ISO标准(参考译文)单核增生李斯特氏菌的检测和计数方法

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单核细胞增生李斯特氏菌检验技术

1mL
•小的圆形灰绿色菌落，周围有棕黑色水解圈，有些菌落有黑色凹陷
10mLLB2
TSA-YE
鼠李糖
TSA-YE
阳性
选择木糖阴性、鼠李糖阳性的纯培养物继续进行鉴定
革兰氏染色
单增李斯特氏菌和斯氏李斯特氏菌在刺种点周围产生狭小的透明溶血环；在靠近金黄色葡萄球菌的接种端溶血增强
革兰氏阳性短杆菌
动力试验
MR试验
一、单核增生李斯特氏菌概况
生物学特性
该菌对理化因素抵抗力较强，在土壤、粪便、青储饲料和食品中能长期存活；对碱和盐抵抗力强，60-70℃经5-20min可杀死，70%酒精5min、2.5%石炭酸、2.5%氢氧化钠、2.5%福尔马林20min 可杀死此菌；湿热灭菌（121℃，至少15min）和干热灭菌（160-170℃，至少1hr）可杀灭该菌，对紫外线和γ射线敏感；对青霉素、氨苄青霉素、氨基糖苷类、氯霉素均敏感。
食品中单核增生李斯特氏菌检验
食品微生物检验技术
李斯特氏菌属（Listeria ）普遍存在于环境中，最新的分类学研究表明，其分为六个种：单核增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）、绵羊（伊氏）李斯特氏菌、英诺克（无害）李斯特氏菌、斯氏李斯特氏菌、威氏李斯特氏菌、格氏李斯特氏菌在李斯特氏菌属只有两种致病菌：单核增生李斯特氏菌和伊氏李斯特氏菌可以引起老鼠和其他动物发病。但是，其中通常只有单核增生李斯特氏菌和人类的李斯特氏菌症（listeriosis）相关。因此，李斯特氏菌中最有检测意义是单核增生李斯特氏菌。
一、单核增生李斯特氏菌概况
李斯特氏菌属
革兰氏阳性,老龄培养物多转为革兰阴性;兼性厌氧,无芽孢、无荚膜;生长温度范围为2-42℃（也有报道在0℃能缓慢生长）,pH范围pH4.4-pH9.6;LM的幼龄菌（16~24h的培养物），为革兰阳性小杆菌，常呈V字形，成对排列。在22~25℃环境中形成4根鞭毛，故在25℃肉汤培养液中出现轻微旋转或翻滚样的运动。而在32℃时仅形成一根鞭毛，动力缓慢。

单核细胞增生李斯特氏菌生化鉴定

单核细胞增生李斯特氏菌生化鉴定引言单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）是一种常见的食源性致病菌，可引起严重的食物中毒和感染疾病。

为了及时诊断和控制该菌的传播，对其进行准确的生化鉴定非常重要。

本文将介绍单核细胞增生李斯特氏菌的生化鉴定方法及相关实验步骤。

实验材料与方法实验材料•单核细胞增生李斯特氏菌培养基•Listeria Enrichment Broth（LEB）•Listeria Agar Base（LAB）•乳清素蛋白水解物培养基（Trypticase Soy Broth，TSB）•乳清素蛋白水解物琼脂培养基（Trypticase Soy Agar，TSA）•碱性亮绿液实验方法1.取一份食物样品，如肉类、奶制品等，加入适量LEB中，并在37℃孵育24小时。

2.取0.1ml培养液，在TSB中进行预培养，37℃孵育24小时。

3.从TSB中取出适量菌液，用胶体金法进行菌落计数，并将菌液稀释至10-4倍。

4.取适量的稀释液分别接种于LAB和TSA琼脂培养基上，并在37℃孵育24小时。

5.观察菌落形态、颜色等特征，并记录下来。

生化鉴定实验单核细胞增生李斯特氏菌生化鉴定步骤如下：1.琼脂凝胶双扩散试验：将单核细胞增生李斯特氏菌抗原与相应的抗血清共同扩散于琼脂凝胶板上，观察是否发生免疫反应。

若有明显的线条或沉淀形成，则说明存在抗原-抗体反应，可以初步判断为单核细胞增生李斯特氏菌。

2.碱性亮绿液试验：将培养基中的单核细胞增生李斯特氏菌与碱性亮绿液接触，观察是否产生绿色荧光。

若产生绿色荧光，则说明菌株具有单核细胞增生李斯特氏菌的特性。

3.单核细胞增生李斯特氏菌脂多糖（LPS）鉴定：采用酚-硫酸法或酚-硝基苯法，将培养基中的单核细胞增生李斯特氏菌进行LPS提取，然后进行比色反应。

若出现红色或紫色沉淀，则说明存在LPS，可以进一步确认为单核细胞增生李斯特氏菌。

结果与讨论通过上述实验方法，我们可以对食物样品中的单核细胞增生李斯特氏菌进行生化鉴定。

单增李斯特氏菌及其检测方法

单增李斯特氏菌及其检测方法一、单增李斯特氏菌单增李斯特氏菌，学名Listeria monocytogenes，一种革兰氏阳性菌，是李斯特菌属。

李斯特菌属(Listeria)共分为2个群，7个种：第一群包括单核细胞增生性李斯特菌(L monocytogenes，LM)(亦称产单核细胞李斯特菌)、伊氏李斯特菌(L ivanovii)(亦称绵羊李斯特菌)、英诺克李斯特菌(L innocua)(亦称无害李斯特菌)、韦氏李斯特菌(L welshimei)、塞氏李斯特菌(L seeligeri)，第二群包括格氏李斯特菌(L grayi)和莫氏李斯特菌(L mulTayi)。

其中，单增李斯特菌是唯一能引起疾病的人畜共患病的病原菌。

它能引起人、畜的李氏特菌病，感染后主要表现为败血症、脑膜炎和单核细胞增多。

二、单增李斯特氏菌检测方法1.细菌培养法该菌营养要求不高，兼性厌氧，最适在含有CO2的微需氧环境中生长，生长温度范围-1.5℃-45℃，最适温度为30℃-37℃，能在普通冰箱冷藏室生长，是一种典型的耐冷性细菌，同时还具有耐盐性。

LM在普通琼脂平板上呈细小直径约0.2-0.4μm、半透明露水样菌落。

在血琼脂平板上有β溶血环。

在显色培养基上呈蓝绿色。

2.生化鉴定法该菌主要生化特性如下：①触酶阳性；②氧化酶阴性；③发酵多种糖类；④产酸不产气；⑤不发酵木糖、甘露醇、肌醇、阿拉伯糖、侧金盏花醇、棉子糖、卫矛醇和纤维二塘；⑥不利用枸橼酸盐，40%胆汁不溶解；⑦吲哚、硫化氢、尿素、明胶液化、硝酸盐还原、赖氨酸、鸟氨酸均阴性；⑧VP、甲基红试验和精氨酸水解试验阳性；⑨对碱和盐抵抗力强，60-70℃经5-20分钟可杀死，70%酒精5min、2.5%石碳酸、2.5%氢氧化钠、2.5%福尔马林20min可杀死此菌。

⑩该菌对青霉素、氨苄青霉素、四环素、磺胺均敏感。

3.血清凝集法根据菌体抗原和鞭毛抗原，LM分为16个血清型：1／2a、1／2b、1／2c、3a、3b、3c、4a、4ab、4b、4c、4d、4e、5、6a、6b、7。

单核细胞增生李斯特氏菌MPN计数法

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二、单核细胞增生李斯特氏菌定性检验-GB 4789.30-2016 第一法
※初筛自选择性琼脂平板上分别挑取3个~5个典型或可疑菌落，分别接种木糖、
鼠李糖发酵管，于36 ℃±1 ℃培养24 h±2 h，同时在TSA-YE平板上划线，于 36 ℃±1 ℃培养18 h~24 h，然后选择木糖阴性、鼠李糖阳性的纯培养物继续进行鉴定。
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一、单核细胞增生李斯特氏菌的生物学特性
※生化特征 ※单核细胞增生李斯特氏菌(L. monocytogenes）37 ℃、24 h培养,可以分解葡萄糖、果糖、海藻糖、水杨苷、鼠李糖，产酸不产气；不分解棉子糖、肌醇、菊淀粉、卫茅醇、侧金盏花醇、木糖和甘露醇。MR和VP 试验阳性，不产生靛基质，硫化氢阴性。
※ 确认实验-鉴定：染色镜检、动力试验、生化鉴定、溶血试验、协同溶血试验cAMP(可选项目)
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三、单核细胞增生李斯特氏菌平板计数法-GB 4789.30-2016 第二法
※典型菌落计数以及对应的计算公式的应用 ※计数范围要求：选择有典型菌落的平板，菌落数合计在15 CFU~150 CFU之间的平板，计数典型菌落数。 ※计算公式1计算公式2.
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三、单核细胞增生李斯特氏菌平板计数法-GB 4789.30-2016 第二法
※样品的接种 ※根据对样品污染状况的估计，选择2个~3个适宜连续稀释度的样品匀液(液体样品可包括原液)，每个稀释度的样品匀液分别吸取1 mL以0.3 mL、0.3 mL、0.4 mL的接种量分别加入3块李斯特氏菌显色平板，用无菌L棒涂布整个平板，注意不要触及平板边缘。
※小鼠毒力试验(可选项目)
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二、单核细胞增生李斯特氏菌定性检验-GB 4789.30-2016 第一法

乳粉中单核细胞增生李斯特氏菌能力验证结果与分析

乳粉中单核细胞增生李斯特氏菌能力验证结果与分析单核细胞（monocytes）是一类存在于人体血液和组织中的白细胞（leukocytes）。

它们作为免疫系统中的重要成分，具有很强的吞噬能力和免疫调节功能。

李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）是一种革兰氏阳性杆菌，它能够引起严重的人类食物中毒，尤其是婴儿和免疫缺陷患者。

乳粉作为婴幼儿的主要食物，其安全性尤为重要。

为了对乳粉中单核细胞增生李斯特氏菌的能力进行验证，可以进行以下步骤：1.材料准备:-乳粉样品- 特定培养基（如Listeria Enrichment Broth）-李斯特氏菌（已知培养物）-离心管-培养皿2.试验步骤:a.预处理乳粉样品:-取适量的乳粉样品，加入适量的特定培养基-将混合物在摇床上以适当速度摇匀-使用离心机将样品离心，以除去悬浮的杂质b.培养李斯特氏菌:-取一定量的已知培养物，加入特定培养基中-在适当的温度和湿度下，培养李斯特氏菌至适宜的生长期c.接种乳粉样品:-取适量的乳粉样品，加入特定培养基中-添加已培养的李斯特氏菌（适量）到乳粉样品中-使混合物充分混合d.孵化和观察:-将接种混合物接种到适当的培养皿中-将培养皿置于适当的环境中（温度、湿度等）-在一定时间内观察培养皿中是否有李斯特氏菌的生长3.结果与分析:通过观察培养皿中的生长情况，可以得出以下结论和分析：-如果培养皿中出现了李斯特氏菌的生长，说明乳粉样品中存在单核细胞增生的李斯特氏菌能力。

-如果培养皿中未观察到李斯特氏菌的生长，说明乳粉样品中不存在单核细胞增生的李斯特氏菌能力。

-结果应与对照组进行比较，以确定是否存在显著差异。

需要注意的是，这是仅仅通过培养方法进行初步验证，不能判断乳粉样品的感染风险和食用安全性。

为了更准确地评估乳粉中李斯特氏菌的存在和潜在传播风险，还需要进一步的实验和分析方法，如PCR检测、测定菌群数量等。

同时还应结合临床和流行病学调查数据，做出综合评估和判断。

单增李斯特氏菌检测详解

鉴定
血清学检验菌悬液于80℃水域中加热1h，离心弃上清，剩余液与沉淀混匀制成菌悬液，进行血清学玻片凝集试验。
单核细胞增生李斯特氏菌：1/2A，1/2B， 1/2C，3A，3B，3C，4A，4AB，4B，4C， 4D，4E，7
质量控制
每次检验均需用标准阳性菌株和阴性菌株进行质量控制。样品制备的同时，在空白对照FB1增菌液中加入新鲜配制的每毫升含有10个～100个单核细胞增生李斯特氏菌的稀释液1mL和阴性培养物，按检验程序进行同步检验。
鉴定
溶血试验
刺种7％羊血琼脂平板，并刺种阳性对照菌（单核
细胞增生李斯特氏菌和绵羊李斯特氏菌）和阴性
对照菌（英诺克李斯特氏菌），30℃培养24h～ 48h。
单核细胞增生李斯特氏菌窄小的β溶血环
西尔李斯特氏菌
窄小的β溶血环
绵羊李斯特氏菌
大的β溶血环
其他
不溶血
鉴定
动力试验穿刺SIM半固体培养基，于室温（20℃～25℃）
显色培养基
CHROMagarTM Listeria上单细胞增生李斯特氏菌菌落特征
225mL FB1 30℃±1℃培养25h±1h，吸取 1mL，加入10mL FB2增菌液中30℃±1℃二次增菌25h±1h。
VIDAS快速筛选（可选）
FB2增菌液进行VIDAS快速筛选。筛选为阴性的结果可直接报告未检出。筛选为阳性的结果继续分离培养和鉴定。
分离培养
取增菌液一环，划线分离于选择性培养基 OXA、PALCAM上，35℃±1℃培养24h～48h。
报告结果
协同溶血试验、血清学试验可根据需要进行，常规检验可不进行这些试验。
报告阳性结果：检出单核细胞增生李斯特氏菌。

单核细胞增生李斯特氏菌生化鉴定

单核细胞增生李斯特氏菌生化鉴定
李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）是一种革兰氏阳性杆菌，是一种常见的细菌性食物中毒病原体。

单核细胞增生组织均为生化鉴定的一种常见方法。

以下是李斯特氏菌生化鉴定的一些特征：
1. 嗜冷性：李斯特氏菌生长适宜温度为2-45℃，菌株能够在4℃下生长，并在冷藏食品中繁殖。

2. β-溶血素产生：李斯特氏菌能够产生β-溶血素，可以通过血琼脂（Blood agar）培养基上的溶血环进行观察。

3. 乳酸发酵：李斯特氏菌是一种革兰氏阳性乳酸菌，能够进行乳酸发酵。

可以使用乳糖发酵基质（Lactose fermentation medium）进行鉴定，如果产生乳酸则为阳性。

4. 半胱氨酸脱羧：李斯特氏菌具有半胱氨酸脱羧酶活性，可以将半胱氨酸转化为硫代氨基酸。

可使用兰氏差异培养基（LDC medium）进行鉴定。

5. 半乳糖酶活性：李斯特氏菌具有半乳糖酶活性，可以将乳糖转化为半乳糖。

可使用半乳糖发酵基质（Rhamnose fermentation medium）进行鉴定。

此外，李斯特氏菌还可以进行PCR扩增目标基因进行鉴定，
如16S rRNA基因、Internal Transcribed Spacer（ITS）区域等。

需要指出的是，单纯进行生化鉴定可能存在一定的误判率，结合其他检测方法可以提高鉴定的准确性。

此外，由于李斯特氏菌在环境中广泛存在，饮食中也常常带菌，所以对于临床病例的确诊还需要结合患者的临床表现、流行病学调查等综合分析。

单核增生李斯特氏菌检测概述

单核增生李斯特氏菌检测概述单核增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）是一种革兰氏阳性的致病菌，能够在低温下生存繁殖，并在恶劣环境中形成生物被膜，使其对抗不良条件。

该菌可引起人类的李斯特菌病（Listeriosis），也是一种可以通过食品传播的重要病原体。

李斯特菌病在免疫功能低下的人群中很容易引起严重感染，包括孕妇、老年人、免疫抑制患者和新生儿。

检测单核增生李斯特氏菌的方法主要包括传统的培养方法和现代的分子生物学方法。

1.传统培养方法传统的培养方法是检测单核增生李斯特氏菌的主要方法之一、常用的培养基包括PALCAM（Polymyxin, Acriflavine, Lithium chloride and Cycloheximide）和OXOID Listeria Selective Agar等。

培养温度通常在30-37℃之间，因为单核增生李斯特氏菌可以在低温下生长。

在培养过程中，从食品样品或其他可能受污染的样品中提取菌落，并在培养基上进行培养。

培养时间通常为1-2天，培养过程中需要注意去除其他菌落的干扰。

2.分子生物学方法分子生物学方法是现代检测单核增生李斯特氏菌的常用方法，主要包括聚合酶链反应（PCR）和实时荧光定量PCR等。

这些方法的优势在于其高度敏感性和特异性。

通过检测单核增生李斯特氏菌特有的基因或序列，可以快速准确地鉴定与检测其存在。

3.培养与分子生物学相结合的方法为了更好地检测单核增生李斯特氏菌，有些方法将传统培养与分子生物学相结合。

这种方法通常先进行培养，然后使用PCR或实时荧光定量PCR等技术进行进一步检测和鉴定。

这种方法较为耗时，但能够进一步提高检测的准确性。

需要注意的是，由于单核增生李斯特氏菌能够在低温下生存，因此在食品或样品中的检测非常重要。

常见的食品样品包括生肉、海鲜、冷冻食品、奶制品等。

对于食品企业来说，建立完善的食品安全管理体系和进行规范的监测是防止单核增生李斯特氏菌传播的重要措施。

ISO李斯特菌

国标标准 ISO11290-1 1996（E）食品和动物饮料微生物学----单核增生李斯特氏菌的检测和计数方法------第一部分检测方法1.范围2.参考标准3.定义4.原理5.培养基和试剂6.设备和玻璃器皿7.取样8.待检样品前处理9.程序10.结果表达11.检测报告附录：A.检测程序图B.培养基和试剂的组成和配制C.亨氏斜射光镜检食品和动物饮料微生物学----单核增生李斯特氏菌的检测和计数方法------第一部分检测方法警告：为了保障实验室人员的健康，强烈推荐在适当装备、由有经验的微生物专家控制以及检测中的所有培养物得以谨慎处理的实验室进行单核增生李斯特氏菌检测；尤其是强烈建议孕妇不要从事单核增生李斯特氏菌的培养工作。

1.范围本ISO11290详细说明了单核增生李斯特氏菌检测和计数方法。

在绪论中受讲座的局限性，本ISO11290适用于供给人类消费或作为动物饲料的产品。

2.参考标准下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款.凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。

凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。

IEC和ISO成员保留目前有效的国际标准的注册。

ISO6887：1983微生物学—微生物检测中稀释液制备的一般导则ISO：1996，食品及动物饲料微生物学—微生物检测通则3.定义本部分ISO11290提供以下定义：3.1单核增生李斯特氏菌：在因体选择性培养基上形成典型菌落，并且当进行鉴定和确认其形态的、生理的和生化特征与本部分ISO11290的描述一致的微生物。

3.2单核增生李斯特氏菌的检测：依据本部分ISO11290实施细则确定单核增生李斯特氏菌在给定单位质量或体积的样品中存在与否。

4.原理在本部分ISO11290的限定范围内，检测单核增生李斯特氏菌需要四个连续的阶段（见附录A检测程序图）。

单增李斯特氏菌及其检测方法

单增李斯特氏菌及其检测方法一、单增李斯特氏菌单增李斯特氏菌，学名Listeria monocytogenes，一种革兰氏阳性菌，是李斯特菌属。

其中，单增李斯特菌是唯一能引起疾病的人畜共患病的病原菌。

它能引起人、畜的李氏特菌病，感染后主要表现为败血症、脑膜炎和单核细胞增多。

LM在普通琼脂平板上呈细小直径约0.2-0.4μm、半透明露水样菌落。

在血琼脂平板上有β溶血环。

在显色培养基上呈蓝绿色。

⑩该菌对青霉素、氨苄青霉素、四环素、磺胺均敏感。

3.血清凝集法根据菌体抗原和鞭毛抗原，LM分为16个血清型：1／2a、1／2b、1／2c、3a、3b、3c、4a、4ab、4b、4c、4d、4e、5、6a、6b、7。

食品中单核细胞增生李斯特氏菌检测方法的探讨

食品中单核细胞增生李斯特氏菌检测方法的探讨张慧珍（谱尼测试集团股份有限公司，北京 100194）摘要：单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）是一种人畜共患病的病原菌，是一种常见的土壤细菌，能引起严重食物中毒，感染后主要表现为败血症、脑膜炎和单核细胞增多。

单核细胞增生李斯特氏菌广泛存在于自然界中，食品中存在的单核细胞增生李斯特氏菌对人类的安全具有一定的威胁，该菌在4 ℃的环境中仍可生长繁殖，是冷藏食品中威胁人类健康的主要病原菌之一。

本文通过采用国家标准检测方法《食品安全国家标准食品微生物学检验单核细胞增生李斯特氏菌检验》（GB 4789.30—2016）对大量肉、奶、蛋和水产品等产品中单核细胞增生李斯特氏菌的检测，总结了一些食品中单核细胞增生李斯特氏菌的检测经验，主要从试剂准备、增菌、划线分离及生化鉴定等方面阐述了对单核细胞增生李斯特检测的一些理解，以期为食品检测工作中单核细胞增生李斯特氏菌的检测提供部分参考。

关键词：食品；单核细胞增生李斯特氏菌；国标检测方法Discussion on Detection Method of Listeria monocytogenes in FoodZHANG Huizhen(Pony Testing Group International Co., Ltd., Beijing 100194, China) Abstract:Listeria monocytogenes is a zoonotic pathogen. It is a common soil bacterium that can cause serious food poisoning. After infection, it is mainly manifested in sepsis, meningitis and mononucleosis. It exists widely exists in nature. Listeria monocytogenes in food is dangerous to human safety. The bacteria can still grow and reproduce in the environment of 4 ℃, and it is one of the main pathogenic bacteria that threaten human health in refrigerated food. By using the national standard detection method GB 4789.30—2016 to detect Listeria monocytogenes in a large number of meat, milk, eggs and aquatic products, this paper summarizes the detection experience of Listeria monocytogenes in some foods, and expounds some understandings of Listeria monocytogenes detection mainly from the aspects of reagent preparation, enrichment, lineation separation and biochemical identification, in order to provide some reference for the detection of Listeria monocytogenes in food testing.Keywords: food; Listeria monocytogenes; national standard detection method李斯特氏菌属隶属革兰氏阳性细菌中厚壁菌门，李斯特氏菌属可划分为6个菌种，即单核增生李斯特氏菌（L. monocytogenes）、英诺克李斯特氏菌（L. innocua）、斯氏李斯特氏菌（L. seeligeri）、威尔斯特氏菌（L. welshimeri）、伊氏李斯特菌（L. ivanovii）和格氏李斯特菌（L. grayi）[1]。

单核细胞增生李斯特氏菌检验检测细则

单核细胞增生李斯特氏菌检验检测细则1、目的根据《中华人民共和国国家标准》GB/T4789.30-2003单核细胞增生李斯特氏菌检验进行单核细胞增生李斯特氏菌检验。

2、适用范围适用于食品和食物中毒样品中单核细胞增生李斯特氏菌的检验。

3、职责检测人员负责按照本规程对被测样品进行检测；校核人员负责对检测操作人员是否规范以及检测结果是否准确进行审核；授权签字人负责综合管理和检测报告的签发。

4、试剂及器材4.1 单核细胞增生李斯特氏菌标准菌株4.2 马红球菌4.3 小白鼠：16-18g4.4 TSB-YE4.5 TSA-YE4.6 EB增菌液4.7 李氏增菌液（LB1，LB2）4.8 三糖铁琼脂4.9SIM动力培养基4.10 琼脂4.11 改良的Mc Bride琼脂（MMA）4.12 硝酸盐培养基4.13 缓冲葡萄糖蛋白胨水4.14 糖发酵培养基4.15 过氧化氢4.16 1%盐酸丫啶黄溶液4.17 1%萘啶酮酸盐溶液5、仪器设备5.1 恒温培养箱：30±1℃、24℃±1℃5.2 恒温水浴锅：46±1℃5.3 离心机：4000r/min5.4 显微镜5.5 均质器6、检测步骤6.1样品的收集及处理：无菌取样25g（ml）放灭菌均质器中加225mlEB和LB1增菌液中，充分搅拌成均质。

如不能及时检验，可暂存4℃冰箱。

6.2增菌培养：EB增菌液30℃培养48小时，LB1增菌液225ml放30℃培养24小时，吸取0.1ml，加入10ml LB2增菌液中二次增菌。

6.3分离培养：将EB增菌液和LB2二次增菌分离于选择培养基MMA琼脂平板上，培养30℃48小时，挑选可疑菌落，用白织灯45。

角斜光照射平板。

6.4选五个以上的上述可疑菌落接种三糖铁琼脂和SIM动力培养基，培养于25℃。

一般观察2天-7天，阳性者可做下一步鉴定。

6.5纯培养：将上述有动力、形成伞状者并在三糖铁琼脂培养基上层、下层的产酸而不产硫化氢的可疑培养物接种于TSA-YE上纯培养，做以下鉴定。

单核细胞增生李斯特氏菌国家标准检验方法的验证与探讨

斯特氏菌和英诺克李斯特氏菌菌落形
态与单增李斯特氏菌相似，只是菌落
周围没有水解圈。
2.2 菌株生化特征
实验样品及四种李斯特氏菌标准
菌株生化反应中，与葡萄糖、MR-VP、
麦芽糖、七叶苷、甘露醇等具有相同
的反应结果。另外，与木糖反应结果中，
除伊氏李斯特氏菌的木糖反应为阳
性，其他都为阴性。其中，通过溶血
反应区分单增细胞李斯特氏菌和英诺
关键词：李斯特氏菌；方法验证；生化鉴定
单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）是李斯特氏菌属中唯一具有致病性，也是致病力最强的细菌，是一种人畜共患的病原菌。它可以穿过宿主三个屏障，即肠屏障、血脑屏障和胎盘屏障，然其引起的疾病的发生率不高，但死亡率可达 20%~30%[1]。单增李斯特氏菌易于在冷藏食品中存活，是对人类健康危害最大的一种。在 4 ℃的储存条件下依然能够生存繁殖，主要存在于牛奶、乳制品、生牛排、羊肉、腌腊食品、西红柿、沙拉、水产品等中。在我国，食品中单增李斯特菌要求为不得检出。
按国家标准检验检测方法 GB4789.30-2010[2]。首先使用酒精灯对样品表面进行烧灼消毒，之后用无菌剪刀切割并取样 25 g 深层肌肉，然后加入 225 mL LB1 增菌液，30 ℃ 培养 24 h。取 0.1 mL，转种于 10 mL LB2 增菌液内，30 ℃培养 24 h。在李斯特氏菌显色平板以及 PALCAM 平板上，通过接种环将 LB2 增菌液以划线方式接种，并于 36 ℃环境中培养 24~48 h；同时，接种单增李斯特氏菌、英诺克李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌、斯氏李斯特氏菌、马红球菌标准菌株 [3]，分别作为阳性对照和阴性对照。从李斯特氏菌显色平板、PALCAM 琼脂平板上取 5 个以上的可疑菌落，然后，将菌落接种于木糖、鼠李糖中，在 36 ℃条件下培养 24 h；并在 TSA-YE 培养基上纯培养后，再按照染色镜检、动力试验、生化鉴定、溶血试验和协同溶血试验的顺序进行操作。最后，使用李斯特氏菌属鉴定试剂盒和全自动微生物生化鉴定仪鉴定了 TSA-YE 上纯培养的菌株。

ISO李斯特菌

ISO李斯特菌1、国标标准ISO11290-11996〔E〕食品和动物饮料微生物学----单核增生李斯特氏菌的检测和计数方法------第一部分检测方法1.范围2.参考标准3.定义4.原理5.培育基和试剂6.设备和玻璃器皿7.取样8.待检样品前处理9.程序10.结果表达11.检测报告附录：A.检测程序图B.培育基和试剂的组成和配制C.亨氏斜射光镜检食品和动物饮料微生物学----单核增生李斯特氏菌的检测和计数方法------第一部分检测方法警告：为了保障试验室人员的健康，剧烈推举在适当装备、由有阅历的微生物专家掌握以及检测中的全部培育物得以谨慎处理的试验室进行单核增生李斯特氏菌检测；尤其是剧烈建议孕妇不要从事单核增生李斯特氏菌的2、培育工作。

1.范围本ISO11290具体说明了单核增生李斯特氏菌检测和计数方法。

在绪论中受讲座的局限性，本ISO11290适用于供给人类消费或作为动物饲料的产品。

2.参考标准以下文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款.凡是注日期的引用文件，其随后全部的修改单〔不包括勘误内容〕或修订版均不适用于本标准，然而，鼓舞依据本标准达成协议的各方讨论是否可使用这些文件的最新版本。

凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。

IEC 和ISO成员保存目前有效的国际标准的注册。

ISO6887：1983微生物学—微生物检测中稀释液制备的一般导则ISO：1996，食品及动物饲料微生物学—微生物检测通则3.定义本部分ISO3、11290提供以下定义：3.1单核增生李斯特氏菌：在因体选择性培育基上形成典型菌落，并且当进行鉴定和确认其形态的、生理的和生化特征与本部分ISO11290的描述一致的微生物。

3.2单核增生李斯特氏菌的检测：根据本部分ISO11290实施细则确定单核增生李斯特氏菌在给定单位质量或体积的样品中存在与否。

4.原理在本部分ISO11290的限定范围内，检测单核增生李斯特氏菌需要四个连续的阶段〔见附录A检测程序图〕。