目前，已发现有质粒的细菌有几百种，已知的绝大多数的细菌质粒都是闭合环状DNA分子（简称cccDNA）。

由于质粒分子小、便于分离和提取的特点，在DNA重组中，质粒或经过改造后的质粒可通过连接外源基因构成重组体，携带目的基因进入细菌、动物细胞或植物体内进行扩增与表达，因此质粒是基因工程中一种非常重要的载体。质粒特征的分析已被广泛用于细菌种属鉴定、耐药性、毒力及同源性分析。近年来由于基因芯片技术的出现，质粒基因探针的开发和应用也得到了飞速的发展，所以这就要求我们从宿主细胞中提取高质量的质粒DNA。因此，质粒DNA的提取成为分子生物学实验室一项最基本的工作。

提取和纯化质粒DNA的方法很多，目前常用的有：碱裂解/碱变性法、煮沸法、羟基磷灰石柱层析法、EB-氯化铯密度梯度离心法和Wizard法等。其中，碱变性提取法最为经典和常用，是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的，适用于不同量质粒DNA的提取。该方法操作简单，易于操作，一般实验室均可进行。提取的质粒DNA纯度高，可直接用于酶切、序列测定及分析。

碱变性提取质粒DNA一般包括三个基本步骤：培养细菌细胞以扩增质粒；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒DNA。

在细菌细胞中，染色体DNA以双螺旋结构存在，质粒DNA以共价闭合环状形式存在。细胞破碎后，染色体DNA和质粒DNA均被释放出来，但是两者变性与复性所依赖的溶pH 值不同。在pH12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性；质粒DNA的大部分氢键断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离。当用pH值4.8的KAc（或NaAc）高盐缓冲溶液调节碱性溶液至中性时，变性的质粒DNA可恢复原来的共价闭合环状超螺旋结构而溶解于溶液中；但染色体DNA不能复性，而是与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起形成缠连的、可见的白色絮状沉淀。这种沉淀通过离心，与复性的溶于溶液的质粒DNA分离。溶于上清液的质粒DNA，可用无水乙醇和盐溶液，使之凝聚而形成沉淀。由于DNA和RNA性质类似，乙醇沉淀DNA的同时，也伴随着RNA沉淀，可利用RNaseA将RNA降解。质粒DNA溶液中的RNaseA以及一些可溶性蛋白，可通过酚/

氯仿抽提除去，最后获得纯度较高的质粒DNA。

电泳是带电物质在电场中向着与其电荷相反的电极移动的现象。各种生物大分子在一定pH条件下，可以解离成带电荷的离子，在电场中会向相反的电极移动。凝胶是支持电泳介质，它具有分子筛效应。含有电解液的凝胶在电场中，其中的电离子会发生移动，移动的速度可因带电离子的大小、形态及电荷量的不同而有差异。利用移动速度差异，就可以区别各种大小不同的分子。因而，凝胶电泳可用于分离、鉴定和纯化DNA片段，是分子生物学的核心技术之一。

凝胶电泳技术操作简单而迅速，分辨率高，分辨范围极广。此外，凝胶中DNA的位置可以用低浓度荧光插入染料如EB染色直接观察到，甚至含量少至20pg的双链DNA在紫外激发下也能直接检测到。

溴化乙锭（EB）是一种具扁平分子的核酸染料，可以插入到DNA或RNA分子的碱基之间，并在300 nm波长的紫外光照射下放射出荧光，所以可用来显现凝胶中的核酸分子。在适当的染色条件下，荧光的强度是同DNA片段的大小（或数量）成正比。

核酸在溶液中由于磷酸基而带负电荷，在电场中向正极移动。DNA在琼脂糖凝胶中的电泳迁移速率主要取决于下面六个因素：

（1）样品DNA分子的大小：电泳时，线性双螺旋DNA分子是以头尾位向前迁移的，其迁移速度与分子量（所含碱基）的对数值成反比，这是因为大分子有更大的摩擦阻力。

（2）DNA分子的构象：分子量相同而构象不同的DNA分子，其迁移速率不同。在抽提质粒DNA过程中，由于各种因素的影响，使超螺旋的共价闭合环状结构的质粒DNA（cccDNA）的一条链断裂，变成开环DNA（ocDNA）分子，如果两条链发生断裂，就转变为线状DNA （Liner DNA）分子。这三种构型的分子有不同的迁移率。一般情况下，超螺旋型（cccDNA）迁移速度最快，其次为线状分子，最慢的是开环状（ocDNA）分子。

（3）琼脂糖浓度：琼脂糖浓度直接影响凝胶的孔径，一定大小的DNA片段在不同浓度的琼脂糖凝胶中的泳动速度不同。通常凝胶浓度愈低，则凝胶孔径愈大，DNA电泳迁移速度越快，即分子量越大，选用的凝胶浓度应越小。

（4）电泳所用电场：低电压条件下，线性DNA片段的迁移速率与所用电压成正比。电压愈高带电颗粒泳动愈快，但随着电场强度增加，高分子量DNA的泳动速率以不同幅度增加，因此凝胶电泳分离DNA的有效范围随着电压上升而减小，为了获得DNA片段的最佳分离效果，电场强度应小于5V/cm。

（5）电泳缓冲液: 在进行分子电泳时所使用的缓冲溶液，用以稳定体系酸碱度。常见的核酸电泳缓冲液有：TAE、TBE、TPE和MOPS等。电泳缓冲液的作用：①维持合适的pH。电泳时，正极发生氧化反应（4OH-+4e-→2H2O+O2），负极发生还原反应（4H++4e-→2H2），长时间的电泳将使正极变酸，负极变碱。一个好的缓冲系统应有较强的缓冲能力，使溶液两极的pH保持基本不变；②使溶液具有一定的导电性，以利于DNA分子的迁移，例如，一般电泳缓冲液中应含有0.01～0.04mol/L的Na+离子，Na+离子的浓度太低时电泳速度变慢；太高时就会造成过大的电流使胶发热甚至熔化；③电泳缓冲液还有一个组分是EDTA，加入浓度为1～2mM，目的是螯合Mg2+等离子，防止电泳时激活DNA酶，此外还可防止Mg2+离子与核酸生成沉淀。电泳缓冲液的组成和离子强度直接影响迁移率，当电泳液为无离子水（如不慎在凝胶中忘记加缓冲液，即误用蒸馏水配置凝胶），溶液的导电性很少，带电颗粒泳动很慢，DNA几乎不移动；而在高离子强度下（如错用10×电泳缓冲液），导电性极高，带电颗粒泳动很快，产生大量的热，有时甚至熔化凝胶或使DNA变性。

（6）温度：DNA在琼脂糖凝胶电泳中的行为受碱基组成和凝胶温度影响不明显。不同大小DNA片段的相对电泳迁移率在4～30℃内无变化，一般琼脂糖凝胶电泳多在室温下进行，而当琼脂糖含量少于0.5％时凝胶很脆弱，最好在4℃下电泳以增加凝胶强度。