dcfh-da活性氧检测原理
dcfhda荧光探针原理
dcfhda荧光探针原理DCFH-DA荧光探针原理一、DCFH-DA荧光探针简介DCFH-DA是一种常用的细胞活性氧（ROS）指示剂，是一种无色、无味、无毒的化学物质，可以在细胞内通过酯酶水解成为荧光染料DCFH。
DCFH能够被ROS氧化成为强荧光产物DCF，因此可以用来检测ROS的产生情况。
二、DCFH-DA荧光探针原理1. DCFH-DA的特点DCFH-DA具有以下特点：（1）易于渗透细胞膜：由于其结构中含有酯基，可以很容易地穿过细胞膜进入到细胞内部。
（2）不具有荧光：DCFH-DA在细胞内并不会自发发出荧光信号，而需要被ROS氧化后才会发出强烈的荧光信号。
（3）对活性氧敏感：DCFH-DA只有在存在ROS时才能够被氧化，因此可以作为活性氧指示剂来使用。
2. ROS的产生与检测ROS包括超氧阴离子（O2•−）、过氧化氢（H2O2）、羟基自由基（•OH）等。
这些ROS可以通过多种途径产生，如细胞呼吸、光合作用、化学反应等。
在细胞内，ROS的过量产生会导致氧化应激反应，从而引起多种疾病的发生。
DCFH-DA可以检测ROS的产生情况。
当DCFH-DA进入到细胞内后，通过酯酶水解成为DCFH。
在存在ROS时，DCFH会被氧化成为强荧光产物DCF，从而发出荧光信号。
因此，DCFH-DA可以用来检测ROS的产生情况。
3. DCFH-DA的应用DCFH-DA可以广泛应用于多个领域中：（1）医学领域：DCFH-DA可以用来检测细胞内ROS的水平变化，从而判断氧化应激反应是否发生，并且可以用来研究ROS与多种疾病之间的关系。
（2）环境科学领域：DCFH-DA可以用来检测环境中污染物对细胞内ROS水平的影响。
（3）食品科学领域：DCFH-DA可以用来检测食品中抗氧化剂的含量，从而评估食品的质量。
三、DCFH-DA荧光探针的优缺点1. 优点（1）DCFH-DA无毒、无味、无色，不会对细胞产生影响。
（2）DCFH-DA可以很容易地穿过细胞膜进入到细胞内部。
组织ros含量检测方法
ROS 含量检测方法1. 荧光染料法•DCFH-DA:一种非荧光的醋酸酯，进入细胞后被酯酶水解为 DCFH，而后被活性氧氧化为高度荧光的 DCF。
•H2DCFDA:类似于 DCFH-DA，但具有更高的水溶性和更快的氧化速度。
•DHE:一种非荧光染料，与细胞内的超氧化物反应形成荧光产物 ethidium。
2. 化学发光法•Lucigenin:一种非荧光化合物，在与超氧化物反应后发出化学发光。
•L-012:一种化学发光探针，与活性氧反应发出荧光。
3. 电化学法•ROS 电极:一种选择性电极，可检测特定类型的活性氧，如超氧化物或过氧化氢。
4. 蛋白质氧化法•羰基化:检测蛋白质羰基含量，它是脂质过氧化和蛋白质氧化的标志。
•硝基化:检测蛋白质硝基含量，它是自由基攻击的标志。
5. 脂质氧化法•丙二醛 (MDA) 测定:检测 MDA 含量，它是脂质过氧化产物。
•脂质过氧化物检测:测量双键脂质产物，如 F2-异前列腺素。
6. DNA 氧化法•8-羟基脱氧鸟嘌呤 (8-OHdG) 测定:检测 DNA 氧化产物 8-OHdG 含量。
•单链 DNA 断裂测定:测量单链 DNA 断裂的频率。
7. 抗氧化剂水平测量•谷胱甘肽测定:检测谷胱甘肽含量，它是主要的抗氧化剂。
•维生素 E 测定:检测维生素 E 含量，它是脂溶性抗氧化剂。
选择方法时的考虑因素•ROS 类型:不同的方法对不同类型的 ROS 有选择性。
•样本类型:一些方法需要特定的样本类型，如细胞悬液或组织匀浆。
•检测灵敏度:一些方法比其他方法更灵敏。
•成本和复杂性:不同的方法具有不同的成本和复杂性。
活性氧检测试验方案
活性氧检测试验方案活性氧检测试验方案一：实验原理活性氧检测试剂盒(Reactive Oxygen Species Assay Kit)是一种利用荧光探针DCFH-DA进行活性氧检测的试剂盒。
DCFH-DA本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜，进入细胞内后，可以被细胞内的酯酶水解生成DCFH。
而DCFH不能通透细胞膜，从而使探针很容易被装载到细胞内。
细胞内的活性氧可以氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF。
检测DCF的荧光就可以知道细胞内活性氧的水平。
本试剂盒提供了活性氧阳性对照试剂Rosup，以便于活性氧的检测。
Rosup是一种混合物(compound mixture),浓度为50mg/ml。
二：实验步骤⑴取20 ul DCFH-DA（试剂盒有100ul)按照1:1000用无血清培养液即20ml稀释DCFH-DA，使终浓度为10微摩尔/ 升。
⑵吸取12ml细胞培养液（细胞浓度为一百万至二千万/毫升）加入24孔板中（设3个阳性对照，3个浓度梯度分别做3个重复，每孔加入1ml细胞培养液），放入细胞培养箱中培养。
⑶培养24小时后去除细胞培养液，每孔加入稀释好的DCFH-DA 1ml （加入的体积以能充分盖住细胞为宜）。
⑷ 37℃细胞培养箱内孵育20分钟。
⑸去除孵育后的DCFH-DA稀释液，每孔加入1ml无血清细胞培养液洗涤细胞（重复洗涤三次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA）。
洗涤完后每孔加入1ml 细胞培养液。
⑹在酶标仪下使用488nm激发波长，525nm发射波长，实时或逐时间点检测刺激前荧光的强弱即OD值。
⑺实验组中每孔加入已配制好的松茸多糖20ul(浓度分别为5mg/ml、10mg/ml、20mg/ml),对照组中加入阳性对照物Rosup 20ul，放入细胞培养箱内继续培养。
⑻4小时后，在酶标仪下使用488nm激发波长，525nm发射波长，实时或逐时间点检测刺激后荧光的强弱即OD值。
三：数据处理实验组：癌细胞活性氧降低率=（刺激前OD值－刺激后OD值)/刺激前OD值×100%阳性对照组：癌细胞活性氧升高率=（刺激后OD值－刺激前OD 值)/刺激前OD值×100%四：注意事项⑴探针装载后，一定要洗净残余的未进入细胞内的探针，否则会导致背景较高。
活性氧（ROS）测定试剂盒说明书
②、波长设置：最佳激发波长 500(50015nm)，最佳发射波长 525 (53020 nm)。也可按照 FITC 荧光检
测条件检测。 ③、结果以荧光度值表示。
四、细胞样本操作步骤：（可用激光共聚焦显微镜观察，也可用于流式细胞仪、荧光酶标仪、荧光分光度 计测定）
二、试剂组成及保存： 1、0.1ml 10mM DCFH-DA in DMSO，20℃保存。 2、1ml 活性氧供氢体，4-8℃保存。
三、组织样本操作步骤：（可用激光共聚焦显微镜观察，也可用于流式细胞仪、荧光酶标仪、荧光分光度 计测定）
1、单细胞悬液制备： 方法 1、采用单细胞悬液制备仪制备单细胞悬液。 方法 2、酶消化法： 方法 3、机械法（网搓法）：
本试剂盒仅用于科研实验
1、直接将探针加入培养液中： ①、直接将 DCFH-DA 探针加入无血清培养基中：一般按照 1 ：1000 用无血清培养液稀释 CFH-DA。加入的体积以能充分盖住细胞为宜， 通常对于 6 孔板的一个孔加入稀释好的 DCFH-DA 不少于 1ml。 ②、取一份不加探针，只加入培养基的细胞设为阴性对照管。阳性对照管：取一份已加入探针的细胞，同 时加入活性氧供氢体诱导细胞，推荐该试剂的工作浓度为 20～100µM。 ③、37℃孵育细胞 30min～几小时，通常为 30～60min 即可，孵育时间长短与细胞类型、刺激条件、DCFH-DA 浓度有关。一般阳性对照在刺激细胞 30 分钟左右，即可观察到明显的绿色荧光。 ④、吸去培养液，利用无血清培养液或者 0.01MPBS 反复吹打，肉眼观察瓶底由半透明(细胞单层连接成 片)转为透明，细胞层几乎全部吹打到 PBS 中。 ⑤、将细胞悬液全部收集到 1.5ml 离心管中。用无血清培养液或者 PBS 洗涤 2 次，以充分去除未进入细 胞内的 DCFH-DA。1000rpm/min，5min，吸净上清后加入 PBS 重新悬浮细胞进行测定。
DCFHDA活性氧的检测
产品号 BB-4101 BB-4102 BB-4201 BB-4202 BB-4203 BB-4204 BB-4131 BB-4133 BB-4122
产品 细胞周期检测试剂盒 JC-1 线粒体膜电位试剂盒 Caspase 3 活性检测试剂盒 Caspase 8 活性检测试剂盒 Caspase 9 活性检测试剂盒 Caspase 10 活性检测试剂盒 细胞凋亡形态学检测试剂盒 Rhodamine 123 染色试剂盒 AO/EB 双染试剂盒
产品简介： 活性氧(Reactive oxygen species, ROS) 包括超氧自由基、过氧化氢、及其下游产物过氧
化物和羟化物等，参与细胞生长增殖、发育分化、衰老和凋亡以及许多生理和病理过程。 贝博活性氧检测试剂盒是一种利用荧光探针 DCFH-DA 进行活性氧检测的试剂盒。
DCFH-DA 本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜，进入细胞内后，可以被细胞内的酯酶水解 生成 DCFH。而 DCFH 不能通透细胞膜，从而使探针很容易被标记到细胞内。在活性氧存 在的条件下，DCFH 被氧化生成荧光物质 DCF，绿色荧光强度与细胞内活性氧水平成正比， 检测 DCF 的荧光就可以知道细胞内活性氧的水平。
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咨询邮箱：bestbio@
电话：021-33921235
本产品仅供科学研究使用！请勿用于临床、诊断、食品、化妆品检测等用途！
产品说明书
检测： 对于原位标记探针的样品可以用激光共聚焦显微镜直接观察，或收集细胞后用荧光分光 光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测。对于收集细胞后标记探针的样品可以用荧光分光光 度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测，用激光共聚焦显微镜直接观察也可以。 使用 488nm 激发波长，525nm 发射波长，实时或逐时间点检测刺激前后荧光的强弱。DCF 的荧光光谱和 FITC 非常相似，可以用 FITC 的参数设置检测 DCF。
PH0630 活性氧检测试剂盒实验操作手册 Phygene
PH0630|活性氧检测试剂盒Reactive Oxygen Species Assay KitCatalog No：PH0603Size：☐100~500Tests Store at-20℃活性氧检测试剂盒（Reactive Oxygen Species Assay Kit）是一种基于荧光染料DCFH-DA（2,7-Dichlorodi-hydrofluorescein diacetate）的荧光强度变化，定量检测细胞内活性氧水平的最常用方法。
DCFH-DA本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜。
进入细胞内后，可以被细胞内的酯酶水解生成DCFH。
而DCFH不会通透细胞膜，因此探针很容易被积聚在细胞内。
细胞内的活性氧能够氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF。
绿色荧光强度与活性氧的水平成正比。
在最大激发波长480nm，最大发射波长525nm处，使用荧光显微镜，流式细胞仪或激光共聚焦显微镜等检测荧光信号。
Rosup为活性氧阳性诱导药物，根据其荧光信号强度，可分析活性氧的真正水平。
根据检测体系和检测方法的不同，本试剂盒可测定100~500次。
试剂存储冰袋运输。
-20℃干燥避光保存，有效期一年。
试剂组分编号组分规格保存方法PH0630-A DCFH-DA（10mM）0.1mL-20℃，避光保存PH0630-B活性氧阳性对照（Rosup,100mM） 1.0mL-20℃，避光保存使用说明检测步骤1.装载探针1.1原位装载探针（仅适用于贴壁细胞）①细胞准备：检测前一天进行细胞铺板，确保检测时细胞汇合度达到50~70%。
【注】：必须保证细胞状态健康，且检测时不会过度生长。
②药物诱导：去除细胞培养液，加入适量经合适的缓冲液或无血清培养基稀释到工作浓度的药物，于37℃细胞培养箱内避光孵育，具体诱导时间根据药物本身特性，以及细胞类型来决定。
（可选）阳性对照：先用无血清培养基等稀释阳性对照（Rosup,100mM）到常用工作浓度100μM，加入细胞，一般37℃避光孵育30min-4h 可显著看到活性氧水平提高，但依细胞类型会有比较明显差异。
dcfda法 -回复
dcfda法-回复dcfda的含义与应用。
DCFDA是一种广泛应用于细胞生物学和药物筛选领域的荧光探针，它可以用于评估细胞活力、检测细胞应激和测定细胞中的氧化还原状态。
在本文中，我们将逐步介绍DCFDA的使用方式和优势，并探讨其在细胞研究中的作用。
首先，DCFDA是一种草酰荧光氯化酯（dichlorofluorescein diacetate）探针，通过测量其转化为草酰荧光素（dichlorofluorescein）的草酰酶（esterase）活性，来评估细胞中的活性氧（reactive oxygen species, ROS）水平。
活性氧在正常代谢过程中产生，但在细胞应激、疾病进展和氧化损伤等情况下，可能会过度积累，导致细胞损伤甚至死亡。
因此，对于研究活性氧的产生和剧烈变化具有重要意义。
其次，DCFDA的使用方法相对简单。
首先，将DCFDA溶解在适当的溶剂中，制备一定浓度的工作溶液。
然后，将待测细胞分配到96孔板中，对照组和实验组各设置3个孔。
接下来，向每个孔中添加适量的DCFDA 工作溶液，使其最终浓度在细胞耐受范围内。
最后，孔板放置在培养箱中，恢复适宜的培养条件。
一定时间后，可以使用荧光显微镜或流式细胞术测量细胞中草酰荧光素的荧光强度。
草酰荧光素的荧光强度与细胞内活性氧水平成正比。
DCFDA在细胞研究中具有多种优势。
首先，它是一种非侵入性的探针，不会对细胞造成实质性的损伤，可以长期监测细胞的活性氧水平。
其次，DCFDA具有较高的灵敏度和选择性，可检测低浓度的活性氧水平，并与其他产生荧光的物质区分开来。
此外，DCFDA的使用方法简单直观，易于操作。
最重要的是，DCFDA可以应用于不同类型的细胞和组织，包括培养的细胞、原代细胞和体内细胞，为不同研究领域提供了广泛的适用性。
通过DCFDA的应用，我们可以得到许多有用的信息。
首先，我们可以评估细胞内活性氧水平的变化情况，了解细胞对环境应激的响应和适应能力。
dcfh-da荧光探针分子式
dcfh-da荧光探针分子式全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：DCFH-DA荧光探针是一种常用于细胞活性氧（ROS）检测的荧光探针。
ROS是细胞内的一类活性氧化物质，在细胞内参与了氧化还原反应，同时也是一种细胞内信号分子，与细胞的生理功能和疾病发生密切相关。
DCFH-DA（2',7'-二氯二羟荧光素acethoxymethyl 酯）是一种无色、无味的脂溶性荧光探针，在细胞内可以被酯酶水解释放出荧光素荧光团。
DCFH-DA与ROS的检测原理基于氧自由基可在酶的催化下将非荧光物质氧化为荧光物质，因此该荧光探针能够在细胞内检测活性氧的水平。
DCFH-DA荧光探针的合成方法比较简单，通常是通过将2',7'-二氯荧光素（DCFH）与乙酰氧甲基化试剂（acethoxymethyl）在碳酸氢钠缓冲溶液中反应合成，再通过减压蒸馏或硅胶柱层析纯化得到目标产物。
DCFH-DA的荧光特性主要是在考察细胞内氧气活性时的上，其最大吸收波长在485 nm，最大发射波长为529 nm，发射光比较稳定，可以通过荧光显微镜或流式细胞仪进行检测。
DCFH-DA荧光探针已经广泛应用于心血管疾病、神经退行性疾病等病理生理过程的研究中。
在心血管疾病中，ROS的水平与动脉粥样硬化、高血压等心血管疾病的发生发展相关。
研究人员通过DCFH-DA 荧光探针检测活性氧的水平，探索ROS与心血管疾病的关联，并希望通过抑制ROS的积累来减缓或治疗心血管疾病。
在神经退行性疾病中，如帕金森病和阿尔茨海默病，也发现ROS的水平升高。
科学家通过DCFH-DA荧光探针的应用，研究神经细胞中ROS的释放和清除机制，探索神经退行性疾病的发病机制。
第二篇示例：DCFH-DA是一种常用的荧光探针分子，通常应用于生物学研究领域。
它是一种非极性脂溶性分子，由于其能够在活细胞内被内切酯酶水解成为高度荧光的荧光染料，因此DCFH-DA广泛用于检测活细胞中的ROS（活性氧种）水平。
组织ROS及超氧化物检测
A: DCFH-DA法:测得是总活性氧,但对超氧化物不是非常灵敏.
1,取组织,用PBS或生理盐水冲洗一遍
2,按照1:500用无血清培养液稀释DCFH-DA(配好的探针需要避光放置)，24孔板每孔加入约3ml(以能完全浸没组织为准).37℃细胞培养箱内孵育20分钟。
3,用无血清细胞培养液(或PBS)洗涤细胞三次，以充分去除未进入组织内的DCFH-DA。
通常活性氧阳性对照在刺激细胞20-30分钟后可以显著提高活性氧水平。
4,用小动物成像仪在488nm激发波长，525nm发射波长处观察荧光信号.
注A::
1,托盘需要没有荧光背景或背景很低.
2,由于胎鼠组织不易拿到,如果用母鼠的脑的话建议考虑血脑屏障会不会引起探针进不去? 没有胎鼠组织的话建议选择母鼠的脑及肝作为预试组织。
DHE法: 测的是超氧化物.
1,取组织,用PBS或生理盐水冲洗一遍
2,按照1:200用无血清培养液稀释DHE(配好的探针需要避光放置)，24孔板每孔加入约3ml(以能完全浸没组织为准).37℃细胞培养箱内孵育20分钟。
3,用无血清细胞培养液(或PBS)洗涤细胞三次，以充分去除未进入组织内的DCFH-DA。
通常活性氧阳性对照在刺激细胞20-30分钟后可以显著提高活性氧水平。
4,用小动物成像仪在535nm激发波长，610nm发射波长处观察荧光信号.(或者300nm激发波长，610nm发射波长)
注B:
1,托盘需要没有荧光背景或背景很低.
2,由于胎鼠组织不易拿到,如果用母鼠的脑的话建议考虑血脑屏障会不会引起探针进不去?
3.DHE与超氧化物反应后的产物有毒,操作过程中需要防护(戴手套,防止污染台面),用过的皿及枪头等垃圾建议分类处理.。
定量检测大鼠主动脉血管内皮细胞活性氧的流式细胞
定量检测大鼠主动脉血管内皮细胞活性氧的流式细胞作者：王珊等来源：《现代仪器与医疗》2013年第03期摘要探讨流式细胞术在检测大鼠主动脉血管内皮细胞活性氧的应用。
将原代培养血管内皮细胞分阴性对照组、正常细胞组、缺氧组、缺氧/复氧组，应用荧光探针Carboxy-H2-DSFDA 分别标注后应用流式细胞仪检测活性氧含量。
结果显示血管内皮细胞缺氧/复氧4h后活性氧明显高于缺氧和正常组细胞。
流式细胞仪为检测大鼠主动脉内皮细胞活性氧提供定量、快速、稳定、重复性好检测方法。
关键词流式细胞术活性氧流式细胞术就是对处在快速直线流动中的细胞或生物颗粒进行多参数的快速定量分析和分选技术，它即可以对细胞大小，细胞表面抗原等进行快速、定量检测，也可同时用于检测细胞内的核酸定量、DNA倍体、细胞周期、细胞因子等[1]分子水平上检测。
活性氧（reactive oxygen species， ROS）是指氧的某些代谢产物和一些反应的含量产物，它不仅包括一些自由基，如羟基自由基（.OH）、超氧阴离子（O2.）、过氢羟自由基（.H2O）、过完氧基（RO.）、也包括一些非自由基、即过氧化氢（H2O2）、单线态氧（.O2）和次氯酸（HOCL）[2]。
它们可以参与脂质的过氧化、DNA链的断裂、蛋白质的修饰变性，也参与或影响细胞内的信号转到和基因表达，从而促进细胞的增殖过度而易引发肿瘤。
由于活性氧具有较高反应性，它们可以与许多不同的化合物发生化学反应，由此产生各种不同的反应生物，根据这些反应生成物或者反应物的变化程度可以进行定量或定性分析，加入Carboxy-H2-DCFDA 探针，探针本身没有荧光，且稳定存在的染料分子，在于活性氧发生反应后，探针的化学结构发生变化，生成具有强荧光的产物。
因此，通过检测反应产物的荧光强度可以在一定程度上反应活性氧水平[3]。
本文利用流式细胞仪（FCM）及荧光探针检测缺氧4h再复氧后大鼠主动脉内皮细胞的活性氧变化。
活性氧测定的基本原理与方法
活性氧测定的基本原理与方法活性氧测定是指测定细胞或生物体中活性氧分子的浓度，活性氧是一类具有高度活性的氧分子，包括一氧化氮（NO）、超氧化物自由基（O2-）、羟基自由基（•OH）和过氧化物自由基（ROO•）等。
活性氧在生物体内的生成与清除是维持生物体正常代谢的重要环节，但过多的活性氧会对细胞结构和功能产生损害，甚至引发疾病。
1.超氧自由基（O2-）测定方法：超氧自由基的测定通常采用还原性品质荧光法。
超氧自由基与荧光染料2,7-二氨基苯基荧光素（DHE）反应生成有荧光属性的产物。
通过测定荧光强度来反映细胞或生物体中超氧自由基的浓度。
2.羟基自由基（•OH）测定方法：羟基自由基的测定通常使用t-Butanol为指示剂，通过和羟基自由基发生反应形成酚类产物，并通过分光光度计测定反应后酚类产物的吸光度来测定羟基自由基的浓度。
3.过氧化氢（H2O2）测定方法：过氧化氢是常见的活性氧物种之一，可以通过酶法或化学法进行测定。
其中酶法常采用过氧化酶（catalase）催化过氧化氢与4-氨基安替比林（4-AAP）反应生成有色产物，并通过分光光度计测定反应后产物的吸光度来测定过氧化氢的浓度。
4.一氧化氮（NO）测定方法：一氧化氮是一种重要的信号分子，在体内具有多种生理功能。
目前常用的一氧化氮测定方法是Griess法。
该方法将一氧化氮转化为一种比较稳定的化合物（例如亚硝酸盐），再通过与N-(1-Naphthyl)ethylenediamine反应生成有色产物，通过分光光度计测定反应后产物的吸光度来测定一氧化氮的浓度。
除了上述方法外，还有许多其他常用的活性氧测定方法，如电子自旋共振（ESR）法、化学发光法、荧光法等。
总之，活性氧测定方法可以根据具体的活性氧物种的特性和试剂的选择进行优化，通过测定与活性氧反应后的产物或信号来反映活性氧的浓度。
这些方法在生物医学研究和临床实践中具有重要的应用价值，可用于研究活性氧在生物体内的生成与清除机制，为研究相关疾病的发生机制和寻找相关的治疗方法提供参考。
H2DCFDA（DCFH-DA）活性氧荧光探针说明书
1 / 1 本产品仅用于科研
UElandy Inc.
Tel**************
Web:www.
产 品 说 明 书
H 2DCFDA （DCFH-DA ）活性氧荧光探针
产品货号：D1002 产品规格：50 mg
产品参数
外观：可溶于DMSO 或DMF 的白色固体 Ex/Em (pH>6)：504/529 nm （终产物） CAS 号：4091-99-0 分子式：C 24H 16Cl 2O 7 分子量：487.3 分子结构图：
储存条件
-20℃干燥避光保存，有效期见外包装。
产品介绍
H 2DCFDA 是活性氧族的细胞渗透性指示剂，可在细胞
内的酯酶发生氧化反应去除其乙酸基团之前保持非荧光性。
在氧化环境中，H 2DCFDA 转变成发出绿色荧光的2,7-二氯二氢荧光素。
使用方法
1. 将H 2DCFDA 溶解于DMSO 中，得到10 mM 的储液，使用前进一步稀释。
2. 将H 2DCFDA 稀释在PBS 中成为1-10 μM 的工作液（不同细胞最适浓度可参考文献），加入细胞，37℃避光孵育30分钟，然后用0.05%胰蛋白酶-EDTA 溶液收集细胞，悬浮在新鲜培养基中，立即用流式细胞仪分析。
3. （可选步骤）如果需要，使用ROS 不敏感的荧光素染料
DCFDA 作为阳性对照，与H 2DCFDA 探针一起使用。
染色方法与H 2DCFDA 相同。
注意事项
1. 在实验开始前，产品应以高浓度贮存，并保持密封。
2. 实验中，在预热的PBS 、HBSS 或HEPES 等其他简单的生理缓冲液中加入该产品，推荐工作浓度为1-10 μM 。
DCFA
1. 装载探针本方法仅适用于贴壁培养细胞。
按照1:1000用无血清培养液稀释DCFH-DA，使终浓度为10微摩尔/升。
去除细胞培养液，加入适当体积稀释好的DCFH-DA。
加入的体积以能充分盖住细胞为宜，通常对于六孔板的一个孔加入稀释好的DCFH-DA不少于1毫升。
37℃细胞培养箱内孵育20分钟。
用无血清细胞培养液洗涤细胞三次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。
通常活性氧阳性对照在刺激细胞20-30分钟后可以显著提高活性氧水平。
说明：仅在阳性对照孔中加入Rosup作为阳性对照，其余孔不必加入Rosup。
2. 检测对于原位装载探针的样品可以用激光共聚焦显微镜直接观察，或收集细胞后用荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测。
对于收集细胞后装载探针的样品可以用荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测，用激光共聚焦显微镜直接观察也可以。
3. 参数设置使用488nm激发波长，525nm发射波长，实时或逐时间点检测刺激前后荧光的强弱。
DCF的荧光光谱和 FITC非常相似，可以用FITC的参数设置检测DCF。
4. 其它说明阳性对照可以按照1:1000的比例使用。
例如装载好探针的细胞共1毫升，可以加入1微升的阳性对照刺激。
通常刺激后20-30分钟内可以观察到非常显著的活性氧水平升高。
对于不同的细胞，活性氧阳性对照的效果可能有较大的差别。
如果在刺激后30分钟内观察不到活性氧的升高，可以适当提高活性氧阳性对照的浓度。
如果活性氧升高得过快，可以适当降低活性氧阳性对照的浓度。
另外，对于某些细胞，如果发现没有刺激的阴性对照细胞荧光也比较强，可以按照1:2000-1:5000稀释DCFH-DA，使装载探针时DCFH-DA 的浓度为2-5微摩尔/升。
探针装载的时间也可以根据情况在15-60分钟内适当进行调整。
活性氧阳性对照(Rosup)仅仅用于作为阳性对照的样品，并不是在每个样品中都需加入活性氧阳性对照。
TUNEL1. 样品处理(2)用4%多聚甲醛/0.01M PBS(pH7.0---7.6)室温下固定30—60 分钟。
荧光探针汇总
1.Fluo-3 AM （钙离子荧光探针）原理 Fluo-3 AM是一种可以穿透细胞膜的荧光染料。
Fluo-3 AM的荧光非常弱，进入细胞后可以被细胞内的酯酶剪切形成Fluo-3，从而被滞留在细胞内，和细胞内游离的钙离子结合，结合钙离子后可以产生较强的荧光。
生理意义细胞内钙离子增多是细胞损伤的结果，因此此探针能表征细胞损伤程度激发波长506nm 发射波长 526nm （绿色）备注推荐使用2.Mag-fura-2 AM（钙离子荧光探针）原理Fura-2 AM是一种可以穿透细胞膜的荧光染料。
Fura-2 AM进入细胞后可以被细胞内的酯酶剪切形成Fura-2，从而被滞留在细胞内。
Fura-2可以和钙离子结合，结合钙离子后在330-350nm激发光下可以产生较强的荧光，而在380nm激发光下则会导致荧光减弱。
这样就可以使用340nm和380nm这两个荧光的比值来检测细胞内的钙离子浓度，可以消除不同细胞样品间荧光探针装载效率的差异，荧光探针的渗漏，细胞厚度差异等一些误差因素。
生理意义细胞内钙离子增多是细胞损伤的结果，因此此探针能表征细胞损伤程度激发波长为340nm和380nm 发射波长 510nm （蓝色）备注仪器滤光片不适用3 Fluo-4-AM （钙离子荧光探针）原理Fluo 4 是一种将Fluo 3结构中的Cl替换成F的钙荧光探针。
由于将Cl替换成了电子吸引力更强的F，它的最大激发波长会向短波长处偏离10 nm左右。
所以用氩激光器激发时，Fluo 4的荧光强度比Fluo 3强1倍。
由于Fluo 4与钙离子的亲和力和Fluo 3近似，所以使用上和Fluo 3也基本相同生理意义细胞内钙离子增多是细胞损伤的结果，因此此探针能表征细胞损伤程度激发波长494nm 发射波长516nm （绿色）备注用激光器激发时荧光强度强，因此不推荐4.DCFH-DA （活性氧荧光探针）原理DCFH-DA本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜，进入细胞内后，被细胞内的酯酶水解生成DCFH。
活性氧测定的基本原理与方法
评述与进展 活性氧测定的基本原理与方法林金明3 屈 锋 单孝全(中国科学院生态环境研究中心,北京100085)摘 要 综述了过氧化氢(H 2O 2)、一重态氧(1O 2)、超氧阴离子自由基(・O -2)以及羟自由基(・OH )等活性氧的测定方法。
侧重介绍活性氧的化学反应法、捕捉法和直接测定法的基本原理和最新的进展情况,并比较了这几种方法的各自特点。
关键词 活性氧,化学发光,自由基,评述 2001211208收稿;2002205205接受本文系中国科学院“百人计划”和国家杰出青年科学基金资助项目(N o.20125514)1 活性氧氧是生命运动过程中不可缺少的一种气体,人们一旦处于缺氧或者供氧不足的环境中,就会感到憋气的痛苦甚至死亡。
所以,自从1770年代初英国人Joseph Priestley 发现氧以来,氧一直被人们认为是一种对人体百益而无一害的气体。
可是,科学技术迅速发展起来的今天,我们知道,不管是空气中的氧还是水中的溶解氧都具有较高的氧化性,与一般的金属铁一样,处于空气中的人体各部位都在不断地受到氧的腐蚀而“生锈”,当然这种腐蚀与铁不同,它体现在人体的细胞水平上。
特别是人体各种器官随着年龄的增大不断地老化更是这种腐蚀“生锈”的直观表现。
1969年McC ord 与Fridovich [1]发现,在生化反应过程中O 2获得一个电子还原生成超氧自由基(O -2),进而经过红血球的分离精制后获得O -2的清除灭活酶,并命名为超氧化物歧化酶(superoxide dismultase ,S OD )。
这一发现激发了大批的科学研究者致力于O -2的生成过程、反应活性、毒性、生理和病理等等各方面的研究,去探索解明S OD 在生理学上的意义。
同时由O -2衍生出来的过氧化氢(H 2O 2)、羟自由基(・OH )、激发态氧(一重态氧或称单线态氧,1O 2)也受到了人们的重视。
近10多年来,活性氧在人体内的作用受到人们极大的关注,报道了大量有关活性氧,特别是超氧自由基和羟自由基与机体细胞的许多功能活动以及各种疾病,如癌、动脉硬化、糖尿病、心脑血栓、缺氧再灌注综合症、感染以及衰老效应等相关的研究论文和著作[2～8],引起人们对活性氧的普遍兴趣,从而激发了人们更深入地去研究活性氧的各种特性,开发各种相关的抗氧化、抗衰老物质,在医学和分子生物学领域已成为一项广泛引起重视的研究课题。
活性氧ROS分析试剂盒H2DCFDA
活性氧ROS 分析试剂盒 H 2DCFDA说明书修订日期说明书修订日期：：2015.07.13Cat number ：KGAF018Store at -20℃ for 6months ，避光For Research Use Only （科研专用）一、产品描述我们提供还原型具有细胞膜透性的ROS 荧光探针衍生物。
还原型与乙酰化形式的2'，7'-二氯荧光素（DCF ）是无荧光的乙酸酯基团，在胞内可以被酯酶氧化或水解，从而脱去，生成带电荷形式的探针。
利用合适的激发光源可以很方便地在各种检测平台上观察测量，如流式细胞仪、荧光酶标仪和荧光显微镜。
由于染料很容易受到光氧化，在进行实验时必须必须全程注意避光。
相比较其非羧基衍生物，羧基-H2DCFDA 带有额外的负电荷。
羧基-H2DCFDA SE 是带有一个氨基活性的琥珀酰亚胺酯基团,可与与胞内成分以共价形式更持久的结合。
二、产品包装三、操作说明制备储液工作液必须新鲜配制，实验结束即可丢弃稀释过的多余探针，染料在水溶液中更容易氧化分解，请尽快用完。
在最低探针加载浓度的条件下，本试剂盒提供的探针，可以满足切片或悬浮细胞（设置加载孵育液体积每个反应不超过2mL 的情况下）至少1000 TESTS 。
一般注意事项一般来说，只要能获得足够的荧光信号即可，尽量选择最小浓度的AM 酯，尽量减少AM 酯的水解副产物（甲醛和乙酸）的富集。
加载条件的选择尽可能考虑原有细胞的自然生长条件。
一些研究者给出的建议是：生理温度较之室温对于染料的加载效果更好。
综合考虑，我们推荐您在进行ROS 检测时，优先使用具有细胞膜透性的ROS 探针，如羧基-DCFDA 或者荧光素二醋酸（FDA ）。
加载探针1.1 制备活细胞悬浮液（106细胞/mL ）。
注意：对象是贴壁细胞的话，条件与悬浮细胞类似。
用PBS 稀释AM 加载溶液（参见步骤2）浸没贴壁细胞（或细胞爬片）。
1.2 用PBS 或者HBSS 稀释10mM 的AM 原液，制成AM 加载工作溶液（终浓度为1~10µM ）。
dcfh-da荧光探针实验方法
荧光探针实验方法在荧光研究领域中扮演着至关重要的角色。
本文将介绍dcfh-da荧光探针实验方法，包括准备实验材料、实验步骤、数据分析等内容。
一、准备实验材料1. dcfh-da荧光探针：这是一种常用的荧光探针，用于检测活性氧（ROS）的水平。
实验前需要保证荧光探针的纯度和稳定性。
2. 细胞培养基：用于培养细胞，保证细胞的健康状况。
3. 细胞样本：需要提前培养好的细胞样本，确保细胞的密度和活性满足实验要求。
4. 无菌离心管、移液枪等实验用具：用于实验操作时的样本处理等。
二、实验步骤1. 细胞培养准备：将细胞培养基加热至37°C，然后用该培养基将细胞进行冲洗，以保证培养皿中的细胞质量和活性。
2. 细胞处理：将细胞样本移至离心管中，并进行离心，去除培养基。
然后加入适量的新鲜培养基。
3. 荧光探针处理：将dcfh-da荧光探针溶解在适量的溶剂中，得到一定浓度的荧光探针溶液。
然后将此溶液与细胞一同孵育。
4. 孵育及洗涤：将加入荧光探针的细胞样本在37°C下进行孵育，一定时间后，取出细胞并进行洗涤，去除多余的荧光探针。
5. 数据采集：使用荧光显微镜或者流式细胞仪等设备，对实验后的细胞样本进行荧光信号的采集。
三、数据分析1. 荧光信号的强度：通过对实验得到的荧光信号进行强度的分析，可以得到细胞中活性氧的水平。
2. 荧光信号的变化趋势：对细胞样本在不同条件下的荧光信号进行对比，可以得出不同条件下细胞内活性氧水平的变化趋势。
3. 统计学分析：可以通过统计学方法对实验数据进行分析，得出实验结果的可靠性和可信度。
通过以上实验方法和数据分析，我们可以准确、快速地得到细胞内活性氧水平的信息，这对于生物医学研究以及药物研发等领域具有重要意义。
总结通过本文对dcfh-da荧光探针实验方法的介绍，相信读者对于如何进行这一类型的荧光实验有了更深入的了解。
在进行实验操作时，务必注意实验操作规范，并根据实验需求进行合理的数据分析，以确保实验结果的准确性和可靠性。
dcfh-da活性氧检测原理
dcfh-da活性氧检测原理
DCFH-DA（2,7-二氯荧光啶）活性氧检测原理是通过活性氧破坏DCFH-DA，DCFH-DA分解成荧光细胞毒性产物亚甲基罗丹明B（DCF）。
该量子事件可以被检测到，从而表明活性氧的存在。
DCFH-DA活性氧检测是一种流式分析技术，它使用可见光来测量2,7-二氯荧光啶（DCFH-DA）荧光信号的强度，以非特异性地监测细胞或组织中的活性氧水平。
DCFH-DA 是一种非特异性、可逆的低分子量荧光探针，它能有效地监测活性氧的产生，具有快速、灵敏、易操作的优势，并且可以用于降低样品的检测和体内细胞水平的活性氧检测。
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dcfh-da活性氧检测原理
活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）是指一类具有高度活跃的氧原子或氧化剂，主要包括超氧阴离子（O2•-）、氢过氧化物（HO2•）、过氧化氢（H2O2）、单线态氧（1O2）、羟基自由基（•OH）等物质。
在正常生理状态下，适量的活性氧能够参与细胞信号传导、炎症应答、免疫调节等重要生物学过程。
然而，当活性氧的生成和清除失衡时，会导致细胞内的氧化应激，引发细胞内氧化性损伤，从而诱发多种疾病，如心血管疾病、神经系统疾病和肿瘤等。
活性氧的检测技术主要分为直接检测法和间接检测法。
直接检测法主要通过对活性氧的特定物理或化学性质进行测定，如电子顺磁共振（EPR）、荧光探针和化学发光等。
间接检测法则是通过测定活性氧对其他物质的氧化反应来间接评价活性氧的水平，如酶活性测定法和抗氧化剂测定法等。
本文将主要介绍直接检测法中常用的电子顺磁共振法（EPR）和荧光探针法。
一、电子顺磁共振法（EPR）：
电子顺磁共振法利用电子磁共振技术来直接检测自由基和活性氧。
其原理是利用带有未成对电子的物质（即自由基）对外加磁场的电子自旋产生磁共振现象。
在EPR仪器中，样品通过微波辐射，引发由磁共振演变而形成的微弱信号。
通过测量这些信号的幅度、形状和宽度等参数，可以判断活性氧的种类和数量。
EPR法的优点在于其高灵敏度和高特异性，可以实现对各种活性氧物质的定量分析。
然而，EPR仪器操作相对复杂，且仪器成本较高，因此在实际应用中受到一定的限制。
二、荧光探针法：
荧光探针法是一种通过测定荧光探针与活性氧的反应生成的荧光信号来间接检测活性氧水平的方法。
荧光探针是一类能够与活性氧发生反应的化合物，一般可分为特异性探针和非特异性探针。
特异性探针是指能够选择性地与活性氧发生化学反应，生成具有荧光特性的产物。
例如，二氟苯基三氟甲烷（DCFH-DA）作为一种常用的特异性探针，它通过氧自由基致氧化反应生成2',7'-二羟基荧光素（DCF），DCF会发出绿色荧光，并与活性氧的浓度呈正相关。
非特异性探针则是指在活性氧和其他生物分子之间发生反应生成荧光产物，不能直接与活性氧产物形成特异性产物。
例如，羟苯基二(2-羟苯酚曙红，H2DCFDA)是一种常用的非特异性探针，它能够与活性氧和氧自由基产生反应，生成荧光产物。
通过测定探针的荧光强度，可以间接反映活性氧的水平。
荧光探针法的优点在于其操作简单、成本低廉，对样品的破坏小，广泛应用于生物医学研究和临床诊断中。
总之，活性氧的检测是研究氧化应激和相关疾病的重要手段。
电子顺磁共振法和荧光探针法是常用的活性氧检测方法，它们各自具有独特的优点和适用范围。
在实际应用中，可以根据需要选择合适的方法进行活性氧检测，以达到准确和可靠的检测结果。