结核病血清学诊断进展

结核病血清学诊断进展结核病的细菌学检查目前是结核病实验室诊断的金标准。

由于痰涂片阳性率较低，镜检需要经验，难以区分环境分枝杆菌造成的假阳性；痰培养需时太长，因此细菌学检查对结核病的诊断价值有限。

随着分子生物学技术的迅速发展，用高度敏感的方法检测结核菌及其特异性DNA 片段，如PCR、生物探针和基因芯片等，需要相应的检测设备和检测费用高未能广泛推广。

血清学诊断技术有其固有的优势，如操作简便、快速、便于推广、无需特殊精密仪器，已有多种纯化的特异性抗原可采用，可以发展成自动化检测，尤其是对痰培养阴性和肺外结核病有较为重要的辅助诊断价值，受到广泛的重视。

本文从靶抗原的选择和检测技术的改进等方面综述了结核病血清学诊断的现状和进展。

抗原的选择特异性的抗原是提高血清学检测敏感性、特异性的重要环节。

应用于血清学诊断的理想抗原应具有种的特异性及强的免疫原性。

尤其是结核分枝杆菌全基因组序列测定以后，单克隆抗体、分子生物学、蛋白质组学和比较基因组学等技术的应用，已获得多种纯化和特异性的诊断抗原。

现将当前最受关注的抗原及其临床评估结果归纳如下：1.脂阿拉伯甘露聚糖(LAM)抗原 脂阿拉伯甘露聚糖是分枝杆菌细胞壁的重要组成部分，是属特异性抗原，具有较强的免疫原性和免疫调节功能，可刺激机体产生相应的抗体，因而是结核病的血清学诊断应用较广的抗原。

有关LAM抗原的应用报道很多, Antunes等用美国生产的结明(MycoDot TM)试剂盒检测活动性肺结核病人的敏感性为63.0%，特异性为92.4%，认为检测LAM抗体是结核病一项有效的辅助诊断方法。

2.A60(antigen 60) A60是从牛分枝杆菌胞浆中提取的一种大分子物质，是脂质蛋白和多糖的复合抗原。

Wu等用ELISA法检测了178例活动性肺结核患者和151例其他疾病患者血清中的IgG A60，根据受试者工作特性曲线(ROC)取261.2单位为截切值(cutoff point)，其敏感性和特异性分别为49.4%和79.5%，认为胸部X片异常的患者结合IgG A60阳性将有助于肺结核病的准确临床诊断。

3.结核菌糖脂(TBGL)抗原 结核菌糖脂抗原是分枝杆菌细胞壁上的糖脂类物质，具有菌属特异性。

近年来的研究表明，糖脂类抗原在诊断方面有很大的优势。

Maekura等建立了糖脂类抗原抗体快速检测方法，并做了临床评价，对痰涂片阴性的活动性肺结核的灵敏度为56.8％，对痰培养阴性的活动性肺结核的灵敏度为51.2％。

将TBGL与核酸扩增方法(NAA)联合用于检测，检出率比两者单独使用时进一步提高。

Tiwari等用脂质体颗粒作为载体，利用纯化的TBGL抗原特异的与结核病患者血清中的TBGL抗体结合，形成蓝色凝集颗粒来诊断活动性结核病，其敏感性、特异性分别达94%和98.3%。

该方法快速(4min)、经济，且可以区别活动性肺结核、卡介苗(BCG)免疫接种者与健康人群，可用于人群大规模筛选肺结核病人。

4.38kDa蛋白 38kDa蛋白是一定位在质膜上的磷酸盐转运蛋白，只在分枝杆菌复合体中表达，BCG合成38kDa蛋白的量仅为结核分枝杆菌的十分之一。

38kDa 蛋白为一分泌蛋白，可刺激T细胞和B细胞免疫反应，广泛应用于结核病的血清学试验。

英国公司生产的OMEGA结核抗体定量检测Myco G、A、M试剂盒联合应用38kDa和脂多糖(LPS)抗原，而TB Complex Plus 试剂盒选用的是38kDa和16kDa抗原。

Butt等对OMEGA试剂盒进行了评价，认为具有种特异性的TB Complex Plus和有属特异性的Myco M联合应用可取得最好的效果，检测肺结核的敏感性和特异性分别为87%和93%。

38kDa对活动性肺结核的诊断非常有效，但和大肠埃希菌同源蛋白有 30%以上的交叉，所以对不同人群的灵敏度波动较大，尤其对涂片阴性和合并HIV感染的结核病患者效果较差。

5.Ag85 抗原85复合体(Ag85)是一组具有较强细胞免疫及体液免疫活性的分枝杆菌分泌性蛋白，分子量约为30～32kDa。

分枝杆菌各菌株均可分泌Ag85。

结核分枝杆菌Ag85中至少包括三种蛋白成分—Ag85A、Ag85B 和Ag85C，其中有免疫作用的主要为Ag85A和Ag85B。

Ag85具有分枝菌酸转移酶的活性，在分枝杆菌细胞壁合成的最后阶段发挥必要的作用。

它还能和人纤连蛋白(FN)相结合，有助于结核菌入侵宿主细胞。

Ag85可能发展成为结核病的血清学诊断抗原。

活动性结核病人血清中的Ag85抗体平均水平比其他分枝杆菌疾病患者和健康对照者高50～150倍，可通过检测血循环中Ag85抗体，对活动性结核加以诊断。

Kashyap等用间接ELISA法检测89%疑似结核性脑膜炎患者脑脊液中存在Ag85抗体，认为检测Ag85抗体为结核性脑膜炎的早期和确定性诊断提供了一个更灵敏的选择。

6.ESAT-6和CFP10 ESAT-6即6kDa早期分泌性抗原靶，是从结核分枝杆菌短期培养滤液中分离纯化出的一种低分子量分泌性蛋白，具有较强的细胞免疫活性，在抗结核感染的免疫回忆应答中起重要作用。

ESAT-6仅存在于致病性分枝杆菌中，包括人型结核杆菌、牛型结核杆菌、非洲分枝杆菌以及苏尔加分枝杆菌、海水分枝杆菌和堪萨斯分枝杆菌等非典型分枝杆菌，而BCG及其他非致病性分枝杆菌缺失。

CFP-10即培养滤液蛋白10，与ESAT-6位于同一基因簇上，两者分布相同，都是RDl区编码的。

ESAT-6和CFP10能刺激机体产生特异性IgG，利用ESAT-6和CFP10蛋白抗原能与结核分枝杆菌感染者血中特异性 IgG结合的特点，采用ELISA等方法可特异性区分是真正的结核分枝杆菌感染或是接种BCG后所致敏，该方法明显优于PPD作包被抗原的ELISA法。

陈全等以CFP10-ESAT-6融合蛋白为抗原，用ELISA法检测豚鼠血清中抗结核分枝杆菌抗体，11份H37Rv感染豚鼠血清全部呈阳性反应，11 份BCG免疫豚鼠血清仅1份呈阳性反应。

7.U1蛋白 Mukherjee等收集结核分枝杆菌H37Rv株静脉感染C57BL/6小鼠早期(10～14d) 尿液分离到一种结核抗原，氨基酸测序鉴定后，克隆并表达相应的基因，纯化得到可溶的重组蛋白命名为U1蛋白(Urine Protein 1)，分子量大约为16.8kDa。

进一步用ELISA法检测肺结核病人血清中U1抗体的敏感性为60%，检测合并HIV感染的结核病患者其敏感性为 87%，而正常人血清不与U1蛋白反应。

将U1蛋白与Mtb81联合用于检测合并HIV感染的结核病患者的敏感性为93.6%。

同时检测了12名HIV感染的非结核病人，其中9名患者血清中无可检测的U1抗体，另外3名U1抗体的水平处于ELISA法检测的临界点。

因此认为，检测U1抗体可增加结核病血清学诊断的敏感性，尤其对合并HIV感染的结核病患者。

8.其它抗原 Weldingh等在大肠埃希菌中克隆表达了4种超抗原—TB9.7、TB15.3、TB16.3和TB51，并用它们来检测痰涂片阳性和涂片阴性的结核病人，灵敏度为36%～93%，而特异性超过97%，其中TB16.3最为有效，TB16.3与TB9.7联合检测合并HIV感染的结核病患者其敏感性超过85%。

Bahk等基因重组表达Rv3369和Rv3874两个基因，并用它们做抗原检测结核病患者的敏感性分别为60%、74%, 特异性分别为96%、97%，表明是有价值的结核病血清学诊断抗原。

其它抗原，如MPT64、P90、TB4等，也曾被做为快速血清学检测的侯选抗原加以研究，但大都未达到诊断灵敏度的要求。

血清学诊断技术的发展在结核病血清学诊断过程中发现单一抗原无法产生令人满意的诊断结果，多克隆抗原“鸡尾酒”的应用，有助于血清学诊断特异性和敏感性的提高。

ELISA方法简便易行，快速又无需特殊精密仪器，在结核病血清学诊断方面研究最多，应用最广并在技术上进行了多方面的改进。

另外，免疫印迹技术、蛋白芯片技术等检测血清抗体方法，为结核病的诊断提供了有价值的手段。

1.联合应用结核抗原 将结核特异性的抗原联合或者几种特异蛋白融合成多聚蛋白复合物用于检测能提高诊断能力，不影响诊断特异性，而比单一抗原法具有更高的敏感性。

Okuda等回顾性地分析了三种结核病血清学诊断抗原TBGL、LAM、A60在活动性肺结核中的应用，其敏感性分别为70.1%、67.5%、70.9%，特异性分别为92.5%、97.5%、95.0%。

三种抗原联合检测其敏感性提高到91.5%，特异性降为87.5%。

Houghton等报道用病人的血清从结核分枝杆菌基因组表达文库中鉴定出Mtbll(即CFP-10)、Mtb8、Mtb48和DPEP(富含脯氨酸的蛋白)，并得到各自的重组蛋白。

将 Mtbl1、Mtb8与38kDa蛋白的编码基因重组构建经大肠埃希菌表达为多表位的蛋白聚合体TbF10，在此基础上，又加入Mtb48构建成蛋白聚合体TbF6，两者用于诊断，比单一抗原法的灵敏度都有所提高，再加入DPEP则能显著提高检测的灵敏度。

多抗原“鸡尾酒”诊断方法有利于节约生产和检测成本，如进一步优化抗原组合，可以在发展中国家推广使用。

2.循环免疫复合物(CIC)测定 特异性循环免疫复合物的检测是结核病血清学诊断中的另一重要领域。

活动性结核病人特异性IgG类免疫复合物明显增加，并随病情的好转而下降，故检测血清、脑脊液、胸腹水中的结核特异性免疫复合物对活动性结核的诊断也有重要的意义。

部分活动性肺结核病人痰菌检查阳性，而血清结核抗体测定为阴性，其原因之一就是形成CIC所致。

因此，众多的研究者认为检测结核病人CIC含量有助于结核病的辅助诊断。

检测CIC最简便的方法为酶标法。

CIC-ELISA特异性比痰涂片要高，尤其对不易得到痰标本的儿童结核和肺外结核效果较好。

3.免疫印迹技术 免疫印迹技术是高分辨的SDS-PAGE技术与高敏感性的酶联反应技术的结合产物。

目前，该技术已被转化成产品，操作者只要通过后半步骤的酶联免疫反应，即可检出待检标本中所含的多种结核分枝杆菌多肽抗原成分的特异性抗体。

北京生产的TB-40结核抗体免疫印迹法检测试剂盒选取的抗原来自于结核分枝杆菌全菌，并筛选出最具免疫原性及特异性高的蛋白成份做为诊断抗原，大幅度提高了诊断准确性，并可做为结核病诊断的确证实验。

用于检测痰菌阳性结核患者、痰菌阴性结核患者、肺外结核病的敏感性分别为93%、86%、89%，特异性超过95%。

4.酶联免疫斑点(ELISpot)技术 ELISpot技术是检测细胞分泌细胞因子的一种实验方法，采用可定量的夹心ELISA方法，通过ELISpot酶联斑点分析系统对加底物后形成的斑点分析后得出结果。