仪器分析 高效液相色谱法

第17章HPLC法

17.1 内容提要

17.1.1 基本概念

高效液相色谱法──在经典液相色谱法的基础上，引入了气相色谱(GC)的理论，在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器，使之发展成为高分离速率、高分离效率、高检测灵敏度的高效液相色谱法，易称为现代液相色谱法。

高效液相色谱仪──采用了高压输液泵、高效固定相和高灵敏度检测器等装置的液相色谱仪称为高效液相色谱仪。

梯度洗脱──用两种(或多种)不同极性的溶剂，在分离过程中按一定程序连续的改变流动相的浓度、配比和极性，使样品中各组分能在最佳的分配比下出峰的操作技术。也称为梯度淋洗。

低压梯度──又称外梯度，特点是先混合后加压。它是采用在常压下预先按一定的程序将溶剂混合后再用泵输入色谱柱系统，易称为泵前混合。

高压梯度──又称内梯度，特点是先加压后混合。它有两台高压输液泵、梯度程序器(或计算机及接口板控制)、混合器等部件组成。两台泵分别将两种极性不同的溶剂输入混合器，经充分混合后进入色谱柱系统，是一种泵后高压混合形式。

柱外效应──由色谱柱以外的因素引起的色谱峰形扩展的效应。柱外因素常指从进样口到检测器之间，除色谱柱以外的所有死时间，如进样器、连接管、检测器等的死体积，都会导致色谱峰形加宽、柱效下降。

液固吸附色谱法──以固体吸附剂为固定相，吸附剂表面的活性中心具有吸附能力，样品分子被流动相带入柱内，它将与流动相溶剂分子在吸附剂表面发生竞争吸附性。K值大的强极性组分易被吸附，K值小的弱极性组分难被吸附，样品组分因此被分离。

液液分配色谱法──根据物质在两种互不相溶(或部分互溶)的液体中溶解度的不同，有不同的分配，从而实现分离的方法。分配系数较大的组分保留值也较大。

正相分配色谱法──流动相极性低而固定相极性高的称为正相分配色谱法。

反相分配色谱法──流动相极性高而固定相极性低的称为反相分配色谱法。

化学键合相──利用化学反应将有机分子键合到载体表面上，形成均一、牢固的单分子薄层而形成的各种性能的固定相。

化学键合相色谱法──采用化学键合固定相的液相色谱方法。它分为正相和反相键合相色谱法。

离子交换色谱法──以离子交换树脂为固定相，水溶液为流动相，利用待测样品中各组分离子与离子交换树脂的亲和力的不同而进行分离分析的液相色谱分析法。

凝胶色谱法──以多孔性凝胶类物质为固定相，以水溶液或有机溶剂为流动相，根据不同组分分子体积的大小进行分离分析的液相色谱分析法。也称为尺寸排阻色谱法。

17.1.2 基本内容

1. 高效液相色谱仪的组成

不论何种类型高效液相色谱仪，基本上分为四个部分：高压输液系统、进样系统、分离系统和检测系统。

(1)输液系统包括贮液罐、高压输液泵、梯度洗脱装置等。

(2)进样系统是将待分析样品引入色谱柱的装置，包括取样、进样两个功能。

(3)分离系统主要是指担负分离作用的色谱柱，它是色谱仪的心脏。对色谱柱的要求是柱效高、选择性好、分析速度快等。

(4)检测系统中的检测器可分为通用型检测器(对样品和洗脱液总的物理化学性质有响应)和选择型检测器(仅对待分离组分的物理化学性质有响应)。

2.高效液相色谱法的特点

分离效能高、选择性高、检测灵敏度高、分析速度快、应用范围广。

3.高效液相色谱法几种分离模式的分离原理及其应用

高效液相色谱法按组分在两相间分离机理的不同主要可分为：液固吸附色谱法，液液分配色谱法，化学键合相色谱法，离子交换色谱法和凝胶色谱法(体积排阻色谱法)。各类型的分离原理以及应用如下：

4.高效液相色谱法的应用和局限性

HPLC具有高压、高速率、高效率、高灵敏度等特点，广泛应用于卫生检验、环境保护、生命科学、农业、林业、水产科学和石油化工等领域，尤其适用于分离、分析不易挥发，热稳定性差的各种离子型化合

物。例如，分离分析氨基酸、蛋白质、维生素、生物碱、糖类、农药等，在几百万种化合物中，可分离分析约80%的有机化合物。而其余20%的有机化合物，包括永久性气体，易挥发低沸点及中等相对分子质量的化合物，只能用气相色谱法进行分析。其局限性主要体现在：HPLC使用多种溶剂作流动相成本高，易于引起环境污染；缺少GC中使用的通用型检测器等。

5.高效液相色谱常用的检测器

(1)紫外吸收检测器其最重要的特征是对流动相的脉冲和温度变

化不敏感，可用于梯度洗脱；主要缺点是对无紫外吸收的组分不响应，而对紫外吸收较大的溶剂如苯不能作流动相使用。

(2)光电二极管阵列检测器可获得组分的三维图谱，以获得更多信息。

(3)示差折光检测器属于通用型检测器，应用较多，主要缺点是对温度变化特别敏感，且不适于梯度洗脱。

(4)荧光检测器属于高灵敏度、高选择性检测器，仅对具有荧光特性的物质有响应，对流动相脉冲不敏感，常用于梯度洗脱。

6.高效液相色谱固定相

液-固色谱固定相：可分为极性和非极性两大类。极性吸附剂为各种无机氧化物，如：硅胶、氧化铝等；非极性吸附剂最常见的是活性炭。

不同类型的有机化合物，在极性吸附剂上的保留顺序如下：

氟碳化合物＜饱和烃＜烯烃＜芳烃＜有机卤化物＜醚＜硝基化合物＜腈＜酯、酮、醛＜羟酸。

液-液色谱固定相：由两部分组成，一部分是作为载体的惰性颗粒，另一部分是涂在载体表面上的固定液。常用'

,ββ-氧二丙腈、聚乙二醇、角鲨烷等。液-液色谱固定相不适合梯度洗脱。

化学键和固定相：常用非极性键合相有十八烷基键合相(ODS)、极性键合相有氨基键合相(强极性)、氰基键合相(中强极性)。

化学键合相的优点：使用过程不流失；化学性能稳定，在pH2～8

的溶液中不变质；热稳定性好，一般在70℃以下稳定；载样量大；适合梯度洗脱。

7.高效液相色谱流动相