第四章++植物遗传转化技术
植物遗传转化技术
binary vector
• 包括mini-Ti质粒（T-DNA边界，缺失Vir区）和 helper Ti质粒（含有Vir区缺失T-DNA边界，相当 于co-integrated vector 的disarmed Ti质粒） mini-Ti质粒：pBin19，pCAMBIA系列 helper Ti质粒：EHA105，LBA4404（pAL4404）
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Co-integration plasmid
• 一元载体系统A plasmid based on pBR322 used to clone gene of interest
• A Ti-based vector: pGV3850 (LB, RB, most of T-DNA replaced by pBR322)
Left border
Right border
12-24 kbp
vir genes
Opine
ori
catabolism
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3. 创伤诱导分子
• 是一类可溶性的小分子酚类化合物 • 乙酰丁香酮（acetosyringone，AS）、羟
基乙酰丁香酮（acetosyringone，OH-AS） • A.t: recognition and chemotaxis （趋化性）
• Left and right border (LB\RB):TDNA左右两侧各有一段25bp的重复 序列，在T-DNA的整合中起重要作用
• Ori区(origin of replication)：该区段 基因调控Ti质粒的自我复制，故称之 为复制起始区。
T-DNA region
Auxin Cytokinin Opine
• T-DNA和vir基因参与，T-DNA上的基因与 T-DNA的转移及整合有关，因为它不编码 T-DNA转移的产物。
植物遗传转化流程
植物遗传转化流程Genetic transformation in plants is a complex process that involves the transfer of genes into plant cells and the regeneration of transformed plants. This process has revolutionized agriculture by allowing for the development of genetically modified crops with improved traits such as resistance to pests, diseases, and environmental stress. However, the genetic transformation of plants comes with its own set of challenges and limitations.植物遗传转化是一个复杂的过程，涉及到基因的转移到植物细胞中，并且使转化植物再生。
这一过程通过允许开发具有改良特性的转基因作物，如抗虫、抗病和抗环境压力，从而使农业发生了革命性的变化。
然而，植物的遗传转化也面临着一系列的挑战和限制。
The first step in the genetic transformation of plants is the introduction of foreign genes into the plant cells. This can be achieved through various methods such as Agrobacterium-mediated transformation, biolistic transformation, and protoplast transformation. Each method has its own advantages anddisadvantages, and the choice of method depends on the target plant species and the specific traits that need to be introduced.植物遗传转化的第一步是将外源基因引入植物细胞中。
植物次生代谢产物的遗传转化及其应用研究
植物次生代谢产物的遗传转化及其应用研究植物次生代谢产物是指在植物体内不参与基本生命活动，但在植物生长发育、适应环境和与外界的相互作用中发挥重要作用的化合物。
这些化合物的种类繁多，包括单萜、生物碱、黄酮类、苯丙素类等。
它们不仅对植物自身有重要生理功能，而且对人类和动物也具有重要药用、食用和工业用途。
植物次生代谢产物的遗传转化是指通过遗传工程手段，将植物细胞中的代谢途径重定向到制备某种次生代谢产物上。
通过转化后的植物，可在量上和质上有所改变，使之适应更广泛的应用。
近年来，植物次生代谢产物的遗传转化技术已经得到广泛的研究和应用。
一、植物次生代谢产物的遗传转化方法1、基因克隆基因克隆是遗传转化的基础。
植物次生代谢产物的代谢途径复杂，往往涉及多个基因的调控和协同。
因此，精准地克隆和分离涉及到的基因，是植物次生代谢产物的遗传转化研究的重要前提。
2、遗传转化技术遗传转化技术是指将外源基因（如酵母、细菌、动物等）导入植物，使其在植物体内表达。
常用的植物遗传转化技术有农杆菌介导遗传转化、微粒轰击法、基因炮法等。
通过遗传转化技术，可以在植物中导入指定的基因，构建其次生代谢产物合成途径。
3、分子改造分子改造是指利用现代分子生物学技术，对已知基因进行修改以达到人为控制次生代谢物质规模的目的。
常用的分子改造技术有基因沉默、基因敲除、反义基因等。
二、植物次生代谢产物的遗传转化应用研究1、药物应用植物次生代谢产物是开发药物的重要来源之一。
利用遗传转化技术，可以大量生产与已知药物相似的次生代谢产物，用于药物筛选和研发过程中的临床扩展。
近年来，通过植物遗传转化的方式生产的药物已经接近商业生产阶段，其中最为成功的是肺癌药物紫杉醇。
2、食品应用植物次生代谢产物还可以应用于食品领域。
通过遗传转化技术，植物可以生产出与已知食品相似的次生代谢产物，获得更佳的口感和口味。
此外，植物次生代谢产物还可以增强食物的营养价值，如增加维生素、蛋白质等。
园艺植物遗传转化
园艺植物遗传转化
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第二节 转化的受体系统
一、转化受体的条件
3，具有稳定的外植体来源 转基因研究的工作效率不高，同一实验内
容往往需要多次重复进行。 只有稳定的外植体来源，才能够方便科学研
究的进行，并从材料的源头上提高实验结果的 重现性，便于对实验结果的总结。
由种子萌发得到的子叶、胚轴；以及无菌培 养的小苗叶片，都是比较理想的材料。
抗病虫育种、抗逆境育种、品质改良
功能基因组学
（functional genomics）
基因加标(gene tagging) 基因敲除(gene knock-out) 候选克隆的功能互补试验
植物代谢工程
( plant metabolic engineering )
利用转特殊基因的植物作为生物反应器 (bioreactor)工厂化生产工业或医药用品
园艺植物遗传转化
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第一节 植物遗传转化的基础
3，植物转基因的优越性
对植物基因型和表现型的改变只作用于目标性状，不 涉及非目标累赘基因，因而更具有针对性，可加快育 种进程；
可克服传统育种中不同生物之间的生殖隔离等限制， 扩大可利用的资源库（动物、植物、微生物、人工种质；
5，导入外源基因的方法
目前应用最多的是基因枪法和农杆菌介导法 （具体参考实验指导书）
园艺植物遗传转化
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农杆菌和基因枪转化的特点比较
1，农杆菌转化的特点： 多为单拷贝或寡拷贝转化与整合，减少了
共抑制等基因沉默现象，转基因遗传较稳 定； 不需要特殊设备，实验成本较低。
园艺植物遗传转化
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农杆菌和基因枪转化的特点比较
园艺植物遗传转化
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第二节 转化的受体系统
第四章植物遗传转化技术
卸甲载体
TL-DNA部分序列
pTiB6S3
LIH
pMON200
Kanr 同源重组
中间载体
转基因整合到植物基因组中
一元载体转化系统-pGV3850与SEV比较
共同点: 两者都是通过受体Ti质粒与中间载体同源重组
而形成，故同属于一元载体系统。 不同点： • 受体Ti质粒与中间载体的结构不同。 • 同源序列不同。 • SEV是更有效的共整合载体。
• 中间表达载体：是由中间载体（含选择标记 ）加上能在植物细胞中表达的启动子及目的 基因构成，也就是嵌合基因插入中间载体后 构成。
• 嵌合基因（chimeric gene） 就是来自两种或两种以上生物的启动子、
结构基因、终止子连接在一起构成基因。
中间表达载体-启动子及调控序列
• Ti质粒
Nos、Ocs等基因具有与真核生物启动子类似
实验表明，T-DNA转移到植物细胞后整合进植物基因组中 并得以表达，从而导致了冠瘿瘤的发生。进一步研究发 现，整合到植物基因组中的T-DNA可以通过减数分裂稳定 地传给植物的后代。
Ti质粒的上述特性成为农杆菌介导法植物遗传转化的重 要基础。
Ti质粒是根癌农杆菌染色体外的遗传物质； 双股共价闭合的环状DNA分子； T-DNA能够插入到植物基因组中并能稳定表 达； 长度150-200KB； 植物基因工程常用的载体。
• 根据其诱导的植物冠瘿瘤中所合成的冠瘿 碱种类不同分：
• 章鱼碱型（octopine） • 胭脂碱型（nopaline） • 农杆碱型（agropine） • 琥珀碱型（agrocinoine）
章鱼碱的遗传图
胭脂碱的遗传图
Ti质粒结构
T-DNA区、毒性区(vir)、质粒复制起点(ori)、质粒 结合转移位点(con)、冠瘿碱分解位点(ocs or nos)
植物遗传转化中存在的问题与对策
植物遗传转化中存在的问题与对策大家好，今天我们来聊聊植物遗传转化这个话题。
我们得明白什么是遗传转化。
遗传转化是指将一个生物体的基因转移到另一个生物体的过程。
在植物领域，遗传转化技术被广泛应用于培育新品种、提高抗病性、改善营养成分等方面。
这项技术也存在一些问题，接下来我们就来看看这些问题以及应对措施。
1.1 问题一：成本高昂遗传转化技术的成本非常高，这是因为它涉及到很多复杂的实验和操作。
例如，需要先从一个生物体中提取出目标基因，然后通过化学方法将其插入到另一个生物体的DNA中。
这个过程非常繁琐，而且需要大量的实验室设备和人力投入。
因此，遗传转化技术通常只被用于研究目的，而不是大规模的商业化生产。
1.2 问题二：效率低下虽然遗传转化技术可以实现基因转移，但是它的效率并不高。
有时候，即使成功地将目标基因插入到另一个生物体的DNA中，也不一定能够稳定地表达出来。
这就导致了遗传转化产生的新品种往往存在很多不稳定性和变异性，难以进行大规模的推广和应用。
2.1 问题一：安全性问题遗传转化技术还存在一定的安全性问题。
由于涉及到基因的操作，一旦操作不当就可能导致不良后果。
例如，有可能出现新的病毒或者细菌，对人体健康造成威胁。
遗传转化技术还可能对环境造成污染，影响生态平衡。
2.2 问题二：道德争议除了安全性问题外，遗传转化技术还引发了一些道德争议。
有人认为，将基因直接插入到另一个生物体中是对自然界的破坏和干预，不符合伦理原则。
还有人担心遗传转化技术可能被用于制造“超级作物”，从而导致资源的不公平分配和社会问题的加剧。
3.1 问题一：法律法规缺失目前，我国对于遗传转化技术的法律法规还比较薄弱。
虽然有一些相关政策和规定出台了，但是执行力度不够强，监管不够严格。
这就给一些不法分子提供了可乘之机，利用遗传转化技术进行非法活动。
3.2 问题二：人才培养不足要想发展好遗传转化技术，还需要大量的专业人才支持。
然而目前我国在这方面的人才培养还比较滞后，很多高校和科研机构缺乏相关的教授和研究人员。
植物基因转化常用方法
一、植物遗传转化的方法植物遗传转化技术可分为两大类:一类就是直接基因转移技术,包括基因枪法、原生质体法、脂质体法、花粉管通道法、电激转化法、PEG介导转化方法等,其中基因枪转化法就是代表。
另一类就是生物介导的转化方法,主要有农杆菌介导与病毒介导两种转化方法,其中农杆菌介导的转化方法操作简便、成本低、转化率高,广泛应用于双子叶植物的遗传转化。
二、农杆菌介导的基因转化方法(一)农杆菌的Ti质粒与T-DNA的整合机制几乎所有双子叶植物都容易受到土壤农杆菌感染,而产生根瘤。
它就是一种革兰氏阴性土壤杆菌(A、tumefaciens)。
其致瘤特性就是由Ti(tumor－inducing)质粒介导的。
农杆根瘤菌之所以会感染植物根部就是因为植物根部损伤部位分泌出酚类物质乙酰丁香酮与羟基乙酰丁香酮,这些酚类物质可以诱导Vir(Virulence region)基因的启动表达,Vir基因的产物将Ti质粒上的一段T－DNA单链切下,而位于根瘤染色体上的操纵子基因产物则与单链T－DNA结合,形成复合物,转化植物根部细胞。
T－DNA上有三套基因,其中两套基因分别控制合成植物生长素与分裂素,促使植物创伤组织无限制地生长与分裂,形成冠瘿瘤。
第三套基因合成冠瘿碱,冠瘿碱有四种类型:章鱼碱(octopine)、胭脂碱(nopaline)、农杆碱(agropine)、琥珀碱(succinamopine),使农杆菌生长必需的物质。
1、Ti质粒的结构在发现根瘤农杆菌诱发冠瘿瘤的本质就是Ti质粒后,Ti质粒便成为冠瘿瘤形成基因鉴定与分析的主要研究对象。
Ti质粒大约在160～240kB之间。
其中T-DNA大约在15kb-30kb。
Vir基因区在36kb 左右。
除此之外,Ti质粒上还存在Con区(region encoding conjugation)与Ori区(origin of replication)。
T-DNA上共有三套基因与左右两个边界,LB与RB就是长为25bp的末端反复重复顺序,在切除及整合过程具有重要意义。
植物遗传改良的技术
植物遗传改良的技术植物遗传改良的技术是现代农业和植物育种的重要手段之一。
通过遗传改良，我们可以增加植物的产量、改善植物的品质、提高植物的抗病虫害能力，以满足人类对农作物的需求。
本文将介绍几种常见的植物遗传改良技术，并探讨其应用前景和影响。
一、杂交育种杂交育种是一种通过交配不同品种的植物，将其优良的性状遗传给后代的育种方法。
通过选择不同的亲本植物，并进行人工授粉，可以实现品种间的杂交。
杂交育种可以提高植物的产量和抗性，并增加植物的适应性。
例如，现在我们常见的水稻和小麦，就是通过杂交育种培育出来的高产品种。
二、基因编辑技术基因编辑技术是近年来快速发展的一种植物遗传改良技术。
它通过直接改变植物的基因组，实现对植物遗传性状的精确调控。
其中，CRISPR-Cas9是一种常用的基因编辑工具。
通过CRISPR-Cas9系统，研究人员可以精确地切割植物基因组中特定的基因，从而引发特定的基因突变。
利用基因编辑技术，人们可以改善植物的抗病虫害能力、增加植物的营养价值，甚至提高植物的耐逆性。
三、转基因技术转基因技术是一种将外源基因导入植物基因组中的方法。
通过转基因技术，人们可以向植物中引入一些特定的基因，以增加植物的产量、提高植物的抗病性或抗虫性。
转基因技术在植物遗传改良中具有重要的应用前景，但同时也引发了一些争议。
人们担心外源基因的导入可能对环境和人类健康造成潜在风险。
四、组织培养和胚胎移植技术组织培养和胚胎移植技术是一种通过细胞培养和组织修复的方法，实现对植物的遗传改良。
通过选取优良的植株组织，进行细胞培养和胚胎移植，可以快速繁殖和培育出大量的优良植株。
组织培养和胚胎移植技术可以加速植物的遗传进程，缩短育种周期。
总结起来，植物遗传改良的技术在农业生产和食品安全方面具有重要的意义。
通过杂交育种、基因编辑技术、转基因技术以及组织培养和胚胎移植技术，可以提高农作物的产量、提高植物的抗性、改善植物品质，以满足不断增长的人类需求。
植物遗传改良的技术和方法
植物遗传改良的技术和方法随着科技的不断发展和进步，人类开始了解到了植物的神奇之处。
然而，众所周知，植物的基本特征和性质是由基因所决定的。
这也导致了我们需要对其基因进行改良，从而提高其产量、抗病性等性质，以满足人们日益增长的需求。
而在这个过程中，一些新的技术和方法也兴起了。
植物的基因工程植物基因工程是指基于分子生物学和生物技术手段对植物基因的人工操作，进而改变植物的性状。
这种技术主要通过外源基因的引入来实现。
具体而言，就是将具有特定功能的外源基因，送入植物体内，从而使植物在基因上发生改变，产生新的或提高原有的性状，以满足人们的需要。
其中，诸如细菌和病毒等的载体是获取外源基因的一种重要工具。
通过将目标基因插入载体中，进行转化和筛选，最终将其送入植物体内进行基因的改变。
例如，将农业上常用的抗虫基因转移到植物中，以增强其抗虫能力。
还有一种方法是利用 CRISPR/Cas9 技术直接对基因进行修剪、割除、替换等操作，从而改造植物的性状。
这种方法同样在分子遗传改良领域中得到了广泛应用。
植物的转基因技术植物的转基因技术是指将外源基因转移进入植物体内，改变其性状和品质的一种技术。
转基因技术通过基因工程手段引入外源基因，使植物产生新的、有用的特性。
例如，将孔雀石绿基因转移到水稻中，使其产生抗虫、抗病功能，从而增加了水稻的生产量和产值。
通常情况下，转基因之前需要进行一系列的育种与选择工作，以获得适合基因工程的植物品种。
这些品种一般具有高生产力、较强的生命力、遗传稳定性等特性。
另外，采用转基因技术可以提高植物的抗逆性，如利用转基因方法标记抗干旱基因，可以生产出抗旱性强的植物品种，可以解决传统育种方法难以解决的问题。
植物的细胞工程植物细胞工程是指将人工合成的成熟植物细胞或非成熟植物细胞再生成为新的、原生态的植物体或某些器官（如根、茎、芽、花等），以实现对植物基因的遗传改良。
由于有很多植物品种是难以交配的，但如果我们能够通过体外培养的方法，将非正常部分细胞转变为正常植物细胞，那么整个植物就可以进行遗传改良。
农杆菌如何介导植物遗传转化
农杆菌如何介导植物遗传转化？植物遗传转化技术植物遗传转化技术也称植物转基因技术，是应用DNA重组技术将外源基因通过生物、物理或化学等手段导入植物基因组，以获得外源基因稳定遗传和表达的植物遗传改良的一门技术。
目前最常用的转基因方法是基因枪法和农杆菌法。
基因枪法的基本原理是利用表面附着有外源DNA的金属微粒在高压装置中加速后高速运动到受体细胞中，从而达到转化DNA的目的。
但是基因枪法与农杆菌介导法相比，存在着转化率低、遗传稳定性较差、外源DNA整合机理不清楚、得到的转化体往往是嵌合体、转入外源基因的沉默现象突出等缺点。
接下来，这篇文章着重介绍农杆菌介导的植物遗传转化。
优点农杆菌作为一种天然的植物基因转化系统，其介导的转化属于纯生物学的过程，与其它转化方法相比具有明显的优点，主要包括：(1)转化频率高；(2)可导入大片段的DNA，且导入植物细胞的片段确切；(3)导入基因拷贝数低，大多只有1-3个，表达效果好，能稳定遗传，多数符合盂德尔遗传规律。
而且，从大量的报道可以发现，农杆菌的寄主范围有很大的扩展，已经延伸到了原核生物、真菌甚至人类细胞等非植物领域。
原理农杆菌是一种革兰氏阴性细菌，它对寄主细胞的转化是借助诱导瘤细胞(tumor-inducing, Ti)质粒将其中一段特定的DNA片断转入寄主细胞基因组的过程。
在自然环境中，被转移的DNA (T-DNA)携带了一套致瘤基因和冠瘿碱代谢基因，它们在植物中的表达可引起被侵染组织产生肿瘤并合成冠瘿碱作为细菌的氮源。
利用分子克隆技术可以将T-DNA替换为目标基因，使农杆菌成为一个能有效将外源基因导入植物的天然工具。
图1 农杆菌介导的基因转化。
此外，有多种植物蛋白质也参与了农杆菌介导的基因转化过程，主要作用于T-DNA胞内运输、进入细胞核以及整合阶段。
因为农杆菌主要利用植物细胞内的生物过程(例如DNA和蛋白质运输、靶蛋白水解和DNA修复)来转化其受体，研究这些基本的植物细胞生物学机制有助于扩大农杆菌的受体范围，同样也可促进转化过程和转基因植物的产物控制。
植物遗传转化研究植物基因工程和遗传转化技术
植物遗传转化研究植物基因工程和遗传转化技术植物遗传转化研究：植物基因工程和遗传转化技术植物遗传转化研究是现代生物技术领域的一个重要分支，它通过操纵植物的基因来改变其性状和功能，为农业、生物医学和环境保护等方面提供了广阔的应用前景。
本文将介绍植物基因工程的原理和遗传转化技术的发展现状，以及其在农业和医学领域的应用。
一、植物基因工程原理植物基因工程是指通过人为干预植物基因组，将外源基因导入植物细胞，并使其在植物中表达。
其核心技术是DNA重组技术，具体包括以下几个步骤：1. 外源基因的克隆：将具有特定功能的基因从其他生物体中分离出来，并经过体外扩增，得到足够的DNA片段。
2. 载体构建：将目标基因与适当的表达载体连接，构建成重组DNA。
常用的载体包括质粒和病毒。
3. 转化方法：将重组DNA导入植物细胞。
常用的转化方法有农杆菌介导的转化和基因枪介导的转化等。
4. 选择与筛选：利用选择标记基因或者报告基因等，对经转化的植株进行筛选和鉴定，确保目标基因已经成功导入植物细胞。
5. 后续培养：将转基因植株培养至成熟植株，并进行繁殖和观察，验证目标基因的功能和表达。
二、遗传转化技术的发展现状随着生物技术的不断进步，植物遗传转化技术也得到了广泛应用，取得了许多重要成果。
目前常用的植物遗传转化技术包括农杆菌介导的转化、基因枪介导的转化、电击法等。
农杆菌介导的转化是最常用的植物遗传转化技术之一，利用农杆菌通过水分或创伤进入植物细胞，将外源基因导入植物基因组。
该技术具有高效性和选择性，并且适用范围广泛，在获得转基因植株方面具有重要作用。
基因枪介导的转化是一种直接将外源DNA通过高速银粒枪或金粒枪射入植物组织的方法。
该技术能够克服农杆菌介导的转化对组织的要求较高的限制，使得更多的植物种类能够进行遗传转化。
电击法是一种利用暴露在电场中的植物细胞的特定瞬间可逆孔效应，使得外源DNA通过电穿孔方式导入细胞的方法。
该技术常用于难以转化的植物种类，如谷物、树木等。
植物的遗传改良与转基因技术
转基因植物的应用领域
01 抗病虫害
转基因植物具有抗病虫害能力，减少农药使 用
02 耐逆性
转基因植物对环境逆境有较强的适应能力
03 提高产量
转基因技术可以增加植物的产量，提高农作 物产量
转基因技术的争议
01、
安全性问题
转基因食品对人体安全性存在争议
部分人担心转基因食品可能引发健康问题
03、
02、
● 04
第四章 植物的基因编辑技术
基因编辑技术的 原理
基因编辑技术是一种 通过编辑植物基因组 中的特定位点，实现 精准基因改良的技术。 通过定点编辑，可以 准确调整植物的遗传 特性，进而培育出具 有目标性状的植物品 种。
基因编辑技术的应用
快速培育植 物品种
提高育种效率
增加植物抗 病能力
提高生存率
植物遗传改良是指通 过选择、杂交和变异 育种等手段改善植物 的遗传性状，以提高 产量、抗逆性等特性。 在农业生产中，植物 遗传改良起着关键作 用，帮助人类获取更 好的作物品种。
植物遗传改良的历史
农业起源时 期
人类最早开始进 行植物遗传改良
现代育种技 术
运用现代科学技 术加速植物遗传
改良进程
遗传学发展
精准改良遗 传特性
实现目标性状
基因编辑技术的前景
基因编辑技术为植物遗传改良带来了新的可能性， 有望进一步提高植物的遗传性状。随着技术的不 断发展，植物育种领域将迎来更多创新与突破。
基因编辑技术的挑战
01、
伦理挑战
涉及植物基因改良的道德问题
影响与利益的平衡
02、
法律限制
监管标准的制定与遵守
植物基因改良的法律法规
植物遗传改良对于实 现粮食安全、保护生 态环境等方面具有重 要意义。然而，也面 临着来自社会、伦理 和科技等多方面的挑 战。
植物遗传改良技术
植物遗传改良技术植物遗传改良技术是一种利用现代生物技术手段对植物进行遗传改造的方法。
通过对植物的基因进行修改和选择性育种，可以改良植物的性状，提高产量、抗病能力及适应力等，从而满足人类对农作物的需求。
本文将介绍植物遗传改良技术的原理、方法及应用。
一、植物遗传改良技术的原理植物遗传改良技术基于植物的遗传信息，通过修改植物的基因组来改变其性状。
遗传改良的目标可以是单一性状的改进，也可以是多个性状的综合改良。
其原理主要包括以下几个方面：1. 基因工程技术：利用基因工程技术可以将外源基因导入植物细胞，从而使其表达具有特定功能的蛋白质。
这种方法可以用于增加植物的抗病性、耐逆性等性状，并且有助于提高植物的产量。
2. 突变育种：通过人工诱发植物的基因突变，从中选择出具有期望性状的变异体，然后进行交配选育。
这种方法可以用于改善植物的花期、果实质量等性状。
3. 细胞器遗传改良：植物细胞质遗传不仅通过细胞核的遗传信息决定，还受到细胞质遗传的影响。
通过改良植物细胞质的遗传信息，可以影响植物的性状。
目前，已经成功将外源DNA导入植物质体和线粒体中，提高了植物对病害和逆境的抵抗能力。
二、植物遗传改良技术的方法植物遗传改良技术有多种方法，主要包括以下几种：1. 基因编辑技术：通过使用诸如CRISPR/Cas9等基因编辑工具，可以直接修改植物基因组的DNA序列，实现对目标基因的精确编辑。
这种方法具有高效、快速的特点，并且可以实现单个基因的靶向修改。
2. 转基因技术：通过将外源基因导入植物细胞中，使其表达具有特定功能的蛋白质。
这种方法可以通过农杆菌介导转化、基因枪等技术实现。
转基因技术可以用于提高植物的抗病性、抗虫性、耐逆性等性状。
3. 选择育种：通过对植物的繁殖材料进行选择，选择具有期望性状的个体进行交配。
这种方法是传统育种技术的一种延伸，可以通过对性状的选择来改良植物。
三、植物遗传改良技术的应用植物遗传改良技术在农业生产中有着广泛的应用前景。
植物遗传转化
从1986年首批转基因植物被批准进入田间试验
，至今国际上已有30个国家批准数千例转基因
植物进入田间试验，涉及的植物种类有40多种 。主要包括延熟番茄 , 抗除草剂的玉米、棉花 、大豆和油菜,抗虫的马铃薯、棉花和玉米,抗 病毒的西葫芦、南瓜和番木瓜 , 雄性不育的玉 米和莴苣 , 以及改变油脂特性的油菜和大豆等 。
。
优点： 不受宿主范围的限制 操作简便 成本底 缺点： 一般只适用于原生质体的转化，而原生质体 再生植株并不容易，转化效率低; 再生植株常不可育或形态异常、多拷贝插入等 现象。
• 花粉管通道法 利用开花植物授粉后形成的花粉管通道，直接将 外源目的基因导入尚不具备正常细胞壁的卵、合子或 早期胚胎细胞，实现目的基因的转化。 步骤： １）去除花冠; ２）用微量注射器从断面沿花柱中轴插入子房长度的约 １／４处，再退回２毫米左右; ３）注入含外源目的基因的缓冲液; ４）正常管理，收获种子, 经筛选获得转基因植株。
转基因块茎中花色苷含量分析
一种基于同源重组构建多基因双元载体的方法张兴国按目的基因导入位置细胞核叶绿体按启动子的类型组成型启动子特异性启动子遗传转化的主要方法农杆菌介导的遗传转化基因枪法电击法注射法化学药剂诱导转化花粉管通道法根癌农杆菌ti质粒转化系统外植体农杆菌共培养芽诱导抗生素筛选生根培养植株再生分子检测转基因植株获得技术特点
整合后外源基因结构变异小
操作简便等优点
该技术已成为转化成功最多的一种转化方法
• 基因枪法(particle gun) 又称微弹轰击法 (microprojectile bombardment或 particle bombardment) 。 该法借助高速运动的金属 粒子将附着于其表面的核 酸分子引入受体细胞，外 源基因进入受体细胞核后 整合到染色体组，然后通 过组织培养再生出完整个 体(植株)。
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植物遗传转化载体
作为植物遗传转化的载体，必须具有两种功能： 1.它能作为媒介将外源基因导入植物细胞中去，并 且整合到宿主细胞的基因组DNA上； 2.它能提供被寄主细胞的复制和转录系统所识别的
DNA序列。
农杆菌的Ti质粒
人们很早就发现双子叶 植物常发生一种冠瘿瘤 病，该病在法国、东欧 和意大利的葡萄和果树 上曾大面积发生。 1907 年 首 先 发 现 这 种 冠 瘿瘤病是由根癌农杆菌 引发的。
Ti质粒的改造-去除致瘤基因Onc
• 由于影响植株再生的直接原因是T-DNA中的Onc基因 的致瘤作用，因此，切除其致瘤基因，使成为无毒 的质粒，即“卸甲”、“解除”、“缴械”其“武 装”的Ti载体，记为Onc-，构建的Onc-载体叫“卸 甲载体”。 • 卸甲载体：构建无毒的Ti质粒载体 • 例：pGV3850:是从胭脂碱Ti质粒PTIC58衍生而来的
双元载体转化系统
基于T-DNA转移机制的两种特点：
• 对T-DNA转移和整合到植物染色体中起顺式作 用的仅仅是其末端24个重复序列。 • 能引起T-DNA转移和整合的毒性区(vir)基因 产物起反式作用，即Vir基因不必与T-DNA末 端重复序列位于同一质粒上，可由另一种质 粒提供。
双元载体转化系统-穿梭载体
第四章 植物遗传转化技术
植物遗传转化
• 植物遗传转化是指以植物器官、组织、细 胞或原生质体作为受体，通过某种技术或 途径转入外源基因，获得使外源基因稳定 表达的可育植株的过程。
植物遗传转化方法
植物遗传转化常用的方法 1、载体法转化——农杆菌介导法（Ti 质粒） 2、非载体介导的遗传转化 （1）基因枪法 （2）超声波法 （3）脂质体法（又称融合法） （4）电转化
重组载体
卸甲载体
共整合载体
一元载体转化系统-拼接末端载体
拼接末端载体（sp1it-end vecter ,SEV）
• 1985年建立的，因它的两个LIH序列在同源 重组前分别处于不同质粒上而得名。
MCS LIH nptⅡ Sper/Strr pMON200 nos基因 中间载体 TR-DNA 目的基因 pMON200
Ti质粒的上述特性成为农杆菌介导法植物遗传转化的重 要基础。
Ti质粒是根癌农杆菌染色体外的遗传物质；
双股共价闭合的环状DNA分子；
T-DNA能够插入到植物基因组中并能稳定表 达； 长度150-200KB；
植物基因工程常用的载体。
• 根据其诱导的植物冠瘿瘤中所合成的冠瘿 碱种类不同分： • 章鱼碱型（octopine） • 胭脂碱型（nopaline） • 农杆碱型（agropine） • 琥珀碱型（agrocinoine）
乙酰丁香酸 羟基乙物细胞
T-DNA的染色体 整合机制
表达 特异性核酸内切酶
在LB和RB的第三和第四个碱基之间切开
单链T-DNA整合在植物的基因组上
T-DNA的染色体整 合机制
Ti质粒 目的基因
天然Ti质粒存在的缺陷
中间表达载体的特性
中间表达载体
改良的Ti质粒 卸甲载体
T-DNA（Transfer DNA） 是农杆菌侵入植物细胞时从Ti质粒上转移到 植物细胞的一段DNA； T-DNA两端个有一段25bp的同向重复序列，是 T-DNA的边缘区。 LB；RB 在同一条单链的LB和RB内各形成一个缺口， 单链T-DNA进入植物细胞
植物根部
Ti 质粒致瘤的分子机制 损伤的植物根部会分泌 出乙酰丁香酸和羟基乙 酰丁香酸，它们能诱导 Ti质粒上的vir基因以及 根瘤菌染色体上的一个 操纵子表达。vir基因 产物将Ti质粒上的TDNA单链切下，而根瘤 菌染色体上的操纵子表 达产物则与单链T-DNA 结合形成复合物，后者 转化植物根部细胞。
左边界（LB）
pBR322（含AMPr）
胭脂合成酶基因（Nos) 右边界（RB）
卸甲载体
中间表达载体 • 中间载体：
带有重组T-DNA的大肠杆菌质粒的衍生载体 称为”中间载体” 原理：大肠杆菌具有能与农杆菌高效地接合 转移的特性 目的：把预先进行亚克隆、切除、插入或置 换的T-DNA引入Ti质粒中。
转化载体系统
一元载体系统
构
建
双元载体系统
存在缺陷
• Ti质粒分子量过大，一般在160～240kb，在基因工 程中难以操作； • 很难找到单一的酶切位点； • 生长在培养基上的植物转化细胞产生大量的生长素 和分裂素阻止了细胞再生长为整株植物； • Ti质粒只能在农杆菌中复制、繁殖而扩增，不能在 大肠杆菌中复制。 • Ti质粒上还存在一些对于T-DNA转移不起任何作用的 基因。
电镜下的根癌农杆菌 冠瘿瘤
1974年Zaenen等在根癌农杆菌内发现并分离
了一种与肿瘤诱导有关的大型质粒（大于
200kb），称为Ti质粒。
1977年Chilton等在研究农杆菌侵染后形成的植物肿瘤细 胞时，用分子杂交发现在肿瘤细胞中存在着农杆菌Ti质 粒的一个片段，称为T-DNA（Transfer-DNA）。 实验表明，T-DNA转移到植物细胞后整合进植物基因组中 并得以表达，从而导致了冠瘿瘤的发生。进一步研究发 现，整合到植物基因组中的T-DNA可以通过减数分裂稳定 地传给植物的后代。
• 花粉管导入法的特点是直接、简便。 • 受体材料为植株整体，省略了细胞组织培养 的诱导和传代过程，排除了植株再生的障碍， 特别适合于难以建立有效再生系统的植物。 • 由于转化的是完整植株的卵细胞、受精卵或 早期胚胎细胞，导入的DNA分子整合效率较高。
5 农杆菌介导
几乎所有的双子叶植物尤其是豆科类植物的 根部常常会形成根瘤，这是由于植物根部被一 种革兰氏阴性土壤杆菌农杆根瘤菌（A. tumefaciens）感染所致，其致瘤特性是由该 菌细胞内的野生型Ti （Tumor-inducing）质 粒介导的。
中间表达载体-选择标记
供植物转化体的选择标记： • 新霉素磷酸转移酶基因(nptⅡ) • 卡那霉素抗性基因(kanr) • 潮霉素B磷酸转移酶基因，可抗潮霉素 (hygr) • 氨苄青霉素抗性(Ampr) • 四环素抗性(Tcr ) • 庆大霉素抗性(Genr)
Cat（氯霉素乙酰移酶基因）
Cat也是应用得较多的一种报告基因。它来自 细菌转座子Tn9的氯霉素乙酰转移酶基因的 结构基因。
章鱼碱的遗传图
胭脂碱的遗传图
Ti质粒结构
T-DNA区、毒性区(vir)、质粒复制起点(ori)、质粒
结合转移位点(con)、冠瘿碱分解位点(ocs or nos)
Ti质粒结构
生长素合成基因
Onc基因
细胞分裂素合成基因 冠瘿碱合成基因合成基因
左边界LB
右边界RB Con区
Vir基因
复制起始位点
Vir区（毒性区）：与T-DNA区彼此相邻，约占Ti质粒 总长度的1/3； 该区段上的基因与T-DNA从细菌转移到植物细胞的遗 传过程有关，区段上的基因能够使农杆菌表现毒性； Vir区段总长度约35kb，由7个互补群组成；
Ti 质粒的改造 1、除去T-DNA上的生长素（tms）和分裂素（tmr）生 物合成基因，因为大量的生长素和分裂素会抑止细胞再 生长为整株植物； 2、除去T-DNA上的有机碱生物合成基因（tmt）；因为 有机碱的合成大量消耗精氨酸和谷氨酸，影响植物细胞 的生长； 3、除去 Ti 质粒上的其它非必需序列，最大限度地缩短 载体的长度； 4、安装大肠杆菌复制子，使其能在大肠杆菌中复制， 以利于克隆操作； 5、安装植物细胞的筛选标记，如 neor 基因，使用植物 基因的启动子和polyA化信号序列； 6、安装多聚人工接头以利于外源基因的克隆。
毒性区中各位点的表达情况分为两种：
组成性表达
植物诱导性表达
Vir基因的功能：
诱导根癌农杆菌附着到植物受伤的部位上– VirA蛋白； 产物诱导T-DNA形成单股DNA片段--VirD蛋白； 将T-DNA转入植物细胞，整合到寄主基因组中-VirD、E蛋白； T-DNA基因被表达，使植物细胞增殖并产生冠 瘿碱。
3 融合法 将外源DNA与特殊的疏水性高分子化合物混 合，在水中这些疏水性化合物分子形成球状的 脂质体，后者与植物细胞原生质体融合，筛选 融合子，再生植物细胞壁。 所有涉及到植物原生质体的基因转化方法均 存在一个难题，即：原生质体再生出整株植物 比较难。
4 花粉管导入法 外源DNA沿着花粉管经过珠心进入尚未形 成正常细胞壁的卵、合子或早期胚胎细胞中， 从而实现基因的转移。 这一方法是我国科学家周光宇首先提出设 计的，目前已应用于水稻、小麦、棉花、大 豆、花生、蔬菜等作物的转基因研究。
多克隆位点
大肠杆菌质粒
重组质粒 农杆菌筛选标记
共整合转化 程序
农杆菌
大肠杆菌筛选标记
转化
大肠杆菌
细菌接合
T-DNA区同源整合
农杆菌
感染植物根部细胞
T-DNA区整合在植物细胞基因组上
一元载体转化系统-特点
• 由两个质粒（E.coli质粒和Ti质粒）重组而成， 分子量较大； • 共合体的形成频率与两个质粒的重组频率有关, 相对较低； • 必须用Southern杂交或PCR对大的共整合体质粒 进行检测； • 构建时比较困难。
TL-DNA部分序列
卸甲载体
pTiB6S3
LIH
Kanr
pMON200
中间载体
同源重组
转基因整合到植物基因组中
一元载体转化系统-pGV3850与SEV比较
共同点:
两者都是通过受体Ti质粒与中间载体同源重组 而形成，故同属于一元载体系统。 不同点： • 受体Ti质粒与中间载体的结构不同。 • 同源序列不同。 • SEV是更有效的共整合载体。
• 中间表达载体：是由中间载体（含选择标记） 加上能在植物细胞中表达的启动子及目的基 因构成，也就是嵌合基因插入中间载体后构 成。 • 嵌合基因（chimeric gene） 就是来自两种或两种以上生物的启动子、 结构基因、终止子连接在一起构成基因。