免疫印迹实验步骤及问题解决

免疫印迹实验步骤及问题解决

一、实验步骤

试剂和缓冲液

1x RIPA 缓冲液: 50 mM Tris，150 mM NaCl，0.1% SDS，0.5% SDS，1% Triton X-100 或NP40. 1x PBS 缓冲液: 137 mM NaCl，2.7 mM KCl，2.7 mM Na2HPO4，2.7 mM KH2PO4，pH 7.4 BCA或Bradford蛋白分析试剂盒

1.5 M Tris缓冲液（pH 8.8）: 90.68 g Tris-HCl to ddH2O，500 ml溶液pH调节到8.8

1.0 M Tris缓冲液（pH 6.8）: 60.58 g Tris-HCl to ddH2O，500 ml溶液pH调节到6.8

10% APS: 100 mg AP 溶于1 ml ddH2O。用前准备

10% SDS: 10 g SDS溶于100 ml ddH2O。

1x Tris-甘氨酸电泳缓冲液: 25 mM Tris，230 mM 甘氨酸（pH 8.3），0.1% SDS。

3x SDS蛋白加样缓冲液: 150 mM Tris （pH 6.8），6% SDS，30% 甘油，30 mM EDTA和0.2% 溴酚蓝

1x TTBS: 25 mM Tris（pH 7.5）: 0.15 M NaCl，0.05% Tween-20，0.001% 硫柳汞

1x 转移缓冲液: 3 g Tris，14.4 g甘氨酸和200 ml甲醇，加ddH2O 到1L

样品准备

细胞培养样品

贴壁细胞

去除培养基，用1X PBS冲洗去掉残留培养基

加入预冷的400 ul-1 ml 1X RIPA缓冲液/100 mm平皿。在冰上孵育5-10 min。

完全刮下细胞并转移到在冰上预冷的1.5 ml离心管中。

（可选）充分混匀或超声处理。

4°C下12,000 rpm离心10-15 min并收集上清

总蛋白用前需储存在-20°C。

悬浮细胞

（可选）取出100 ul细胞培养也进行细胞计数。

将细胞转移到预冷的1.5 ml或15 ml离心管2000 rpm 4°C离心5 min。

去除培养基并用1 ml预冷的1x PBS重悬细胞，然后转移到1.5 ml离心管中。

2000 rpm 4°C离心5 min。

用1 ml预冷的RIPA 缓冲液/107细胞重悬细胞

细胞悬液在冰上孵育并摇床30 min，或充分混匀或超声处理。

4°C 12000 rpm离心10-15 min收集上清备用。

总蛋白需要在用前储存在-20°C 。

组织

组织准备和定量。将组织切成小块。

加入500-600 ul预冷的1x RIPA缓冲液/100 mg 组织。

将组织充分混匀

4°C 12000 rpm离心15-20min。

收集上清。

总蛋白在用前应储存在-20°C。

蛋白定量

Bradford分析和BCA分析请查看来邦的综述蛋白定量。

SDS-PAGE

聚丙烯酰胺凝胶

上样和电泳

2X SDS蛋白上样缓冲液与蛋白样品1:1充分混匀。

注胶前先将样品在50-60°C预热。预染Marker可用于监控蛋白分离和转移效率。

蛋白转移

将蛋白转移到PVDF或NC*膜上进行抗体检测

1.将电泳材料，如胶、whatman纸和海绵放入1X转移缓冲液中预先浸润.

2.PVDF膜应在甲醇中预先孵育10秒到1分钟，然后移入转移缓冲液中

3.将材料按如下顺序放置:板（黑色面），海绵，Whatman纸，胶，膜，Whatman纸，海绵，板（亮面）.

4.将转移装置安置好，黑色面对应黑色电极。

5.转移到冷的1X转移缓冲液中.电转电流和时间应该根据电泳装置的厂家说明推荐设置。

* NC膜不能用甲醇孵育。

将膜放入溶有5%脱脂奶粉的1x TBST中25°C孵育1小时（或在摇床上4°C孵育过夜）。抗体孵育

1.按照推荐浓度或根据结果优化浓度，将一抗溶于1X TBST+3% BSA中。

2.在4°C孵育过夜或更长时间，或者在室温下4小时。

3.回收一抗，保存在4°C。然后在室温下在摇床上冲洗膜三次，每次5-10 min。

4.将二抗放入1X TBST中稀释，然后室温下孵育膜1小时，或4°C摇床上2-4小时。

5.在室温摇床上用TBST洗三次，每次10 min

ECL+ 系统和X-ray胶卷被用于HRP标记的二抗。

二、问题解决

没有信号，可能原因

检测的二抗用错了（明确一抗制备的宿主）

一抗或二抗的浓度太低（提高浓度再试一次）

一抗不能识别检测物种的蛋白（检查一抗的特异性）

上样蛋白量太少（增加样品的量）

转移效率太低（改进转移实验步骤。确保PVDF膜用之前用甲醇预孵育）

一抗已经被用很多次了（使用重新稀释的一抗）

封闭时间太长或者洗涤次数太多（减少封闭时间和洗涤次数）

检测试剂盒失效（加入阳性对照并确保试剂盒有效）

叠氮化钠可能抑制二抗（溶解缓冲液中应避免使用叠氮化钠）

一抗或二抗的孵育时间太短（延长孵育时间）

背景太亮

封闭时间太短或者封闭缓冲液有问题（延长封闭时间或者用BSA代替脱脂奶粉）。

一抗或二抗浓度太高。（降低抗体浓度）

洗脱不充分（增加洗脱次数）

孵育温度太高（确保一抗在4°C孵育）

膜使用错误或者膜已经干了（避免膜变干）

白色条带或者信号消失很快

一抗或二抗浓度太高（降低抗体浓度）