蛋白质浓度的测定

实验九蛋白质浓度的测定(四)──考马斯亮蓝染色法

目的要求

学习考马斯亮蓝（Coomassie Brilliant Blue）法测定蛋白质浓度的原理和方法。

实验原理

考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质―染料结合的原理，定量的测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方法。

考马斯亮蓝G―250存在着两种不同的颜色形式，红色和蓝色。它和蛋白质通过范德华力结合，在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律（Beer’s law）。此染料与蛋白质结合后颜色有红色形式和蓝色形式，最大光吸收由465nm变成595nm，通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。

蛋白质和染料结合是一个很快的过程，约2min即可反应完全，呈现最大光吸收，并可稳定1h，之后，蛋白质―染料复合物发生聚合并沉淀出来。蛋白质―染料复合物具有很高的消光系数，使得在测定蛋白质浓度时灵敏度很高，在测定溶液中含蛋白质5µL/ml时就有0.275光吸收值的变化，比Lowry法灵敏4倍，测定范围为10－100µg蛋白质，微量测定法测定范围是1－10µg蛋白质。此反应重复性好，精确度高，线性关系好。标准曲线在蛋白质浓度较大时稍有弯曲，这是由于染料本身的两种颜色形式光谱有重叠，试剂背景值随更多染料与蛋白质结合而不断降低，但直线弯曲程度很轻，不影响测定。

此方法干扰物少，研究表明：NaCl，KCl，MgCl2，乙醇，（NH4）2SO4无干扰。强碱缓冲液在测定中有一些颜色干扰，这可以用适当的缓冲液对照扣除其影响。Tris，乙酸，2―巯基乙醇，蔗糖，甘油，EDTA及微量的去污剂如Triton X―100，SDS，玻璃去污剂有少量颜色干扰，用适当的缓冲液对照很容易除掉。但是，大量去污剂的存在对颜色影响太大而不易消除。

试剂与器材

一、试剂

考马斯亮蓝试剂：

考马斯亮蓝G―250 100mg溶于50ml95%乙醇中，加入100ml85%磷酸，用蒸馏水稀释至1000ml，滤纸过滤。最终试剂中含0.01%(W/V)考马斯亮蓝G―250，4.7%(W/V)乙醇。

二、标准和待测蛋白质溶液

1．标准蛋白质溶液

结晶牛血清蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度用0.15mol/LNaCl 配制成1mg/ml，0.1mg/ml蛋白溶液。

2．未知蛋白质溶液。

三、器材

试管及试管架，移液管（0.1ml及5ml），UV－2000型分光光度计。

操作方法

一、标准法制定标准曲线

取14支试管，分两组按下表a平行操作。

绘制标准曲线：以A595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，在坐标纸上绘制标准曲线。

摇匀，1h内以0号管为空白对照，在595nm处比色

二、微量法制定标准曲线

取12支试管，分两组按下表b平行操作。

绘制标准曲线：以A595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，在坐标纸上绘制标准曲线。

摇匀，1h内以0号管为空白对照，在595nm处比色

三、未知样品蛋白质浓度测定

测定方法同上，取合适的未知样品体积，使其测定值在标准曲线的直线范围内。根据所测定的A595nm值，在标准曲线上查出其相当于标准蛋白的量，从而计算出未知样品的蛋白质浓度（mg/ml）。

注意事项

（1）（1）如果测定要求很严格，可以在试剂加入后的5－20min内测定光吸收，因为在这段时间内颜色是最稳定的。

（2）（2）测定中，蛋白－染料复合物会有少部分吸附于比色杯壁上，实验证明此复合物的吸附量是可以忽略的。测定完后可用乙醇将蓝色的比色杯洗干净。

思考题：

根据下列所给的条件和要求，选择一种或几种常用蛋白质定量方法测定蛋白质的浓度：

（1）（1）样品不易溶解，但要求结果较准确。

（2）（2）要求在半天内测定60个样品。

（3）要求很迅速地测定一系列试管（30支）中溶液的蛋白质浓度。

实验三、考马斯亮蓝染色法测定蛋白质浓度

目的要求

1、学会蛋白质含量的测定方法。

2、掌握该测定方法的基本原理和优缺点。

原理

考马斯亮蓝(Coomassie Brilliant Blue)测定蛋白浓度，是利用蛋白质一染料结合的原理。考马斯亮蓝G-250存在着两种不同颜色形式，红色和蓝色。此染料与蛋白质结合后颜色由红色形式转变成蓝色形式，最大光吸收由465nm变成595nm。在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律(Beer’s law)，因此可以通过测定染料在595nm处光吸收的增加量得到与其结合的蛋白质量。蛋白质和染料结合是一个很快的过程，约2 min即可反应完全，呈现最大光吸收，并可稳定1 h左右，因此测定过程快速，且不需要严格的时间控制。蛋白质染料复合物具有很高的消光系数，使得在测定蛋白质浓度时灵敏度很高，在测定溶液中含蛋白质5μg/mL时就有0.275光吸收值的变化，比Lowry法灵敏4倍，测定范围为10-100μg蛋白质，微量测定法测定范围是1-10μg蛋白质。此反应重复性好，精确度高，线性关系好。标准曲线在蛋白质浓度较大时稍有弯曲，这是由于染料本身的两种颜色形式光谱有重叠，试剂背景值随更多染料与蛋白质结合而不断降低，但直线弯曲程度很轻，不影响测定。

此方法干扰物少，研究表明:NaCl、KCl、MgCl2、乙醇、(NH4)2SO4不干扰测定。强碱性缓冲剂在测定中有一些颜色干扰，可以通过适当的缓冲液对照扣除其影响。Tris、乙酸、α-巯基乙醇、蔗糖、甘油、EDTA、微量的去污剂（如Triton X-100，SDS）和玻璃去污剂均有少量颜色干扰，用适当的缓冲液对照很容易除掉。但是，大量去污剂的存在对颜色影响太大而不易消除。

由于该法简单、迅速、干扰物质少、灵敏度高，现已广泛应用于蛋白质含量测定。

试剂和器材

1试剂

(1)标准蛋白质溶液

结晶牛血清白蛋白，预先经微量凯氏定氮法或按牛血清白蛋白

1%

1cm

OD

=6.6测定蛋白质

含量，再用0.15 mol/L NaCl配制成1 mg/mL，0.1 mg/mL蛋白溶液。

(2)考马斯亮蓝试剂

考马斯亮蓝G-250 100 mg溶于50 mL 95%乙醇中，加入100 mL 85%磷酸，用蒸馏水稀释至1000 mL，滤纸过滤。最终试剂中含0.01%(W/V)考马斯亮蓝G-250，4.7%(W/V)乙醇，8.5%(W/V)磷酸。