实验1大肠杆菌的培养和分离 浙科版选修一

以进行倒平板了。
2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？ 答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物 污染培养基。
3. 进行恒温培养时，为什么要将平板倒置？
答：恒温培养时，培养基的水分会以水蒸气的
形式蒸发，倒放培养皿会是水蒸气凝结成水滴留
在盖上；如果正放培养皿，则水分形成的水滴回
落到培养基的表面并且散开。如果培养皿已形成
2.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再
进行划线？ 答：以免接种环温度太高，杀死菌种。 3.在作第二次以及其后的划线操作时，为什 么总是从上一次划线的末端开始划线？ 答：划线后，线条末端细菌的数目比线条起始 处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使
细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，
最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。
一、无菌技术
1.无菌技术的概念
无菌操作泛指在培养微生物的操作中，所 有防止杂菌污染的方法。
1）无菌操作：各种器皿必需是无菌的
各种培养基必需是无菌的
接种时不能带入其他杂菌
2.消毒与灭菌的概念及两者的区别 （１）消毒： 指使用较为温和的物理或化学方法仅杀死物 体表面或内部一部分对人体有害的微生物。（不 包括芽孢和孢子）
微生物(microorganism)


结构简单、形体微小的单细胞、多细胞或没有 细胞结构的低等生物。 例：酵母、霉菌、细菌、放线菌、病毒和小型 原生动物等等
微生物的利用： 抗生素；酒；腐乳；污水治理……
历史小资料
19世纪中期，关系到法国经济命脉的酿造 业曾一度遭受毁灭性的打击。在生产过程中， 出现了葡萄酒变酸、变味的怪事。经过一番研 究，法国科学家巴斯德发现，导致生产失败的 根源在于发酵物中混入了杂菌。
4、氯气消毒水源
5、紫外线消毒：如接种室空气
……
(4)常用灭菌的方法：
1、灼烧灭菌 2、干热灭菌：160-170 ℃ 下加热1-2h。
3、高压蒸汽灭菌：100kPa、 121 ℃下维持15-30min.
4、不能加热灭菌的化合物，如尿 素（加热会分解）：G6玻璃砂漏 斗过滤（G6孔径最小，细菌不能 滤过）
微生物的分离技术： 划线分离法 涂布分离法
划线分离法
一旦划破，会造成划线不均匀，难 以达到分离单菌落的目的； 二是存留在划破处的单个细胞无法 形成规矩的菌落，菌落会沿着划破 处生长，会形成一个条状的菌落。
1.为什么在操作的第一步以及每次划线之
前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然 需要灼烧接种环吗？为什么？
准备阶段
LB培养基（用于培养细菌）
1．称量 2．溶化 3．调pH： pH7．6 4．过滤：这一步可以省去。 5．分装：分装过程中注意不要使培养基沾在管口或瓶口上，以 免沾污棉塞而引起污染。分装三角烧瓶的量以不超过三角烧瓶 容积的一半为宜。 6．加塞、加封口膜 7．包扎 8．灭菌 9．倒平板 10．无菌检查：将灭菌的培养基放入37℃的温室中培养24—48 小时，以检查灭菌是否彻底。
菌种的保存
1、临时保藏： 接种到固体斜面培 养基，菌落长成后 置于4℃冰箱保存。 2、长期保存： 甘油冷冻管藏法
有些细菌在一定的条件下， 细胞里面形成一个椭圆形 的休眠体，叫做芽孢。芽 孢的壁很厚，对干旱、低 温、高温等恶劣的环境有 很强的抵抗力。
（2）灭菌：
以物理或化学方法消灭所有微生物，包括所有 细菌的繁殖体，芽孢等，而达到完全无菌的过程。
(3)消毒的方法
1、100℃煮沸5-6min 2、巴氏消毒法: 70-75 ℃下煮30min或 80 ℃ 下煮15min。适用于如牛奶、啤酒、果酒、酱 油等不宜进行高温灭菌的液体 3、用75%酒精、新洁尔灭等进行皮肤消毒
答：操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能 存在的微生物污染培养物； 每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后， 接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌 种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增
加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。
划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残 留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。
涂布分离法
涂布分离法
涂布分离法
3. 进行恒温培养时，为什么要将平板倒置？
答：恒温培养时，培养基中的水分会以水蒸 气的形式蒸发，如果正放培养皿，则水分形成的 水滴会落如培养基表面且扩散开。若培养基中一 行成菌落，则菌落中的菌会随水扩散开，菌落间 相互影响，很难再分离成单菌落，答不到分离目 的。 因此，倒置培养皿可以防止皿盖上的水珠 落入培养基，造成污染。
1.请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如 果需要，请选择合适的方法。 （1） 培养细菌用的培养基与培养皿 （2） 玻棒、试管、烧瓶和吸管 （3） 实验操作者的双手
答：（1）、（2）需要灭菌；（3）需要消毒。
无菌技术操作要点
1、实验操作空间,操作者的衣着和手 —— 清洁和消毒
2、微生物培养的器皿用具和培养基等 ——灭菌
菌落：单个细菌细胞在固体培养基上培养10--20 小时后，会繁殖成许多个细菌细胞。这些细胞 紧紧聚集在一起，形成菌落。
每一个细菌产生一个菌落。
将待分离样品进行一定的稀释，并使微 生物的细胞尽量以分散状态存在，然后使其长 成一个个纯种单菌落。
大肠肝菌的分离
微生物的接种技术：
将一种微生物移接到另一灭菌培养基上的过程。 例如：将液体培养基中的大肠杆菌接种到固体培养基上， 以便于进行分离。
3、为避免周围环境中的微生物的污染，实验操作应在
酒精灯火焰附近 进行。 4、实验操作时，应避免已经灭菌处理的材料用具与周 围的物品相接触。 ……
微生物实验室培养的基本操作程序
培养基配制
准备 阶段
器具和培养基灭菌
倒平板 微生物接种（斜面→液体）
培养 阶段
恒温箱中培养 分离纯化（液体→ 平板划线）
培养，菌种的保存（斜面）
固体培养基的配制：每50ml 液体培养基添加1g 琼脂
琼脂？
凝固剂
红藻中提取的多糖,在98 ℃以上熔化，44 ℃以 下凝固，常温下凝结成有弹性的凝胶。
培养基种类
培养基（培养液）是由人工方法配制 而成的，专供微生物生长繁殖使用的混 合营养液。
1.培养基的类型 （1）按物理状态分：固体培养基和液体培养 基、半固体培养基。 （2）按功能分：选择培养基和鉴别培养基。 （3）按成分分：天然培养基和合成培养基。
菌落，则菌落中的菌会随水扩散，菌落相互影响， 很难再分成单菌落，达不到分离的目的。因此， 恒温培养时，培养皿必须倒置。
小结
1 什么是微生物？有哪些应用？ 2 培养基的基本营养成分及其配制方法 3 无菌技术：消毒和灭菌（高压蒸汽灭菌法）
4 微生物培养的基本程序（倒平板技术）
微生物在自然界中呈混杂状态存在，要获 得所需菌种，必须从中进行分离。在保藏菌种 时不慎污染时也需予以分离。 怎样纯化分离我们需要的大肠杆菌呢？ 怎样确保大规模培养繁殖起来的细菌是一个 纯种群体呢？
保持培养物纯净， 保证无杂菌污染很 重要！
大肠杆菌的培养与分离
一、大肠杆菌（E. coli）
兼性厌氧的肠道内的共生菌群
合成维生素B和维生素K，供机体利用； 产生大肠杆菌素，抑制肠道致病菌和 腐生菌滋生。
革兰氏阴性菌
作为一种工程菌，
在基因工程技术中被广泛采用。
例：大规模生产治疗糖尿病的药物——胰岛素
固体培养基：菌落
液体培养基：
表面生长
均匀混浊生长
沉淀生长
பைடு நூலகம்
半固体培养基：
无动力
有动力(弥散)
4.培养基的用途 液体培养基：增菌、工业生产 固体培养基：纯化（分离），鉴定、活菌计数、 保藏菌种 半固体培养基：动力检测
培养基的分类
物理性质
液体培养基 半固体培养基 固体培养基
选择培养基（抑制不需要的微生物生长） 酵母菌、霉菌——青霉素 培养基用途 金黄色葡萄球菌——高浓度食盐 鉴别培养基 大肠杆菌——伊红-美蓝培养基
培养基（culture media）
按照微生物对营养物质的不同需求，配制出的 供其生长繁殖的营养基质。 提供微生物生长的条件：
合适的温度：25-37℃ 合适的pH：细菌 6.5-7.5 中性偏碱 真菌 5.0-6.0 中性偏酸 营养成分：含有碳源、氮源、生长因子、水和无 机盐。
LB培养基的配方
培养基成分 蛋白胨 酵母提取物 NaCl H2O 各成分的量 0.5g 0.25g 0.5g 加至50ml
称量
酵母提取物
蛋白胨
NaCl
液体LB培养基的配方
培养基成分 蛋白胨 酵母提取物 NaCl
H2O
各成分的量 0.5g 0.25g 0.5g
加至50ml
固体LB培养基 每100ml 液体LB培养基中加入2g琼脂，摇匀，灭菌。
灭菌
培养皿壁上 不能沾有培 养皿，否则 容易污染。
1.培养基灭菌后，需要冷却到50 ℃左右时， 才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的 温度？ 答：可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶， 感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可