AD转基因小鼠的鉴定

转基因小鼠的鉴定

一、剪鼠尾

1.剪鼠尾的时间当新生的小鼠年龄达到两到三周（耳朵已经长开）时剪鼠尾较好，此时

鼠尾剪起来比较容易且小鼠的生命力比较强。

2.分辨小鼠的年龄

a当小鼠整个身体较红且腹部无奶时，此小鼠当天出生或前一晚出生；

b当小鼠腹部有奶（腹部有一小团白色物质），此小鼠出生2~3天；

c当小鼠背部长出皮毛时，此小鼠出生3~4天；

d当小鼠毛长全，但眼未开时，此小鼠出生10天左右；

e当小鼠眼刚开，耳未开时，此小鼠出生12天左右；

f当小鼠耳刚开时，此小鼠出生14天左右。

3.剪鼠尾后对小鼠的标记：打耳孔法

二、从鼠尾中提取DNA

采用鼠尾基因组DNA提取试剂盒（康为世纪：cw2094）提取DNA，操作如下：

1.剪取小鼠长度为0.4-0.6cm的尾巴，放入灭菌后的离心管中，加入180μL Buffer GTT。震

荡混匀。

2.加入20μL proteinase K，涡旋震荡，彻底混匀。

3.置于56℃水浴，直到组织溶液完全清澈，一般需消化6-8h，赋予过程中涡旋震荡，使样品

均匀分离。

注意：

1）如果赋予和涡旋震荡后仍然有胶状物质，必要时过夜消化再加入20μl proteinase K消化，不会影响后续操作。

2）如需去除RNA，可在上述步骤完成后，加入4μl浓度为100mg/μl的RNase A溶液，震荡混匀，室温放置5-10min。

4.14000rpm 离心1min，以消除未消化的类似于鼠毛等组织，将上清转移到一个新的灭过菌

的离心管中。

5.加入200μl Buffer GL，涡旋震荡，充分混匀，加入200μl 无水乙醇，涡旋振荡，充分混匀，

短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底。

注意：

1）加入Buffer GL 和无水乙醇后要立即涡旋震荡混匀。

2）如果多个样品一起操作，Buffer GL 和无水乙醇可以等比例混匀后一起加入样品。

3）加入Buffer GL 和无水乙醇后可能会产生白色沉淀，不会影响后续操作。

6.将步骤5中所得到的溶液全部加入到已装入收集管的吸附柱中，若以此不能加完溶液，可

分多次转入。10000rpm 离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

7.向吸附柱中加入500μl Buffer GW1（使用前检查是否已加无水乙醇），10000 rpm 离心

1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

8.向吸附柱中加入500μl Buffer GW2（使用前检查是否已加无水乙醇），10000 rpm 离心

1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。如需进一步提高DNA纯度，可重复步骤8。

9.12000rpm 离心2min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干。

注意：这一步的目的是将吸附柱中残余的乙醇去除，乙醇的残留会影响后续的酶促反应（酶切，PCR等）。

10.将吸附柱置于一个新的灭过菌的离心管中，向吸附柱的中间部位悬空加入50-200μl Buffer

GE或灭菌水，室温放置2-5min，10000rpm 离心1min，收集DNA溶液，-20℃保存DNA。

注意：

1）如果下游实验对PH值或EDTA敏感，可以用灭菌水洗脱，洗脱液的PH值对洗脱效率有很大影响，若用水作洗脱液应保证其PH值在7.0-8.5直接，PH值低于7.0时洗脱效率不高。

2）离心前室温孵育5min可增加产量。

3）用另外的50-200μL Buffer GE或灭菌水再次洗脱可以增加产量。

4）如果需要提高DNA的终浓度，可以将步骤10所得的DNA洗脱液重新加至吸附膜上，重复步骤10；若洗脱体积小于200μL，可以增加DNA的终浓度，但可能会减少总产量。

三、PCR

PCR程序设定：

1＝94.0℃for 5:00

2＝94.0℃for 1:00

3＝59.0℃for 0:50

4＝72.0℃for 1:00

5＝Goto 2 2times

6＝94℃for0:50

7＝58℃for 0:50

8＝72℃for 1:00

9＝Goto 6 2times

10＝94.0℃for 0:50

11＝56.0℃for 0:50

12＝72.0℃for 1:00

13＝Goto10 32times

14＝72.0℃for 10:00

15＝4.0℃for 5:00

16＝END

目前实验室的双转基因小鼠AD体系采用：

PCR反应的体系（12μl）：APP

Primer APP-1 1.3μl

Primer APP-2 1.3μl

ddH2O 2μl

mix（CW0682）6μl

DNA 1μl

PCR反应的体系（12μl）：PS1

Primer PS1-1 1.3μl

Primer PS1-2 1.3μl

内参-1 1μl

内参-2 1μl

mix（CW0682）6μl

DNA 1μl

先在1.5ml的EP管中加入总的体系再平均分装入各个PCR管中（一般多加两小管的量），将移液器调到总量的1/3到1/2体积在EP管中缓慢抽吸若干次（尽量避免产生气泡）以便Taq 酶混合均匀，最后再在各PCR管中依次加入DNA样品。

引物处理方法：引物在安基生物有限公司合成后，EP管上会有标记，一般为x nmol，使用前先用12000rpm 离心1min，加入10x μl ddH2O，涡旋振动混匀，微型离心机离心，即可得到100μM的母液，取10μl 的母液，用ddH2O稀释10倍，即加入90μl，混匀后即可得到10μM 的引物工作液。