有机化合物分离纯化策略

Chloride, Chloroform, Methanol, Ethanol, Isopropanol, Water, Acetonitrile
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提高纯化的策略
►梯度选择
►上样量
►填料
►上样方法
►RediSep 色谱柱
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纯化优化: 梯度的优点
O O O N H N Me OM e
Cbz-Val-Weinreb Amide(A)
Rf A = 0.18
O
O
O N H N Me OMe
30% EtOAc in Heptane
Hexane/Isopropanol (IPA) 1:1 Hexane/Methyl tert-butyl ether (MTBE) 1:1 Water/Acetonitrile 1:1 Hexane/Ethyl acetate 1:1 Dichloromethane/Methanol 9:1
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Identifying Optimal Purification Conditions（方法选择原则）
现拖尾现象则采用6
► If your compound does not absorb in the UV
(nonchromophore sample), go to step 5 and work at 214 nm如果
1和2中没有紫外吸收，采用6选择波长214nm
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Mobile Phase Options
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卤素取代化合物的分离
O X
O
X = F, Br, Cl Fluoro-, Bromo- and Chlorochromones
4 g RediSep正相柱 洗脱溶剂: Hexane/EtOAc
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卤素取代化合物的分离
Fluorochromone Chloro- and Bromochromones
►碱性固定相
►无需流动相修饰剂 ►用于纯化有碱性特性的化合物
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RediSep 中性氧化铝
►用于纯化对酸敏感的化合物
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RediSep Amine column
Si
NH2
氨基基团连接在硅上，取代酸基团 ► 碱性固定相 ► 不需使用TEA ► 减少了由于酸/碱反应引起的副反应 ► 对于含有碱性组分的化合物有更好的分离效果 ► 既可用于正相，又可用于反相条件 ► 无需从组分中去除溶剂，减少了过程时间
不丢失目标物质
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利用薄层 Rf 进行梯度设定
Click on “Rf to Gradient” tab
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上样量问题
RediSep 12 g 柱的上样量
Sulfonamide standards Peak 1: Biphenyl Peak 2: Lidocaine Peak 3: Sulfamethoxozole Peak 4: Sulfathiazole
Cbz-Phe-Weinreb Amide(B)
Rf B = 0.10
Courtesy of Hoechst Marion Roussel
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等梯度分离
在12克柱分离后从每个收集管中取样分析
30% EtOAc in Heptane
3 Pure Fractions 3 Impure 4 Pure
25%
Normal phase silica gel反相硅胶 Normal phase silica gel正相硅胶 C-18 reversed phase反相C-18 Specialty column特殊柱 Specialty column特殊柱
Hexane/Ethyl acetate 1:1 Dichloromethane/Methanol 9:1
EtOAc Heptane
5 Pure Fractions
in
20% EtOAc in Heptane
11 Pure Fractions 1 Impure 5 Pure
11 Pure
RfA = 0.18, RfB = 0.098
RfA = 0.13, RfB = 0.08
RfA = 0.09, RfB = 0.026
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纯化优化
实例研究: 3种不同极性物质的 分离
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Isocratic 20% ethyl acetate in hexane
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Isocratic 30% ethyl acetate in hexane
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Isocratic 50% ethyl acetate in hexane
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Isocratic 70% ethyl acetate in hexane
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TLC Tells Us
►20% Ethyl Acetate: Top spot isolation
►30% Ethyl Acetate: Second spot isolation ►50% Ethyl Acetate: Bottom spot isolation
O X
O
X = F, Br, Cl Fluoro-, Bromo- and Chlorochromones
4.3 g RediSep C-18反相柱 洗脱溶剂: Water/Methanol
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其他介质
O OH OH
特殊介质
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RediSep 碱性氧化铝
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TLC
►TLC主要回答两个问题
■ ■
什么样的溶剂和固定相可以纯化该化合物？ 什么浓度的溶剂组合可以成功分离该化合 物?
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使用线性梯度洗脱
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梯度的好处
► 由于物质在最佳的极
性位置被洗脱，所以 峰形更尖 ► 提高了纯度 ► 提高的色谱柱上样量
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使用梯度的原则
►用TLC进行方法研究试验
►选择具有最佳选择性的溶剂系统 ►分离前无需知道确切的溶剂系统浓度 ►从尽可能低的浓度开始梯度洗脱以确保
►
修饰剂可能与化合物反应
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RediSep C-18 反相柱
► ► ► ► ► ►
用于纯化中等至高极性物质: 碳水化合物, 酸性化合物, 肽 类, 杂环化合物, 离子化合物 典型溶剂系统: Water/Acetonitrile, Water/Methanol 需要更长的平衡时间 流速比正相柱低 如果未变干而且保存在80%有机溶剂+20%水溶液中，可 重复使用 物质的分离是依靠不同的物质在固定相和流动相之间以 不同的分配系数（K）连续不断地形成分配平衡而实现的， 不随流动相的移动而移动。
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固定相选择
► 正相硅胶 ► C18反相硅胶 ► 氨基取代 ► 碱性氧化铝 ► 中性氧化铝 ► 酸性氧化铝 ► 氰基取代
► 双羟基（双醇）
► 强阴离子交换 (SAX) ► 强阳离子交换(SCX)
► Florisil®
硅酸镁
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RediSep 正相硅胶柱
► 微酸性介质 ► 活性基团 Si-OH
氢离子很容易解离 ■ 实际活性基团Si-O► 使用寿命较短，通常用于一次柱 ► 硅胶适用于分离低-中等极性化合物，而非极性 化合物在硅胶板上吸附较弱，分离较差 不同物质与固定相之间的吸附力不同；不同物质 在溶剂流动相中的溶解度不同
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分离纯化的目的和意义
1.分子结构研究
2.生物活性研究 3.作为衍生物合成合成的原料 4.直接应用：医药、农药、兽药、植物 生长活性物质、食品添加剂、化妆品、 化工原料等。
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有机化合物分离纯化的基本技术
萃取技术 液—液萃取技术 液—固萃取技术

结晶与重结晶技术 色谱技术 纸色谱 薄层色谱 柱色谱 蒸馏与精馏技术 普通蒸馏 减压蒸馏 精馏 干燥技术
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梯度程序对分离的影响
16 个 Pure Compounds
% of EtOAc in Heptane
200 mg 样品 12g 柱
Fra Baidu bibliotek
连续梯度
35 30 25 20 15 10 5 0 0 10 Time (min.) 20 30
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常用分离条件----固定相和流动相的选择
Suggested Method Development Process
Step Stationary phase固定相 Mobile phase流动相
1 2
3 4 5 6 7
Normal phase silica gel正相硅胶 Normal phase silica gel正相硅胶
Useful tactics:
► If step 1 and 2 don’t show any migration, go to step 5如果
采用方法1和2样品没有任何移动，则采用方法5
► If step 1 and 2 show streaking spots, go to step 6如果1和2出
Automated Flash Chromatography Applications Flash快速色谱在天然化学和有机合成的应用
Universal Technology 环球（香港）科技有限公司
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概 述
分离纯化的概念
► ► ►
分离：混合物或混合体→目的物 （单体或混合物） 纯化：目的物含量较高（＞90%） 的混合物→目的物单体或纯品 分离纯化：去除杂质，逐步获得提 高目的物 纯度或含量的过程
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TELEDYNE ISCO
Teledyne Isco 是全自动快速制备色谱技术 的开创者，在1997年引入CombiFlash生产 线，用于有机物提纯的全自动快速制备 色谱的研发与生产，Isco最先推出多样 品并行和顺序工作系统，在药物开发和 天然产物领域的分离工作取得了突出的 进展。
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各种制备型液相色谱：
►——快速色谱 （约2 bar /30 psi）
►——低压液相 （< 5 bar / 75 psi） ►——中压液相 ►——高压液相
（5~20 bar / 75~300 psi） （> 20 bar / 300 psi）
彼此压力范围会有交叠
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制备型液相色谱的关键因素
分辨率
填料 速度 载样量
对某一个参数进行优化会 影响其他分离参数：增加 洗脱液的流速会降低分辨 率。分辨率会因为上样量 过大而下降。色谱柱的载 样量又取决于柱子的直径、 长度，吸附剂的颗粒度及 装柱的紧密程度。
流动相选择
► Standard solvent systems标准溶剂系统:

EtOAc/hexane or heptane MeOH/DCM
► Consider alternative solvent systemse可选择的溶剂系统:

MTBE(甲基数丁基醚)/hexane – allows 214 nm detection IPA(异丙醇)/hexane – a “green” solvent system (suitable alternative to MeOH/DCM and fully compatible with silica gel up to 100% IPA)
■
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正相硅胶的不足
正相硅胶的酸性 pH可能会使酸性或碱性物质的分离困难 ► 要求对流动相进行修饰
►
■ ■
碱性物质用TEA 酸性物质用AcOH
从TLC到柱色谱重现性不好 ► 修饰引起额外的不便
►
■ ■
分离前必须先更换和冲填溶剂 分离后必须去除TEA 和AcOH
● 用适当的溶剂进行额外的抽提和洗涤 ● 将混合物浓缩至油状，放在真空中过夜
在10% 上样量时峰变宽和 保留时间延长十分明显
0.5% 上样量，即 0.06g
10% sample load 5% sample load 3.5% sample load 0.5% sample load
0 5 Minutes 10
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色谱柱上样量
色谱柱 尺寸 4g 12 g 40 g 80 g 120 g 330 g 分离容易的样品: 最高10% 上样量 400 mg 1.2 g 4.0 g 8.0 g 12 g 33 g 分离困难的样品: 低至 1% 上样量 40 mg 120 mg 400 mg 800 mg 1.2 g 3.3 g
►
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碱性化合物的分离
4 g Normal Phase RediSep Column
Solvents: Hexane/EtOAc
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碱性化合物的分离
4.7 g Amine RediSep Column Solvents: Hexane/EtOAc
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氨基取代介质
►溶剂 - Hexanes, Ethyl Acetate, Methylene