食品微生物学检验 志贺氏菌检验作业指导书

食品微生物学检验志贺氏菌检验

1、范围

适用于食品中志贺氏菌的检验

2、设备和材料

2.1恒温培养箱：36℃±1℃

2.2冰箱：2℃—5℃

2.3厌氧培养装置：41.5℃±1℃

2.4电子天平；

2.5显微镜

2.6均质器；

2.7无菌吸管；

2.8无菌均质杯；

2.9无菌培养皿，直径90mm；

2.10生化鉴定试剂盒；

2.11比浊管及比浊管架；

3、培养基和试剂

3.1志贺氏菌增菌肉汤-新生霉素

3.2麦康凯琼脂（MAC）

3.3木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂（XLD）

3.4志贺氏菌显色培养基

3.5三糖铁琼脂

3.6营养琼脂平面

4、操作步骤

4.1增菌

以无菌操作取检样25g（mL），加入装有灭菌225mL志贺氏菌增菌肉汤的均质杯，用旋转刀片均质器以8000r/min~10000r/min均质，于41.5℃±1℃厌氧培养16h~20h。

4.2分离

取增菌后的志贺氏菌液分别划线接种于XLD琼脂平板和MAC琼脂平板或志贺氏菌显色培养基平板上，于36℃±1℃培养20h~24h，观察各个平板上生长的菌落形态，若出现的菌落不典型或菌落较小不易观察，则继续培养至48h进行观察。志贺氏菌在不同选择性琼脂平板上的菌落特征见表1.

表1 志贺氏菌在不同选择性琼脂平板上的菌落特征

4.3 初步生化试验

(1)自选择性琼脂平板上分别挑取2个以上典型或可疑菌落，分别接种TSI.半固体和营养琼脂斜面各一管。置36℃±1℃培养20h～24h，分别观察结果。

(2)凡是三糖铁琼脂中斜面产碱，底层产酸（发酵葡萄糖，不发酵乳糖，蔗糖）.不产气（福氏志贺氏菌6型可产生少量气体），不产硫化氢，半固体管中无动力的菌株，挑取其5.3.1中已培养的琼脂斜面上长的菌落，进行生化试验和血清学分型。

5、生化试验

(1)生化试验（生化鉴定试剂盒）

a.菌悬液的制备

取一支盛有2ml无菌水的试管；用接种针挑取可疑菌落至无菌水中；仔细研磨，与标准浊度管比较，制成0.5个麦氏浊度的均匀菌悬液。

b.接种与培养

用产品中提供的一次性吸管吸取菌悬液依次滴入瓶中（三糖铁需穿刺划线接种，半固体和葡萄糖铵需穿刺接种），每瓶3滴；如特殊说明，培养温度均为36℃±1℃（无需加盖）。

C.结果判定如下：

注：1.“K”：产碱，培养基变为紫红色；“A”产酸，培养基变为黄色。

2.三糖铁穿刺时，请勿穿到底部，否则会影响到底层培养基颜色变化的观察。为了更好地观察三糖铁底部产酸变黄色，建议用塑料胶带或保鲜膜等封口后培养，也可以采用试管装的三糖铁。

6、血清学鉴定

6.1抗原的准备

志贺氏菌属没有动力，所以没有鞭毛抗原。志贺氏菌属主要有菌体（O）抗原。菌体O抗原又可分为型和群的特异性抗原。

一般采用1.2%-1.5%琼脂培养物作为玻片凝集试验用的抗原。

注1.一些志贺氏菌如果因为K抗原的存在而不出现凝集反应时，可挑取菌苔于1ml生理盐

水做成浓菌液，100℃煮沸15min-60min去除K抗原后再检查。

注2.D群志贺氏菌即可能是光滑性菌株也可能是粗造型菌株，与其他志贺氏菌群抗原不存在交叉反应。与肠杆菌科不同，宋内氏志贺氏菌粗造型菌株不一定会自凝。宋内氏志贺氏菌没有K抗原。

6.2凝集反应

在玻片上划出2个约1cm*2cm的区域，挑取一环待测菌，各放1/2环于玻片上的每一区域上部，在其中一个区域下部加1滴抗血清，在另一区域下部加入1滴生理盐水，作为对照。再用无菌的接种环或针分别将俩个区域内的菌落研成乳状液。将玻片倾斜摇动混合1min，并对着黑色背景进行观察，如果抗血清中出现凝结成块的颗粒，而且生理盐水中没有发生自凝现象，那么凝集反应为阳性。如果生理盐水中出现凝集，视为自凝。这时，应挑取同一培养基上的其他菌落继续进行试验。

如果待测菌的生化特征符合志贺氏菌属生化特征，而其血清学试验为阴性，则按 1.注1.进行试验。

7、结果报告

综合以上生化试验和血清学鉴定的结果，报告25g(ml)样品中检出或未检出志贺氏菌。