外显子

外显子

外显子(英语expressed region)是真核生物基因的一部分，它在剪接(Splicing)后仍会被保存下来，并可在蛋白质生物合成过程中被表达为蛋白质。外显子是最后出现在成熟RNA中的基因序列,又称表达序列。既存在于最初的转录产物中，也存在于成熟的RNA分子中的核苷酸序列。术语外显子也指编码相应RNA外显子的DNA中的区域。所有的外显子一同组成了遗传信息，该信息会体现在蛋白质上。

外显子-基因反应

剪接方式并不是唯一的(参看替代剪接)，所以外显子只能在成体mRNA中被看出。即使是使用生物信息学方法，要精确预测外显子的位置也是非常困难的。

真核生物的基因，其线性表达被内含子阻断，这就是所谓的断裂基因(英语splitgene)，该现象的发现者RichardJ.Roberts和PhillipA.Sharp获得了1993年诺贝尔奖。

在反式剪接中，不同mRNA的外显子可以被接合在一起。外显子在剪接(Splicing)后仍会被保存下来，并可在蛋白质生物合成过程中被表达为蛋白质。外显子是最后出现在成熟RNA 中的基因序列，又称表达序列。既存在于最初的转录产物中，也存在于成熟的RNA分子中的核苷酸序列。术语外显子也指编码相应RNA外显子的DNA中的区域。简言之，外显子就是指真核细胞的基因在表达过程中能编码蛋白质的核苷酸序列。关键概念：比较不同物种的相关基因，发现相应的外显子序列通常是保守的，而内含子序列则很少保守。编码蛋白质的序列通常处于选择压力之下，内含子由于没有选择压力，因此比外显子的进化快得多。通过确定在多种生物中出现的片段来鉴定编码区域，而外显子的保守性可以作为这种鉴定的基础。

人类大部分基因组序列都是被垃圾DNA序列分隔成一段段，给定一个已知的目标蛋白质和基因组序列，在该基因组序列中找出一组子字符串（候选外显子），使得其拼接（剪接）与目标蛋白质最匹配（即去掉垃圾DNA序列）。一个强力方法是寻找基因组序列与目标蛋白质序列间的所有局部相似性。若第一个取自基因组序列的子字符串展示了充分相似性于目标蛋白质，那么这个子字符串可被认为是一个推定的外显子。将推定外显子结构化为基因组序列中的赋权区间，它可用三个参数（l、r、w）来描述，l、r分别是推定的外显子的左边、右边的位置，w为其权重。权重w可反该区间是一个外显子的可能性。链是不重叠赋权区间的任一集合，一个链的总权重是该链中所有区间的权重之和。给定一个推定的外显子集，寻找非重叠的推定的外显子的一个最大集。输入：赋权区间（推定的外显子）集。输出：该集合中区间的最大

外显子-基因捕捉

外显子捕捉(exontrapping)是构建一种载体，从其插入片段中识别和回收外显子序列，从而克隆目的基因。捕捉外显子的载体pETV—SD是一种反转录病毒穿梭载体(shuttlevector)，即可在不同种生物中如大肠杆菌和酵母，细菌和哺乳动物细胞等进行复制的载体(见图5—14)。因为凡是有内含子和外显子的基因在转录后都要经过RNA剪接，这就需要有剪接供体(splicingdonor，SD)位点和剪接受体(splicingacceptor，SA)位点。因此，SA位点可作为基因的标志。pETV—咀载体的克隆位点上游有一个“外显子捕捉序

列”(exontrapcassette)，可用来识别载体的插入片段中有无SA位点。它含有β—珠蛋白(HBG)基因的第1个外显子及其有功能的SD位点，该基因的间隔序列(IVS)和α，β—半乳糖苷酶(αβ—GAL)基因。操作步骤及其基本原理是：

(1)基因组DNA经“霰弹法”切成小片段后，克隆在位于“外显子捕捉序列”下游的克隆位点上。

(2)将这些重组载体汇总后感染反转录病毒的专宿包装细胞系(ecotropicretroviralpackagingcellline)——ψ2细胞系。ψ2细胞提供蛋白质产物使载体(自身不能合成病毒蛋白质)成为反转录病毒在细胞里增殖。当反转录病毒在细胞内转录时，如果插入片段中包含有功能的SA位点，则有可能发生RNA剪接反应而将IVS切除。

(3)已剪接和未剪接的病毒RNA都包装在病毒子(virion)中，从细胞培养液中收集后用来感染兼宿反转录病毒包装细胞系(amphotropicretroviralpackagingcellline)PA-317。这使反转录病毒再进行一轮复制，并产生能感染猴肾细胞系COS细胞的高效价病毒原种。这样做是由于上一轮克隆在病毒中的插入片段的剪接效率极低，而在第二轮复制时则大大提高了RNA剪接的机会。

(4)从第二个细胞系PA-317细胞中分离得到的病毒，用来感染组成型产生SV40T(肿瘤)抗原的COS细胞。病毒RNA基因组被反转录，并在载体上的SV40复制起点作用下，以环状DNA附加体形式进行复制。

(5)从COS细胞中回收复制的附加体DNA，经限制性内切酶DpnI酶切后转化细菌。在含卡那霉素(Kn)和5—氯—4—溴—3—吲哚—β—D—半乳糖苷(X-gal)的培养基上挑选转化子。卢—半乳糖苷酶可水解X—gal而生成蓝色产物。因此，不产生β—半乳糖苷酶的转化子菌落则呈白色。

(6)只挑选出白色菌落作进一步研究的材料。白色菌落的生成可以有二种原因。一是由于基因发生突变，使夕—半乳糖苷酶失去活性；二是由于在反转录病毒生活周期的RNA时期中发生了剪接反应，从而丢失了α,β—半乳糖苷酶基因。

(7)如果是基因突变，则大多数将是缺失了载体中的“外显子捕捉”部分，就可用人的口—珠蛋白基因片段为探针作菌落杂交，很快可得到验证。

(8)如果是真正发生了RNA剪接事件，准确的剪接反应可切除作为标记的IVS，使人口—珠蛋白基因的第1外显子与落入了捕捉陷阱的插入片段中的外显子序列连接，这可直接测定其序列加以证明。从捕捉到的外显子出发，就可进一步用作探针去从基因组基因文库或cDNA 文库中分离出基因。

外显子-应用机理

外显子

应用聚合酶链反应-单链构象多态性

(polymerasechainreaction-singlestrandconformationpolymorphsim,PCR-SSCP)及DNA直接测序技术检测68例SAD患者和65名正常老年人的早老素-1基因第5外显子。

结果发现68例SAD患者中有4例患者的SSCP发生泳动异常，DNA序列分析发现：这4例SAD患者的130号密码子发了CTG→ATG错义突变(388位点发生C→A突变)，使氨基酸由亮氨酸变为蛋氨酸(Leu130Met)；157号密码子发生了GTG→CTG错义突变(469位点发生G→C突变)，使氨基酸由缬氨酸变为亮氨酸(Val157Leu)；有11例患者的SSCP表现为一条单链电泳迁移率明显增快，DNA序列分析发现：这11例SAD患者的130号密码子发生了CTG→ATG错义突变(388位点发生C→A突变)，使氨基酸由亮氨酸变为蛋氨酸

(Leu130Met)；154号密码子发生了TGC→TGT同义突变(462位点发生C→T)突变。结论，发现在SAD患者中存在早老素-1基因第5外显子突变，该突变点可能为中国人SAD患者早老素基因突变点之一。

多数早发性家族性阿尔茨海默氏病(familialalzheimer'sdisease,FAD)与14号染色体上的早

老素-1(presenilin-1,PS-1)基因突变有关，少数早发性FAD与PS-2基因突变有关。早老素基因与散发性Alzheimer病(sporadicalzheimer'sdisease,SAD)的关系，目前国内外研究较少，为探讨PS-1基因突变在SAD发病机理中的作用，我们用聚合酶链反应-单链构象多态性(polymerasechainreaction-singlestrandconformationpolymorphism,PCR-SSCP)、DNA