微生物免疫学实验资料报告材料

1实验容：
2显微镜油镜的使用与保护。

3细菌的形态与结构的观察。

4实验目的：
5学会显微镜的使用，重点掌握油镜的使用与保护。

6进一步认识细菌的形态，明确细菌的大小与测量单位。

7熟悉细菌的特殊结构。

8实验材料：
显微镜、擦镜纸、液体石蜡、消毒液、细菌的基本形态标本、细菌的特殊结构标本。

4实验方法：
(1)显微镜油镜的使用与保护
显微镜是一种贵重的光学仪器，而油镜又是显微镜的最精密部分，是观察细菌最重要的工具。

因此，要求大家必须熟练地掌握显微镜的使用和保护，尤其是油镜，避免损坏。

1识别油镜：95╳、100╳、HI、OeL。

2对光：自然光用平面反光镜，人工光用凹面反光镜；先用低倍镜对光，次用高倍镜。

对好光源后，染色标本将聚光器升高，光圈放开。

3、调节焦距：选一细菌染色标本置于载物台上，用推进器固定，用低倍镜先找准物象，再用高倍镜看清物体，于标本上加镜油一滴。

⑴用眼从侧面观察，转动粗螺旋调节器，将油镜头徐徐下降浸入其中，切不可用力过猛，以免损坏油镜。

⑵用左眼从接目镜观察，徐徐向上转动粗螺旋调节器，见模糊物象后，再用细螺旋调节器，直到物象完全清晰为止。

4、显微镜的保护：
⑴所有的光学部分结构都不能用手指、普通布擦拭，用过的油镜头应立即先用擦镜纸蘸少许二甲苯擦拭，再用干擦镜纸擦去二甲苯，以防二甲苯镜头上的固定胶，致使镜片脱落。

⑵显微镜的光学部分应避免日光直射。

避免接触强酸、强硷、氯仿、酒精。

⑶显微镜用毕，将物镜转成品字形并下降集光器和镜筒，用软布擦拭各部件后覆盖于接目镜上，双手端平送入镜箱。

置于干燥处，以防受潮。

(二)细菌形态观察
1、细菌的基本形态；球菌：肺炎球菌、脑膜炎球菌、葡萄球菌、链球菌杆菌：大肠杆菌、炭疽杆菌、结核杆菌、白喉杆菌弧菌：霍乱弧菌
2、细菌的特殊结构：
荚膜：肺炎球菌、产气荚膜杆菌
鞭毛：水弧菌（周毛菌）
芽胞：破伤风杆菌（芽胞位于菌体顶端，呈鼓槌状）
一、实验容：
3细菌标本片的制备（操作）
4革兰染色法（操作）
二、实验目的：
1进一步了解细菌特殊结构在鉴别细菌过程中的实用意义。

2掌握革兰染色的操作法，充分认识革兰染色的临床意义。

三、实验材料：
革兰染色液全套、擦镜纸、二甲苯、大肠杆菌培养物、葡萄球菌培养物、生理盐水、玻片、接种环、酒精灯。

四、实验方法：
㈠细菌标本片的制备（操作）
1、涂片：点燃酒精灯；取洁净玻片一，右手持接种环一酒精灯火焰中消毒，稍冷后取
1－2环生理盐水置于玻片中央；再次消毒后，用接种环取菌落中的细菌或菌液或标本少许，在生理盐水中涂匀制成约1cm左右的薄膜，并将接种环再次消毒后，置于试管架中。

2、干燥：在室温中自然干燥；天冷时可在酒精灯火焰上方略加温，不可高温加热，否则，细菌被破坏后染色效果差。

3、固定：右手持玻片一端，标本面向上，在酒精灯火焰上方快速地来回通过三次，约2妙种。

固定的目的是杀死细菌，使细菌与玻片粘附较紧密。

㈡革兰染色法（操作）
1、初染：滴加结晶紫染液于标本上，以覆盖满为度，染1分钟后水洗，洒去积水。

2、媒染：加鲁格碘液，媒染1分钟后水洗，洒去积水。

7脱色：加95％酒精脱色（边加酒精边摇晃玻片，使酒精流去再加酒精，如此反复2 －3次）约30妙钟后水洗，洒去积水。

12复染：加复红染液染30妙钟后水洗，洒去积水，待干或用吸水纸吸干后镜检。

先低倍镜观察效果，再用高倍镜看清物象，滴加镜油后用油镜观察。

结果：G＋菌呈紫色，G－菌呈红色。

一、实验容
1、培养基的制备（操作）
2、细菌的人工培养法（操作）
3、细菌代产物观察（示教）
4、药敏试验（示教）
二、实验目的
1、熟悉细菌的培养方法，进一步掌握人工培养细菌的临床意义。

2、了解细菌代产物在鉴别细菌中的意义。

三、实验材料
牛肉膏、蛋白胨、、氯化钠、琼脂、SS琼脂、蒸馏水、1molNaOH、0.1 molNaOH、粗天平、0.02%酚红指示剂、pH比色器、无菌培养皿、无菌试管、接种环、酒精灯、各种鉴别培养基、高压消毒灭菌器、量筒、三角烧瓶、吸管、剪刀、绳索、葡萄球菌菌液、大肠杆菌菌液、伤寒杆菌菌液、乙型副伤寒杆菌菌液等。

四、实验方法
㈠培养基的制备（操作）
1、培养基的制备程序
称量溶化pH测定与矫正分装灭菌检定保存。

2、液体培养基的制备
1）称量：称取牛肉膏3g、蛋白胨10g、氯化钠5g，置于1000ml三角烧瓶中，加入蒸馏水1000ml。

2）混合溶解：加热溶化，待冷至40〜50o C时，测定并矫正pH为77.6。

3）pH测定与矫正方法：
⑴准备工作：取pH7.4①、7.6③酚红标准比色管及蒸馏水管②各1支，按图示装好；取口径与比色管相同的试管3支，各加待测液体基5ml，分别编上④、⑤、⑥号，按图示装好。

⑵比色：将比色架对光目视比色，比较二排管的颜色是否相同，若基为酸性（一般呈酸性），则向⑤号管中加0.02%酚红指示剂0.25ml摇匀，取1ml吸管一支吸取0.1 molNaOH1ml，缓慢滴入⑤号管，边加边摇匀，直至与标准管其中一侧颜色相同，准确记录NaOH的用量。

⑶计算：5ml基矫正至pH7.6用去0.1 molNaOH0.2ml，剩余的培养基则需加入1 molNaOH为Xml。

用比例公式计算。

N1：V1＝N2：V2
5：975＝0.2：X
X＝0.2*975/5=39(ml)
0.1 molNaOH需要39ml，而加1 molNaOH只需3.9ml。

4）分装：分装十适当容器（试管），包装好，高压蒸气灭菌后备用。

㈡细菌的人工培养法（操作）
1、平板划线接种法：
1）点燃酒精灯，右手以握笔式持接种环，在火焰上灭菌后稍冷，挑取葡萄球菌、大肠杆菌混合菌液一环。

2）用左手掌持琼脂平板，以左手拇指将平板盖启开，右手将取了菌液的接种环伸入平板，呈45O角，用分段划线法分离细菌（如图所示），盖好平板。

3）于平板底部贴上标签，写明班、组、菌名、日期，底向上，置于37O C温箱中培养24h后，观察结果。

2、液体培养基接种法：
左手持液体培养基，按照平板划线取葡萄球菌少许，用右手小指拔开棉塞，夹于指间（示教），并将管口在火焰上灭菌，将细菌接种于液体培养基。

再次灭菌管口，塞好棉塞。

贴上标签，置于37O C温箱中培养24h后，观察结果。

㈢细菌代产物观察（示教）
1、糖发酵试验：细菌分解糖后产酸产气，产酸后使批示剂显色，产气后可见到气泡。

产酸产气以“＋”表示，只产酸不产气以“＋”表示，不分解以“－”表示。

大肠杆菌和伤寒杆菌分解糖的结果如下：
2、硫化氢试验：某些细菌能分解培养基中的含硫氨基酸，产生硫化氢气体。

硫化氢与培养基中的铁盐或铅盐反应，形成黑色的硫化铁或硫化铅沉淀，为阳性，无黑色沉淀为阴性。

大肠杆菌硫化氢试验为阴性，乙型副伤寒杆菌为阳性。

㈣药敏试验（示教）
1、平板划线：
1）用密集划线法将细菌布满平板，方法同平板划线接种法。

2）在无菌接种箱，用左手启开平板盖，用无菌镊子夹取抗菌素纸片，间隔5cm放置平板培养基表面，盖好平板，贴上标签，置于37O C温箱中培养24h后，观察结果。

3）结果：观察抑菌区有无，测量抑菌区的直径。

直径<5mm为阴性(不敏感)、直径5〜10mm 为轻度敏感、直径10〜15mm为中度敏感、直径>15mm为高度敏感。

一、实验容
1、空气中细菌的检查（操作）
2、皮肤消毒试验（操作）
3、咽喉部细菌的检查（操作）
4、常用消毒灭菌器械的使用（示教）
二、实验目的
1、证明在自然界和正常人体体表有许多细菌存在，以树立严格的消毒及无菌观念。

2、了解常用消毒灭菌器械的使用方法，初步掌握紫外线的灭菌方法护注意事项。

三、实验材料
普通琼脂平板、SS琼脂平板、血平板、接种环、酒精灯、高压消毒灭菌器、干烤箱、紫外线、大肠杆菌培养液、1％龙胆紫、2.5％碘酒，75％乙醇、无菌棉签、镊子等。

四、实验方法
㈠空气中细菌的检查（操作）
1、取普通琼脂平板4个，启开皿盖，培养基面向上，分别放在实验室、寝室、室外及无菌操作台等处，暴露10〜20min后加盖。

2、于平板底部贴上标签，写明班、组、菌名、日期，底向上，置于37O C温箱中培养24h后，观察结果。

3、结果：如实填写。

㈡皮肤消毒试验（操作）
1、取普通琼脂平板1个，在底部用玻璃蜡笔划线分区并标号，启开皿盖，用右手食指轻轻涂抹培养基表面。

2、用2.5％碘酒消毒右手食指后，再用消毒后的手食指轻轻涂抹培养基表面，加盖。

3、于平板底部贴上标签，写明班、组、菌名、日期，底向上，置于37O C温箱中培养24h后，观察结果。

4、结果：如实填写。

㈢咽喉部细菌的检查（操作）
1、取血平板1个，启开皿盖，口对培养基表面（距离约10cm），深咳嗽三次（不可吹痰），加盖。

2、于平板底部贴上标签，写明班、组、菌名、日期，底向上，置于37O C温箱中培养24h后，观察结果。

3、结果：如实填写。

㈣常用消毒灭菌器械的使用（示教、介绍）
1、紫外线杀菌试验
⑴点燃酒精灯，取普通琼脂平板1个，在底部用玻璃蜡笔划线分出二个区并标号，启开皿盖，右手持接种环在火焰上灭菌后，稍冷，取大肠杆菌培养液一环，密集划线，加盖。

⑵将培养基置于无菌接种箱，启开皿盖，将盖子盖于培养基上的一半，打开紫外线灯开头，
照射30min后，加盖。

⑶于平板底部贴上标签，写明班、组、菌名、日期，底向上，置于37O C温箱中培养24h后，观察结果。

⑷结果：如实填写。

2、手提式高压蒸气灭菌器（介绍）
⑴构造：略
⑵用法：加水至规定的水平面、放入灭菌物品，加盖、旋紧，打开排气阀；通电加热、温度逐渐上升时，器冷空气由排气阀排出，待有大量蒸气逸出时，关闭排气阀，继续加热，直到压力表的指针指在所需的位置后，调节电源，控制温度，维持20〜30min后，打开排气阀排气，待压力表指针指向“0”时，再开盖取物。

⑶注意事项：①灭菌开始时必须排尽冷空气；②灭菌完毕，切不可突然打开盖子排气减压，以免瓶液体等冲出外溢；③放置物品不应太挤。

⑷用途：用于耐高温和不怕潮湿的物品灭菌。

病原性球菌的检查
实验目的：
1掌握病原性球菌的形态、染色特性。

2了解脓汁标本的病原性球菌的分离鉴定的程序。

3了解抗“O”试验的原理、方法及临床意义。

实验容：
1、病原性球菌标本的观察。

2、脓汁标本中病原性球菌的分离鉴定的程序。

3、抗“O”试验
实验材料：
显微镜、细菌标本、玻片、试管、试管架、吸管、水浴箱、注射器、2.5%碘酒、棉签、
生理盐水、血平板、兔血浆、抗“O”试剂、血平板。

实验方法：
(2)病原性球菌标本的观察
1、葡萄球菌、链球菌、肺炎球菌、脑膜炎球菌、淋球菌的形态观察（操作）。

2、葡萄球菌、链球菌溶血现象观察（示教）。

(4)脓汁标本中病原性球菌的分离鉴定的程序
直接涂片革兰染色镜检
脓汁标本观察菌特征及溶液血情况
接种血平板24h培养后观察取菌落涂片革兰染色镜检
取菌落作生化反应、致病力试验
(5)抗“O”试验
原理：
乙型溶血性链球菌能产生溶血素“O”，能溶液解人和兔红细胞并有很强的抗原性，
能刺激机体产生抗溶血素“O”（抗体）。

抗溶血素“O”能中和溶血素“O”的溶血作用。

本法是将病人血清与已知溶血素“O”抗原先混合，作用一段时间后，再加入红细胞悬液。

若红细胞不被溶解为阳性，溶解为阴性。

方法：
1、取小试管6支，分别编号，分两排置于试管架上（1-3为第一排，4-6为第二排）。

2、第一排试管加待检血清(0.25ml)分别稀释为200、400、800倍；第二排试管加待检血
清(0.25ml)分别稀释300、600、1200倍。

3、分别加链球菌溶血素“O”抗原0.25ml，充分混匀，置于37o C水浴箱中10min。

7分别加5%红细胞悬液0.25ml，充分混匀，置37o C水浴箱中30min后观察结果。

结果：
以完全不溶液血的血清最高稀释度为抗“O”抗体的效价。

正常值为500单位以下。

用途：
600单位及以上有诊断意义，用于辅助诊断活动性风湿。

(四) 血浆凝固酶试验
3取玻片一，加生理盐水一环。

用接种环取葡萄球菌少许，混匀。

4加血浆一滴、混匀，数分钟后观察结果。

出现颗粒状凝集的为阳性、反之为阴性。

肠道杆菌的检查
实验目的：
1、掌握肠道杆菌的形态、染色特性。

2、了解肠道杆菌的分离鉴定的程序。

3、了解肥达试验的原理、方法及临床意义。

实验容：
1、肠道杆菌形态标本的观察。

2、肠道杆菌的分离鉴定程序。

3、肥达试验。

实验材料：
显微镜、细菌标本、玻片、试管、试管架、吸管、水浴箱、注射器、2.5%碘酒、棉签、
生理盐水、SS培养基、患者血清1：10稀释、伤寒杆菌O菌液、H菌液、甲、乙型副伤寒H 菌液。

实验方法：
一、肠道杆菌的形态观察
【材料】大肠杆菌、变形杆菌、痢疾杆菌、伤寒杆菌革兰染色示教片。

【方法】注意上述肠道杆菌形态、排列、染色的共同点，故肠道杆菌的染色镜检不能做为肠道杆菌之间的鉴别依据。

二、肠道杆菌培养物与生化反应观察
【材料】大肠杆菌、变形杆菌、痢疾杆菌、伤寒杆菌及乙型副伤寒杆菌在SS培养基、双糖铁、
尿素及蛋白胨水培养基上24小时培养物。

【方法】
1、观察大肠杆菌、变形杆菌、痢疾杆菌、伤寒杆菌及乙型副伤寒杆菌在EMB培养基上生长情况，注意菌落的形态、大小、颜色及透明度。

表1 五种肠道杆菌在SS培养基上的菌落特征
2、观察大肠杆菌、变形杆菌、痢疾杆菌、伤寒杆菌及乙型副伤寒杆菌在双糖铁、尿素及蛋白胨水培养基上生长情况，注意生化反应与动力的鉴别。

表2 五种肠道杆菌生化反应与动力鉴别表
大肠杆菌⊕⊕- - + +
变形杆菌⊕- +/- + +/- +
副伤寒乙杆菌⊕- +++ - - +
伤寒杆菌+ - -/+ - - +
痢疾杆菌+ - - - +/- -
三、粪便标本中肠道杆菌的分离鉴定
（一）标本采集
尽可能在发病早期或治疗前采集新鲜粪便，选取脓血或粘液部分，取材后应立即送检。

如不能立即送检，可将标本保存于30%甘油缓冲盐水中。

（二）检验程序
肠道杆菌检验程序
（三）检验方法：
1、分离培养
【材料】新鲜粪便标本、SS琼脂平板。

【方法】
按上述检验程序进行第一日的检验步骤，即用接种环挑取新鲜粪便标本，划线接种于EMB或SS平板上，37℃培养24小时。

【结果】
观察平板上菌落，依据其大小、颜色、透明度等特点，初步识别可疑病原菌菌落，进行鉴定。

在EMB平板上非致病菌菌落较大、紫黑色、有金属光泽，不透明，而可疑菌落略小，半透明。

2、初步鉴定
【材料】双糖铁培养基
【方法】
用接种针从可疑病原菌菌落中心点取细菌，穿刺接种双糖铁培养基（Kligler培养基），37℃培养18-24小时后，观察结果，并据此判定细菌属性。

【结果】
上层下层动力H2S
+ ○++ -
非致病菌
+ ○+- -
- + - - 痢疾杆菌
- + + + 伤寒杆菌
- ○++ + 副伤寒杆菌
【用途】
初步鉴别肠道致病菌用，可以观察葡萄糖、乳糖的发酵，并可观察有无H2S产生及细菌有无动力。

【原理】
克氏双糖铁培养基中含有葡萄糖、乳糖、硫酸亚铁及酚红指示剂等成分。

经菌分解葡萄糖产酸时，使培养基的下层由红变黄，斜面培养基中虽然也含有葡萄糖但量小，且分解产生的酸为挥发性酸并且可被氧化，所以只发酵葡萄糖的细菌斜面仍为红色；产酸并产气时，培养基中有气泡或裂隙出现。

培养基中乳糖含量大，被分解后产酸多，因此不仅培养基下层变黄，
而且斜面处也由红变黄，基于上述现象，通常将培养基的斜面部分代表乳糖，下层部分代表葡萄糖。

培养基中含有硫酸亚铁，如有硫化氢产生，则生成黑色硫化亚铁，使培养基中出现黑色。

硫代硫酸钠是一种还原剂，防止培养基中氧化物与H2S作用而影响FeS的生成。

3、血清学鉴定
【材料】沙门菌属、志贺菌属多价诊断血清，生理盐水，载玻片等。

【方法】
（1）根据初步鉴定结果，选用相应诊断血清做玻片凝集试验。

用接种环自双糖铁培养基上挑取少许菌苔，分别磨匀于生理盐水与相应诊断血清中，摇动玻片1-2分钟，观察结果
（2）凝集试验阳性者，报告结果；凝集试验阴性者应保留菌种进一步鉴定。

【思考题】
1、肠道杆菌有何共同特征？
2、大肠、变形、痢疾、伤寒杆菌及乙型副伤寒杆菌的鉴别要点是什么？
3、如果大肠杆菌、伤寒杆菌、乙型副伤寒杆菌和痢疾杆菌混杂在肉汤培养基中，你怎样把它们分离出来，使各自成为纯培养物?
【附注】痢疾杆菌荧光菌球试验
【原理】
将相应抗体加在痢疾杆菌的培养液中，虽相互结合，但细菌不被杀死，在适宜温度下仍能生长，形成痢疾杆菌微小菌团。

如在抗体上标记荧光，则形成痢疾杆菌荧光菌球。

【材料与方法】
1.将痢疾杆菌接种于含有一定量的荧光抗体的蛋白胨水中，37℃培养10小时。

2.蘸取上述培养物接种环于清法玻片上，放上盖玻片，在荧光显微镜下观察。

【结果】
荧光球大而发亮呈圆球状，结构较疏松，周围近似卷发状。

随孵育时间增长，菌球结构致密，周围较圆，整齐，菌球周围有刺毛，孵育时间短时，菌球往往呈多形性。

肥达反应
【方法】
1.取清洁小试管32支，分成4排，每排8支，依次编号。

2.于小试管各注入0.5ml生理盐水。

3.于每一排第一管加入1：10稀释的患者血清0.5ml，用1ml吸管吹吸三次，混匀，吸出0.5ml 注入第二管作对倍稀释，……依次稀释至第7管，弃去0.5ml，第8管为对照。

4.从第8管开始，从后向前，第一排各管注入伤寒杆菌H菌液0.5ml；第二排各管注入伤寒杆菌O菌液0.5ml；第三排各加入甲型副作寒杆菌H液0.5ml；第四排各管加入乙型副伤寒杆菌H 菌液0.5ml；
5.加完菌液后，振荡试管架，混匀，置于56℃水浴箱2~4小时，放冰箱过夜，或放置37℃水浴箱18小时后观察结果
肥达氏反应操作表单位:ml
8（对
试管 1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 6 7
照）
生理盐水0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
1：10 病人0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5→
血清弃去
诊断菌液0.5 0.5 0.5 0.5 05 0.5 0.5 0.5
血清最终
1：40 1：80 1：160 1：320 1：640 1：1280 1：2560 －
稀释度
结果
【结果与分析】
先观察对照管，正确结果应无凝集现象，再观察各试验管的凝集现象，凝集程度以“+”多少表示之。

（++++）最强，上液澄清，细菌全部凝集沉淀于管底。

（+++）强，上液轻度混浊，细菌大部分凝集沉淀于管底。

（++）弱，上液混浊，细菌少部分凝集。

（-）不凝，液体呈乳状与对照管相同。

效价判定：以能出现“++”凝集现象的血清最高稀释度为该血清的凝集效价。

一般认为O抗体效价在1：80以上，H抗体效价在1：160以上，有辅助诊断意义。

但在分析结果时，应注意以下两点：
（1）首先应了解当地正常人效价，一般凝集价超过正常凝集价时才有诊断意义。

（2）非肠热症患者，由于曾接种过伤寒，副伤寒疫苗或以往在流行区有过隐性感染或患过伤寒，副伤寒，近期又感染流感、或布鲁氏菌病时，可产生高效价的H凝集素和较低效价的O 凝集素，此种反应称非特异回忆反应，也可呈现阳性结果，其它如结核病、败血症、斑疹伤寒、肝炎等也可出现类似反应。

不过，由这些原因所引起的阳性反应主要是H抗体升高，O 抗体效价一般不高，同时，每隔5~7天试血一次，其抗体效价一般不会随病程而升高。

上述这些都有别于现症感染。

（3）少数肠热症患者，由于发病初期曾使用大量抗生素，或机体有免疫缺陷病，或机体反应性极弱等原因，抗体效价可以很低，甚至为阴性结果。

大约占10%，故阴性结果不能完全排除肠热症的诊断。

（4）采血时间不同，肥达反应的阳性率也不同，发病一周50%，第二周80%，第四周90%以上，恢复期凝集价最高，以后逐渐下降。

一般以双份血清（急性期和恢复期）对比，凝集价有明显上升者作为新近感染的指标。

（肥达反应）
因此不能只根据肥达氏试验的结果去作简单肯定或否定的结论，必须结合当地流行情况，既往接触史，以及临床症状和体征，作出正确的判断。