牛奶中抗生素残留的几种常用检测方法

牛奶中抗生素残留的几种常用检测方法

随着奶牛饲养业的发展，抗生素在预防和治疗奶牛疾病方面得到广泛的应用。生鲜牛奶中抗生素的来源主要是：第一，治疗泌乳期病牛时使用的抗生素会从奶牛体内移行到乳腺残留进入牛奶中，资料表明治疗后的奶牛，其挤出的牛奶5天内都有抗生素残留；其二，为了预防奶牛疾病并提高产量，在奶牛饲料中添加抗生素也会造成牛奶中抗生素的残留；第三，由于牧场管理不善，挤奶、储奶没有严格的卫生制度和配套的设施，人为添加或造成牛奶抗生素的污染。

牛奶中含有抗生素，不仅对人的健康造成很大的危害，而且对乳品加工企业带来经济损失（因无法生成酸奶和奶酪）。因此必须严格控制牛奶中抗生素残留，除了要做好科学饲养、精心管理；正确挤奶和预防疾病外，还要规范抗生素的使用，按国标中有关规定，用药后的奶牛5天后所产的牛奶才可作为原料乳，并且要检测其残留。世界粮农组织（FAO）、世界卫生组织（WHO）、欧盟（EC）及美国的食品和药品管理局（FDA）等对食品中抗生素最大残留量都有明确的规定，我国也有鲜奶中抗生素残留量检验标准（—94）。

目前，鲜奶中抗生素残留的检测方法大致分为三类：生物测定法（微生物测定法、放射受体测定法）、免疫法（放射免疫法、荧光免疫法、酶联免疫法）、理化分析法（波谱法、色谱及联用技术）。下面介绍几种常用的牛奶中抗生素残留检测方法。

TTC法

TTC法是我国鲜奶中抗生素残留量检验标准（—94）的检测法，属生物检测法。其测定原理基于抗生素对微生物的抑制作用。如果牛奶中含有抗生素，则加入菌种（嗜热链球菌）经培育~3小时后,加入TTC指示剂(三苯基四氮唑)不发生还原反应,所以样品呈无色状态;如果牛奶中不含抗生素,则样品呈红色.这样实验后样品颜色不变的为阳性,样品染成红色的为阴性。

TTC法的具体操作步骤:

1.菌液制备:将单菌种(嗜热链球菌)以脱脂乳为培养基,在36±1℃培养箱中培

养15小时后,再以脱脂乳以至于1:1稀释待用;

2.取待检样液9mL,在80℃水浴加热5分钟后冷却到37℃以下,加活菌液1mL,在36℃±1℃水浴2小时,加入4%的TTC指示剂, 36℃±1℃水浴培养30分钟;

3.若样液颜色不变为阳性,呈红色为阴性;若阳性的样液,再置于水浴中培养30

分钟,不显色的为阳性,呈红色为阴性.

TTC法测定各种抗生素的灵敏度为:青霉素:4ppb,链霉素:500ppb,庆大霉

素:400ppb,卡那霉素:5000ppb.它具有费用低,易开展的优点;缺点是耗时长，要求操作人员需有一定专业知识且实验过程中菌液的制备、水浴过程控制都要求严格遵守操作规程，否则易出现假阳性，以致出现检验结果的不稳定性。Delvotest sp法（戴尔沃检测法）

该法最早在香港传到广东的，其使用是基于20世纪80年代初香港要求广东出口的生奶必须“无抗”且要求采用Delvotest法检测。该方法也是生物测定法，其试剂是由荷兰DSM公司生产并由AOAC认证。原理是利用微生物—嗜热芽胞菌在64℃条件下培养～3小时后会产酸,酸引起指示剂BCP(溴甲酚紫)变为黄色;若牛奶样品中不含抗生素,培养后样品呈黄色,如样品中含有抗生素, 嗜热芽胞菌生长受到抑制而无法产酸,指示剂将不变色.

Delvotest sp 法的操作步骤:

1.以无菌操作将一片营养药片夹放入小试管内;

2.用微量移液管将牛奶样品注入小试管内;

3.把小试管放入已预热至64℃的水浴箱或恒温器中培养;

4).定时3小时取出观察颜色变化.如果底部2/3的固体介质是黄色,则为阴性, 如果底部2/3的固体介质是紫色,则为阳性.

Delvotest sp 法具有广谱性,可检测到-内酰胺类抗生素在内的更多抗生素,如磺胺类、四环素类、大环内酯类、氨基糖苷类、氯霉素等，其中对青霉素和磺胺类抗生素特别灵敏. 其灵敏度为：青霉素:3ppb,链霉素:300ppb,庆大霉

素:400ppb,卡那霉素:2500ppb。Delvotest sp 法集操作方便，严格实用，容易判断，结果可靠，费用适中等优点；但也易出现假阳性，实验证明：当牛奶样品中添加微生物防腐剂（如乳酸链球菌素—Nisn）或样品中有足够的洗涤剂残留时，便可影响嗜热芽胞菌生长而使实验为阳性。

Snap法

该方法是酶联免疫法，由美国IDEXX公司生产其检测分析仪及其试剂盒，均获得AOAC认证，它利用了竟争酶联免疫技术。其基本原理是用特异性抗体将固相载体激活，加入含待测抗原的溶液和一定量的酶标记抗原在45℃±5℃共同保温，使样品内的抗生素与内置抗生素标志物竟争与固定的抗体结合，然后进行洗涤和显色，内置抗生素标志物与固定的抗体结合形成的复合体，通过酶的作用分解可形成有色物质，通过测定色度并与参照物对照，就可以确定结果是阳性或阴性。Snap法操作步骤：

1.加入乳样于样品管中,摇匀,加热样品和检测板5分钟;

2.加入乳样于样品孔中,当激活圆环开始退却时,按Snap键;

3.反应4分钟,由Snap读数仪读取并打印结果.检测读数小于时判为阴性,大于时判为阳性.

Snap法是一种将酶化学反应的敏感性和抗原抗体免疫反应的特异性相结合的方法,其敏感性和特异性好,检测的灵敏度以普遍使用的-内酰胺类计：青霉素:5ppb,阿莫西林:10ppb,氨苄西林:10ppb,头孢西林:8ppb.其他抗生素如四环素等的检测,则需购买相应的试剂来检测. Snap法检测结果快速准确, 9分钟内即可检测出牛奶中-内酰胺类、四环素类、磺胺类等抗生素的残留含量，且有半定量的读数，可监控牧场用药的情况；检测仪器稳定性良好，结果重现性高，整个检测过程简单方便；但需购置专用仪器和试剂，成本较高。

高效液相色谱检测法

它是一种理化检测方法,是利用抗生素分子中的基团所具有的特殊反应来测定其含量.检测的过程采用了气相色谱理论,通过高压液相和高灵敏度的检测器,分离速度快、效率高和操作自动化。一般要经过样品的提取、脱蛋白、离心、层析柱净化、衍生化等步骤，能检测抗生素的具体含量，敏感性较高，但检测程序复杂，费用较高，需购买色谱仪等检测设备，不适合小型检验室。

传统的抗生素检测方法不少,有的操作烦琐,有的实验条件要求高,有的检验时间太长;这些不仅会给乳制品生产企业造成经济上和时间上的损失,而且检测结果常常会被原辅材料和人为操作等因素所影响.鉴于牛奶中抗生素残留是涉及人类