中和试验

中和试验

中和试验是病毒或毒素与相应的抗体结合后，失去对易感动物的致病力的试验方法。

所属分类：免疫学

概述

动物受到病毒感染后，体内产生特异性中和抗体，并与相应的病毒粒子呈现特异性结合，因而阻止病毒对敏感细胞的吸附，或抑制其侵入，使病毒失去感染能力。Y3r3X。

中和试验(Neutralization Test)是以测定病毒的感染力为基础，以比较病毒受免疫血清中和后的残存感染力为依据，来判定免疫血清中和病毒的能力。GMlpm。

两种试验方法介绍

中和试验常用的有两种方法：一种是固定病毒量与等量系列倍比稀释的血清混合，另一种是固定血清用量与等量系列对数稀释(即十倍递次稀释)的病毒混合。XNI6d。

(一) 定血清－稀释病毒法(病毒中和试验)

1.病毒毒价的测定毒价单位：衡量病毒毒价(毒力)的单位过去多用最小致死量(MLD)，即经规定的途

径，以不同的剂量接种试验动物，在一定时间内能致全组试验动物死亡的最小剂量。但由于剂量的递增与死亡率递增不呈线性关系，在越接近100%死亡时，对剂量的递增越不敏感。而一般在死亡率越接近50%时，对剂量的变化越敏感，故现多改用半数致死量(LD50)作为毒价测定单位，即经规定的途径，以不同的剂量接种试验动物，在一定时间内能致半数试验动物死亡的剂量。用鸡胚测定时，毒价单位为鸡胚半数致死量(ELD50)或鸡胚半数感染量(EID50)。用细胞培养测定时，用组织细胞半数感染量(TCID50)。在测定疫苗的免疫性能时，则用半数免疫量(IMD50)或半数保护量(PD50)。shW6H。

(1) LD50的测定(以流行性乙型脑炎病毒为例)。

测定方法：将接种病毒，并已发病濒死的小鼠，无菌法取脑组织，称重、加稀释液充分研磨，配制成10-1悬液，3 000r/min离心20分钟，取上清液，以10倍递次稀释成10、10、10……10，每个稀释度分别接种5只小鼠，每只脑内注射0.03ml，逐日观察记录各组的死亡数。9ntgQ。

LD50的对数=高于50%病毒稀释度的对数+距离比例×稀释系数的对数

本例高于50%病毒稀释度的对数－6，距离比例为0.5，称释系数的对数为－1。代入上式：

LgLD=-6+0.5×(－1)=－6.5

则LD50=10，0.03ml，即该病毒作10稀释，接种0.03ml能使半数小鼠发生死亡。

注意：稀释血清法中和试验，计算TCID50或LD50，MID50时，计算公式应改为：TCID50的对数=高于50%血清稀释度的对数－距离比例×稀释系数的对数。qe4jz。

如按Karber氏法计算，其公式为：

IgLD50（或TCID50）=L+d(S－0.5)

L为病毒最低稀释度的对数，d为组距，即稀释系数，S为死亡比值的和。本例L=－4，d=－1，

S=1+1+5/6+1/6=35E5PZ。

IgLD50=－4+(－1)×(3－0.5)

=－6.5

则LD50=10，0.03ml

注意：用本法计算稀释血清中和试验中和效价时，S应为保护比值之和。

(2)EID50的测定（以新城疫病毒为例）将新鲜病毒液体10倍递次稀释法释成10-1、10-2、

10-3……10-9不同稀释度，分别接种9-10日龄鸡胚尿囊腔，鸡胚必须来自健康母鸡，并且没有新城疫抗体。每只鸡胚接种0.2ml，每个稀释度接种6只鸡胚为一组，以石蜡封口，置37-38℃培养，每天照蛋，24h之内死亡的鸡胚弃掉，24h之后死亡的鸡胚置4℃保存。连续培养5天，取尿囊液作血球凝集试验，出现血凝者判阳性，记录结果，按上述方法计算EID50。lqiJq。

(3) TCID50的测定（以致细胞病变病毒为例）取新鲜病毒悬液，以10倍递次稀释成不同稀释度，每个稀释度分别接种经Hank’s液洗3次的组织细胞管，每管细胞接种0.2ml，每个稀释度接种4只细胞管，接种病毒后的细胞管放在细胞盘内，细胞层一侧在下，使病毒与细胞充分接触，放置37℃吸附1h，加入维持液，置37℃培养，逐日观察并记录细胞病毒管数，按上述方法计算TCID50。pwIAu。

2.中和试验

(1) 病毒稀释度的选择选择病毒稀释度范围，要根据毒价测定的结果而定，如病毒的毒价为10，则试验组选用10－10对照组选用10－10其原则是：最高稀释度要求动物全存活（或无细胞病变），最低稀释度动物全死亡（或均出现细胞病变）。Xmt8n。

(2)血清处理用于试验的所有血清在用前须作56℃30min加温灭活。但来自不同动物的血清，灭活的温度和时间也是不同的。bfmwi。

(3)病毒的稀释按选定的病毒稀释度范围，将病毒液作10倍递次稀释，使之成为所需要的稀释度。

(4）感作将不同稀释度病毒分别定量加入两排无菌试管内，第一排每管加入与病毒等量的免疫（或被检）血清作为试验组；第二排每管加入与免疫（或被检）血清同种的正常阴性血清作为对照组；充分摇匀后放37℃感作12h。sPy50。

(5) 接种按“病毒价测定”中所述接种方法接种试验动物（或鸡胚、组织细胞）。观察持续时间，根据病毒和接种途径而定。zKCuZ。

(6)中和指数据计算物按Reed和Muench两氏法（或Karber）法分别计算试验组和对照组的LD50（或EID50、TCID50）P5EPK。

试验级LD50(EID50、TCID50)

中和指数= ──────────────────

对照组LD50(EID50、TCID50)

假如试验组LD50为10，对照组LD50为10。则中和指数为10，10=1 995，也就是说该待检血清中和病毒的能力比正常血清大1995倍。cW5ob。

(7)结果判定固定血清―稀释病毒法进行中和试验，当中和指数大于50，表示补检血清中有中和抗体；中和指数在10-50为可疑；若中和指数小于10为无中和抗体存在。(二) 固定病毒-稀释血清法（血清中和试验）XQUCD。

1.病毒毒价的测定（微量法）

(1) 病毒的制备将病毒接种于单层细胞，37℃吸附1h后加入维持液，置温箱培养；逐日观察，待细胞病变（CPE）达75%以上，收获病毒悬液冻融或超声波处理，以3 000r/min离心10min，取上清液，定量分装成1ml小瓶置-70℃保存备用，选用的病毒必须是对细胞有较稳定的致病力。H7mBt。

(2) 病毒毒价测定取置-70℃冰箱保存的病毒一瓶，将病毒在96孔培养板上作10倍递进稀释即10，10，10……，每孔病毒悬液量为50μl，每个稀释度作8孔，每孔加入100细胞悬液，每块板的最后一行设8孔细胞对照，制备细胞悬液的浓度以使细胞在24h内长满单层为度。把培养板置5%CO2温箱37℃培养，从48-14h逐日观察细胞病变，记录结果。818pf。

按Reed和Muench两氏法计算TCID50。

56%-50%

距离比例= ────────

56%-33%

本例高于50%病毒稀释度的对数为－6，距离比例为0.26，稀释系数的对数为－1。