DCFHDA活性氧检测方法

DCFHDA活性氧检测方法

DCFH-DA（2',7'-二氯荧光二乙酸）是一种常用于检测细胞内活性氧的荧光探针。DCFH-DA最初作为一种检测脂质过氧化和活性氧产生的荧光探针而被引入。在细胞内，DCFH-DA可以被酯酶水解成DCFH（2',7'-二氯荧光二酚），而DCFH与活性氧反应生成Dichlorofluorescein（DCF）产生强烈的绿色荧光。DCFH-DA检测法被广泛应用于反应氧化应激和自由基生成的过程。

DCFH-DA检测法实际上是一种间接测定活性氧的方法。原理基于DCFH-DA能够通过酯酶水解成DCFH，而DCFH可以直接或通过活性氧来氧化生成DCF。因此，DCF的荧光强度与细胞内的活性氧水平成正相关。DCFH-DA检测法常用于检测细胞或组织中的过氧化氢（H2O2）、羟自由基（•OH）、超氧阴离子（O2•-）等活性氧物种。

DCFH-DA检测法的步骤如下：

1.细胞准备：将需要检测活性氧的细胞培养在合适的培养基中，保证细胞的活力和完整性。

2.DCFH-DA处理：将培养的细胞离心，去除培养基，并用含有适当浓度的DCFH-DA的PBS缓冲液重新悬浮细胞。DCFH-DA可在一定浓度下直接添加到细胞培养基中，也可在细胞中预处理一段时间。

3.洗涤：DCFH-DA可渗透细胞膜进入细胞内，在细胞酯酶的作用下，水解成DCFH。洗涤细胞是必要的，以去除外源DCFH-DA和水解后生成的DCFH。

4.活性氧诱导：将细胞暴露在产生活性氧的刺激剂中，如过氧化氢、

辐射、药物等。较为常用的是使用刺激物H2O2，细胞可暴露在适当浓度

的H2O2中一段时间。

5.荧光显微镜观察：在刺激剂作用一定时间后，将细胞离心，取得细

胞沉淀。用PBS洗涤，使得测量时背景荧光最小。

6.荧光检测：将洗涤好的细胞沉淀悬浮于含PBS的离心管中，通过流

式细胞术或荧光显微镜测量活性氧生成后的荧光信号。

DCFH-DA检测方法的优势在于具有响应迅速、敏感度高、操作简单等

特点。同时，DCFH-DA受活性氧物种特异性影响较小，可以检测多种活性

氧物种。然而，该方法也存在一些局限性，如DCFH-DA的自氧化、荧光淬

灭等现象，以及其对细胞内酯酶的依赖性等。

总结起来，DCFH-DA活性氧检测方法是一种应用广泛的活性氧检测方法，通过DCFH-DA与活性氧的反应生成荧光信号实现对细胞内活性氧水平

的测定。该方法操作简单、敏感度高，但也存在一些特殊情况下的局限性。