重组门冬酰胺酶表达制备纯化方法
重组l-门冬酰胺酶的提取纯化工艺
重组l-门冬酰胺酶的提取纯化工艺介绍如下:
L-门冬酰胺酶是一种能够将L-门冬氨酸催化转化为（S）-去羧肟丙氨酸的酶，具有极大的应用潜力。
本文将介绍一种可行的重组L-门冬酰胺酶的提取纯化工艺。
1.酶表达及收获：利用基因重组技术，将L-门冬酰胺酶基因克隆进入大肠杆菌中表达。
将表达产物通过超声波破碎将细胞内的酶抽出并离心，上清液即是未纯化的粗酶液。
2.酶列层析：未纯化的粗酶液在硫酸铵饱和度为70%的情况下进行酶柱层析，选用阳
离子交换层析分离酶的分子量和荷电性质，如Q-Sepharose FF层析柱。
将符合条件的酶进行批量收集，去除未得到的酶和杂质。
3.碘盐化学修饰：经过第一次纯化后，酶的纯度和活性仍然不够高，需要进行进一步
的纯化。
碘盐处理可以提高酶的稳定性和特异性，有助于去除表型或变形的酶。
将适量的KI添加到酶液中，在适当pH和温度下干燥，直至酶不再吸收碘化物。
4.透析纯化：将经碘盐处理的酶溶解在透析缓冲液中，在温和的离子强度和pH条件
下进行亲和层析，可以去除KI和其它大分子的杂质，提高酶液的纯度。
该阶段的纯化大量使用隔膜，有选择性地对酶进行分离和缓冲溶液交换。
5.尿素剪切：通过尿素等离子体进行酶剪切工艺，可以去除酶的表面氨基酸，去除肽
链信号，提高酶的纯度和催化活性。
酶剪切后，可以进一步通过透析等工艺进行纯化。
以上是一种可行的重组L-门冬酰胺酶的提取纯化工艺流程，这个工艺流程可以根据酶的性质和制备目的进行改变和改进，以做到最佳的提取效果。
门冬酰胺酶的制备与分析
门冬酰胺酶的制备与分析重组天冬酰胺酶的制备、纯化与鉴定赵雅嫱黄妤璠龙益如王敏敏⽩华⼭1 原理本实验主要是利⽤基因⼯程⼿段构建L-天冬酰胺酶基因⼯程菌。
L-天冬酰胺酶的⽣理作⽤主要体现于其抗癌抗肿瘤活性，特别是对⾮霍奇⾦淋巴瘤和ALL 的有很强的抑制作⽤，⽬前适⽤于治疗⿊⾊素瘤、⾮何杰⾦病淋巴瘤等，也可以⽤于治疗急性单核细胞性⽩⾎病、慢性淋巴细胞性⽩⾎病等。
⽬前，我国虽已投⼊⽣产L-天冬酰胺酶，但是较国外⽣产成本⾼、菌种产酶活性低，提取纯化⼯艺落后。
针对这些问题，本实验对⼤肠杆菌重组L-天冬酰胺酶的制备、纯化与鉴定进⾏了系统性的探究，意图改进重组L-天冬酰胺酶的表达，优化其纯化⼯艺，分析其鉴定⽅法与性质。
本实验主要进⾏了重组克隆载体和表达载体构建、表达与鉴定的摸索；酶蛋⽩的诱导表达条件分析；酶蛋⽩分离纯化⼿段的⽐较和选择，如蔗糖溶液提取、硫酸铵分级沉淀、CM-Sephadex和DEAE-Sepharose离⼦交换层析以及亲和层析；重组蛋⽩酶活⼒监控与本底蛋⽩活⼒测定等等。
2 实验材料实验仪器见表1.1。
型号和⽣产⼚家根据实验室现有条件核定。
表1.1 实验仪器或装置仪器名称型号⽣产⼚家超净⼯作台PCR扩增仪恒温培养箱超低温冰箱台式离⼼机恒温摇床涡轮振荡器⾼压灭菌锅蛋⽩电泳仪核酸电泳仪凝胶成像仪紫外分光光度计⾼效液相⾊谱仪扫描型紫外分光光度计制冰机超声清洗机实验试剂和材料见表1.2。
材质或规格以及来源根据实验需求以及实验室现有条件核定。
表1.2 试剂和材料试剂或材料材质或规格来源E.coli 野⽣型菌株CPU21009 实验室储存pMD18-T 50ng/µl 宝⽣物⼯程有限公司pET-22b 50ng/µl 宝⽣物⼯程有限公司Nde Ⅰ10U/µl 宝⽣物⼯程有限公司Xho Ⅰ10U/µl 宝⽣物⼯程有限公司T4 DNA Ligase 350U/µl 宝⽣物⼯程有限公司DNA纯化试剂盒离⼼柱型天根⽣化科技（北京）有限公司Ni-NTA树脂纯化试剂盒离⼼柱型天根⽣化科技（北京）有限公司质粒提取试剂盒离⼼柱型天根⽣化科技（北京）有限公司胶回收试剂盒离⼼柱型天根⽣化科技（北京）有限公司CaCl260mmol/L 实验室储存PBS 50x 实验室储存NaCl 分析纯Taq 酶 Mix 分析纯(NH4)2S2O8分析纯C 2H6OS 分析纯CH4O 分析纯冰⼄酸分析纯C 2H6O 分析纯氨基丁三醇分析纯考马斯亮蓝分析纯SDS 分析纯Nessler's 试剂Reagent,ACS 美国Spectrum公司酵母粉分析纯L-天冬酰胺分析纯英国OXOID公司蛋⽩胨分析纯⽢氨酸分析纯琼脂糖分析纯葡萄糖⾷品级TEMED 优级纯溴酚蓝分析纯IPTG 优级纯丙三醇分析纯3 实验思路与步骤本实验设计从⼤肠杆菌野⽣型菌株CPU210009中提取总DNA，通过PCR 扩增⽬的基因ansB，随后对PCR产物进⾏纯化。
胞内门冬酰胺酶实验讲义 (中文版)
实验一重组表达门冬酰胺酶II工程菌的构建【实验目的】1. 了解构建重组质粒的原理2. 掌握质粒提取方法、PCR技术、酶切等基本技术方法【实验原理】门冬酰胺酶，别名L-门冬酰胺酶、天冬酰胺酶或天门冬酰胺酶。
L-天冬酰胺是细胞合成蛋白质的必需氨基酸。
肿瘤细胞中的天冬酰胺合成酶含量非常低，故自身不能合成L-天冬酰胺，需依赖外源L-天冬酰胺才能生存。
而L-天冬酰胺酶可通过降解L-天冬酰胺从而抑制肿瘤细胞中蛋白质的正常合成，导致肿瘤细胞的死亡。
人体内正常细胞则因能自身合成L-天冬酰胺，所以受L-ASP的影响较小。
故L-ASP可用于急性淋巴细胞白血病的治疗。
目前临床上使用的L-ASP 泛指来源于大肠杆菌的 E.coli L-ASP II。
从1974年天津生化制药厂开始生产L-ASP，到1995年吴梧桐教授等进行的E.coli天冬酰胺酶ansB基因的克隆和表达研究，并首次在国内成功构建了高效表达L-ASP的基因工程菌pKA/ CPU210009，工程菌发酵单位比野生株高出100倍。
随后又优化了基因工程菌的培养条件和发酵工艺，确定了重组L-ASP 的纯化路线，并对重组产品进行了鉴定。
L-ASP的制备纯化工艺越来越成熟，这些研究成果为我国工业化生产优质、低价的注射用E. coli L-ASP开辟了新的道路。
聚合酶链式反应，简称PCR。
聚合酶链式反应是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，利用DNA变性和复性的特点，由高温变性、低温退火（复性）及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增，具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。
双酶切：在进行PCR扩增时候，给引物两端设计好酶切位点，一般说来，限制酶的选择非常重要，尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶，如BamHI，HindIII，提前看好各公司的双切酶所用公用的BUFFER，以及各酶在公用BUFFER里的效率。
选好酶切位点后，在各个酶的两边加上保护碱基。
门冬酰胺酶产生菌工艺流程
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L-门冬酰胺酶(Asp)新纯化工艺项目总结
L-门冬酰胺酶（Asp）新纯化工艺项目总结1项目背景L-门冬酰胺酶(L-asparaginase: Asp)是一种酰胺基水解酶，是从大肠杆菌菌体中提取分离的酶类药物，它能专一地水解L-门冬酰胺生成L-门冬氨酸和氨，是一种重要的抗肿瘤药物，临床适用于治疗急性淋巴细胞性白血病、急性粒细胞性白血病、急性单核细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、何杰金病及非何杰金病淋巴瘤、黑色素瘤等。
尤其是对儿童急性淋巴细胞性白血病（ALL）的诱导缓解期疗效最好。
目前生产门冬酰胺酶的工艺很多，纯化工艺更是千差万别。
以往的研究一般仅局限于实验室制备或小批量生产，经过复杂的纯化步骤获得纯度及活性符合要求的产品，但收率低，成本高，特别是操作成本占整个纯化成本的很大部分。
如果不考虑产品成本，仅为获得符合要求的产品，上述数种工艺尚还可行，但是从获取生产利润的角度这些工艺就不可行，而且在所有这些工艺中，生产过程的复杂性成为规模化生产的制约因素，如何开发即简洁又具有实际操作性的新生产工艺，实现Asp生产的规模化，获得高纯度、高活性、高收率的目标产品成为我们所要研究的课题。
公司自生产Asp以来，一直采用初期研发阶段的生产工艺，步骤复杂、操作成本高、生产能力受限。
基于此我们从探索方便、简洁、高效的生产工艺入手，主要在纯化过程及精制过程两方面对现有工艺进行改进。
2新工艺介绍新工艺分以下几步：（1）丙酮粉制作：将丙酮、离心后的湿菌体按2：1（v/w）比例混合，搅拌20～30min，离心，过筛，自然晾干得丙酮干粉（2）抽提：将丙酮干粉与抽提buffer按1：20（w/v）比例混合，37℃，搅拌1～1.5hr，得抽提液（3）纯化：抽提液加适量1M MnCl2溶液(1.5ml/g powder)，沉淀菌体碎片及核酸，离心取上清；以1M Tris buffer调上清pH值至8.0，沉淀析出，离心取上清；加入0.5倍体积的乙醇，搅匀静置过夜，沉淀杂蛋白，离心得上清；再加入0.5～0.75倍体积的乙醇，静置沉淀6～8 hr，离心得沉淀。
重组门冬酰胺酶表达制备纯化方法
重组门冬酰胺酶表达制备纯化方法重组门冬酰胺酶ⅱ的表达纯化与分析[导言]左旋门冬酰胺酶(lasparaginase,lsp)是淋巴系统恶性肿瘤化疗方案中的一个很主要的药物,应用日趋广泛。
然而,lsp可产生多种毒副作用,包括急性胰腺炎、药物性糖尿病、过敏反应、凝血功能障碍、肝功能损害等,在一定程度上限制了lsp的临床应用,尤其对于曾出现上述不良反应的患儿的后续治疗还能不能再用lsp,就成为一个急需解决的问题。
目前国内所有化学治疗中应用的ecii主要是依赖进口,完成表达ecii的基因工程菌株构建,并逐步进行ecii的工业化生产,对于国内all的临床化疗有积极意义。
为此,我们克隆了ecii的基因,在大肠杆菌中获得了高效表达,并探讨了其突变复性及后续纯化的简便方法。
国内亦开展了类似的工作。
[目的要求]1．了解基因工程菌发酵培养、分泌表达酶蛋白及表达酶蛋白纯化、分析鉴定的基本原理。
2.掌握工程菌发酵培养、酶蛋白重组天冬酰胺酶II分泌表达、表达酶蛋白制备、酶活性测定、SDS-PAGE电泳鉴定的工作原理和技术方法。
【实验原理】利用微生物，尤其是大肠杆菌生产L-天冬酰胺酶的研究已经非常广泛和深入。
大肠杆菌可产生两种天冬酰胺酶，即L-天冬酰胺酶I和L-天冬酰胺酶II，分别由其染色体上的基因ansa和ansB编码。
只有L-天冬酰胺酶II具有抗肿瘤活性。
L-天冬酰胺酶II在美国、德国和日本销售。
中国天津生化厂于1974年投入运行，随后因菌株降解和产量下降而停产。
目前，国内药品都是进口的。
1995年，我院构建了一株高效分泌和表达L-天冬酰胺酶II的基因工程菌株。
在大肠杆菌细胞中合成重组L-天冬酰胺酶II（RL ASP II）并分泌到周质中。
表达的RL-ASP的相对分子量ⅱ 其最大紫外吸收值为278nm。
本实验以此工程菌为材料采用蔗糖溶液渗透振扰提取法和酶解法联用提取周质中的rl-aspⅱ，再用硫酸铵分级沉淀、deae-52阴离子纤维素交换层析等步骤提取和纯化，得到较高纯度表达产物rl-aspⅱ。
门冬酰胺酶用DEAE—SephadexA—590层析法纯化的研究
典 注射 用标 准 ， 粗 品毒性 试验 不能通 过 。 而 日本 同 类 产 品 的 比活 力 为 ２ ０ｕ ｍｇ 其 ＨＰ Ｃ 图谱 见 图 ３ ５ ／ ， Ｌ 。
市场 上推 广 ， 目前用 药全 依 赖 进 口。为 降 低 １的 毒
性 ， 达 到 国外 同类 产 品 质 量 要 求 ， 文 对 １的 纯 化 以 本
进 行 了研 究
１ 仪器 与试药
１粗 品 （ 公 司 实验 室提 供 ， 价 １０ ／ ， 本 效 ０ ０ｕ ｍｌ比活 力 １ ０ ５
０ ５ ｍｌｍｉ ． ／ ｎ。
２ ３ 酶 的 转 化 ．
２ ３ 装 有 ＤＥ ． ．１ ＡＥ— ｅ ｈ ｄ ｘ Ａ ０柱 （ ０× ４ ０ Ｓ ｐ ａ ｅ ５ ５ ０ ｍｍ ） ２ 用 ０ ｍｍｏ ／ Ｈ２ Ｏ ＮａＨＰ （ Ｈ７ ｏ 的 ｌ Ｌ Ｎａ Ｐ 一 ２ ０‘ｐ ． ）
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维普资讯
中 国医 药 工 业杂 志
Ｃ ｉｅ ｅＪ ｕ ｎ 】 ｆ ｈ ｒ ｃ ｕ ｉ ｌ ２ ０ ． ３ ３ ｈｎ ｓ ｏ ｒ ａ ｏ ａ ｍａ ｅ ｔ ａ ０ ２ ３ （ ） Ｐ ｃｓ
门冬酰胺酶生产工艺流程
门冬酰胺酶生产工艺流程
稿子一：
嗨，亲爱的小伙伴们！今天咱们来聊聊门冬酰胺酶的生产工艺流程，这可有趣啦！
你知道吗，一开始啊，得准备好多好多的原材料。
就像做菜一样，食材得选好。
然后呢，把这些原材料放进大大的反应釜里，让它们在一起好好地“玩耍”。
然后呀，经过一段时间的反应，会产生一些混合物。
这时候，就需要用各种神奇的过滤和分离设备，把我们想要的门冬酰胺酶从里面挑出来。
再接着，还要对挑出来的酶进行提纯和精制，把杂质都赶走，让它变得更加纯净和厉害。
怎么样，是不是感觉很神奇？这就是门冬酰胺酶的生产过程哦！
稿子二：
嘿，朋友们！今天来给你们讲讲门冬酰胺酶是怎么生产出来的哟！
呢，得有一群超级厉害的科学家和工程师们一起努力。
他们就像魔法师一样，要施展魔法把普通的东西变成宝贝。
在这个过程中，要时刻盯着各种数据，就像看着自己的宝贝孩子长大一样，不能有一点差错。
等反应进行得差不多了，就要把有用的东西和没用的东西分开，这可需要一些厉害的工具和技术。
之后呢，把它装在漂亮的小瓶子或者小袋子里，准备出发去帮助需要它的人们。
整个过程就像是一场奇妙的冒险，充满了挑战和惊喜。
是不是很有意思呀？
希望你们也能喜欢这个门冬酰胺酶的生产工艺流程的小故事！。
重组门冬酰胺酶Ⅱ的制备
重组门冬酰胺酶Ⅱ的制备摘要：L-天冬酰胺酶具有显著的抗肿瘤作用，尤其是广泛应用于儿童急性淋巴细胞白血病(ALL)的治疗。
采用渗透振扰破壁法、硫酸铵分级沉淀、乙醇分级沉淀、DEAE-纤维素层析等步骤提取和纯化重组L-门冬酰胺酶Ⅱ。
关键字：L-门冬酰胺酶Ⅱ;制备；分离;纯化；稳定剂1.L-天冬酰胺酶治疗ALL的作用机制L-天冬酰胺酶(E.C，3.5.1.1)是酰胺基水解酶，是1个广泛应用于儿童急性淋巴细胞白血病(ALL)治疗的酶类药物。
L-天冬酰胺酶在机体内可催化天冬酰胺的水解，生成天冬氨酸和氨，在大量的ALL病人中，其肿瘤细胞依赖外源性的L-天冬酰胺才能生存，而正常细胞自身能合成L-天冬酰胺。
L-天冬酰胺酶抗白血病的作用机制是它能够快速消耗血循环中的L-天冬酰胺，从而消耗肿瘤细胞合成蛋白质所必需的底物，快速抑制蛋白质合成，而不影响正常细胞，此即L天冬酰胺酶的选择性细胞毒作用。
[1]2.L-天冬酰胺酶的分离纯化工艺2.1酶的几种提取方法L-天冬酰胺酶最初是从豚鼠的血清中提取的，含量很低，后来开发发酵法生产，采用大肠杆菌;欧文菌以及粘质赛氏杆菌( serraliamarcescem)等产生菌制备。
大肠杆菌产生的L-天冬酰胺酶包括天冬酰胺酶I和天冬酰胺酶Ⅱ，其中天冬酰胺酶I没有抗癌活性，存在于细胞质中，而有抗癌活性的天冬酰胺酶Ⅱ则分泌到细胞周质中。
大肠杆菌来源的天冬酰胺酶的提取方法常用有冷丙酮干燥破壁、蔗糖溶液提取法和反复冻融法、超声破壁法等.2.1.1蔗糖溶液提取法向菌体细胞中加入5倍体积的蔗糖抽提液(蔗糖40%，溶菌酶200mg/L，EoTA10mmol/L，pH7·5)，在30C振荡2小时，8000r/min离心30分钟，收集上清酶液。
2.1.2冷丙酮干燥破壁法将菌体悬液倒入10倍量预先冷却的丙酮中，搅拌15分钟，5000r/min离心20分钟收集沉淀，于室温风干、研碎。
向菌体干粉中加入10倍体积0.0lmol/L，pH8.0硼酸缓冲液.于室温下搅拌30分钟，加入氯化锰溶液沉淀核酸，离心收集上清酶液。
重组酶的纯化方法[发明专利]
![重组酶的纯化方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/44565efe0b4e767f5bcfce01.png)
专利名称：重组酶的纯化方法专利类型：发明专利
发明人：尹焕才,蔺春茂,殷建申请号：CN202010620719.0申请日：20200701
公开号：CN111733145A
公开日：
20201002
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一种重组酶的纯化方法，包括以下步骤：1)收集完成重组酶表达后的菌株，洗涤；2)将洗涤后的菌体重悬，并破碎菌体；3)无需离心，直接将菌体破碎液水浴加热一段时间，再离心取上清，获得粗酶液；4)将粗酶液进行Ni柱纯化，收集目的蛋白洗脱液；5)超滤浓缩；6)对纯化后得到的重组酶进行酶活性和宿主DNA残留验证。
本发明的方法可获得高纯度DNA聚合酶，不仅可用于普通的PCR反应，在对反应条件要求较高的荧光定量PCR及数字PCR反应也可以有效使用；本发明可以应用到所有耐热DNA聚合酶的纯化流程，能减少相关实验的操作难度，且可以为工业化大规模生产提供借鉴和帮助。
申请人：济南国科医工科技发展有限公司
地址：250101 山东省济南市高新区综合保税区港兴三路北段1号济南药谷研发平台区3号楼401房间
国籍：CN
代理机构：北京远大卓悦知识产权代理事务所(普通合伙)
代理人：孔凡玲
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重组门冬酰胺酶制备表达纯化
重组质粒PKK233-ansB 的构建
• PcR 扩增后的DNA片段及质粒pKK 233 -2 同 时分别用限制酶Ncol 和Hindl 消化并用琼脂搪 凝胶电泳分离和回收质粒大片段；将消化后的 DNA 片段和电泳回收的质粒大片段用T 4.DNA 连接酶连接，连接产物经琼脂糖凝胶 电泳回收后转化HB 1 01 、71 / 15 、ATCc 9637 、JM107 、cPU 210009 ，筛选获得相 应的阳性转化子。
• L-天冬酰胺酶的鉴定（肽图分析） 取适量样品加入1%NH4HCO3溶解至1.0 mg/ml，按 1∶30(W/W)加入胰蛋白酶，37±0.5℃保温16 h，50%冰醋酸 终止反应备用。色谱条件 流动相：A为0.1%TFA 水，B为 0.1%TFA，乙腈∶水(80∶20)。梯度：0～60 min，B：0～ 30%；60～120 min，B：30%～38%；120～175，B：38%～ 80%。流速：0.2 ml/min；上样量：自动进样50 μl；检测波长： 210 nm。 • 酶活力的测定 取0．04mol/L L-天门冬酰胺1 ml , 0 . 1 mol/ L pH8.4硼酸一硼 酸钠缓冲液lml，取酶液0 .2ml于试管中，于37C水浴保温10min， 加15﹪三氯乙酸0.5ml终止反应，经4000r/min离心，取上清液 1ml,奈氏试剂2 ml和蒸馏水7 ml，放置15 min后于500nm波长比 色测定生成的氨。在上述条件下，每分钟催化L一天门冬酰胺水 解释放1umol氨所需的酶量定义为一个酶活力单位U。 • 1.3.7酶分子量测定 SDS-PAGE
酶类药物 --重组门冬酰胺酶Ⅱ表
达和制备
酶的分类
单纯蛋白质（多种氨基酸组成） 酶 结合蛋白质 酶蛋白（蛋白部分） 金属：如Cu2 ＋、Mn2＋ 金属有机物：如铁朴啉 辅酶或辅基 （非蛋白部分） 不含金属的有机物 如：烟酰胺、VB2等的衍生物 胞外酶 酶 胞内酶 游离酶 结合酶
重组门冬酰胺酶 设计性实验
目的
原理
方法
应用
原理
• • 1、提取 • 2、纯化 • • ①. 蔗糖溶液提取法： 离子交换层析： • • ②. 冷丙酮干燥破壁 • 亲和层析 • 法： • ③. 反复冻融法： • ④. 超声破壁法： 3．L-ASP的修饰：
聚乙二醇(PEG)修 饰的L-ASP： 单甲氧基聚乙二醇 (mPEG2)修饰的LASP：
目的原理ຫໍສະໝຸດ 方法应用• •
• •
• •
3．L-ASP的修饰： L-ASP来源于大肠杆菌，有较强的免疫原性，易在人体中产生针对L-ASP 的抗体，引发临床上常见的进行性免疫反应和全身性过敏反应等副作用。 另外，L-ASP制剂的抗肿瘤活性与其在体内的半衰期有关，天然的L-ASP 在体内易被蛋白酶水解，半衰期短，治疗效果差[10]。 3.1. 聚乙二醇(PEG)修饰的L-ASP： 利用PEG与L-ASP连接，从而改变这个酶的理化特性和生物学特性，进而 减少它的过敏反应。Soares[11]等利用中等分子量的PEG对大肠杆菌的L天冬酞胺酶进行修饰。研究结果表明，PEG-酶在PH3 .5 至pH 12.5的广 泛范围内保持稳定，而且在酸性介质中的稳定性大大增加，在pH3.5时维 持稳定1h。 PEG-酶在生理溶液中，65°1 h后，仍有32%的活性。体外 试验中，PEG-酶在人血清中，在40 mm内保持活性不变。同时冻干法处 理PEG-酶，不影响酶的催化活性。因此PEG对L-天冬酞胺酶的修饰，改 善了酶的理化特性和生物学特性，从而导致L-天冬酰胺酶的治疗特性的显 著改善。 3.2. 单甲氧基聚乙二醇(mPEG2)修饰的L-ASP： 国内的史凌洋[12]等使用活化的mPEG2对大肠杆菌的L-ASP进行修饰， 修饰过程中加人底物L-天冬酰胺保护酶的活性中心。得到的mPEG2-酶的 抗体结合能力消失，保留酶比活力32.8% ，酶的常温稳定性和热稳定性 均有显著提高。
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重组门冬酰胺酶Ⅱ的表达纯化与分析【引言】左旋门冬酰胺酶(Lasparaginase, L SP) 是淋巴系统恶性肿瘤化疗方案中的一个很主要的药物,应用日趋广泛。
然而,L SP 可产生多种毒副作用,包括急性胰腺炎、药物性糖尿病、过敏反应、凝血功能障碍、肝功能损害等,在一定程度上限制了L SP 的临床应用,尤其对于曾出现上述不良反应的患儿的后续治疗还能不能再用L SP,就成为一个急需解决的问题。
目前国内所有化学治疗中应用的EC II 主要是依赖进口, 完成表达EC II 的基因工程菌株构建, 并逐步进行EC II 的工业化生产, 对于国内ALL 的临床化疗有积极意义。
为此, 我们克隆了EC II 的基因, 在大肠杆菌中获得了高效表达, 并探讨了其突变复性及后续纯化的简便方法。
国内亦开展了类似的工作。
【目的要求】1．了解基因工程菌发酵培养、分泌表达酶蛋白及表达酶蛋白纯化、分析鉴定的基本原理。
2．掌握以基因工程菌种pANS2为材料进行工程菌发酵培养、分泌表达酶蛋白重组门冬酰胺酶Ⅱ及表达酶蛋白制备和酶活力测定、SDS-PAGE电泳分析鉴定的工作原理和技术方法。
【实验原理】L-门冬酰胺酶(L-asparaginase，3.5.1广泛存在于动物的组织、细菌、植物和部分啮齿类动物的血清中，但在人体的各种组织器官中的分布未见报道。
L-门冬酰胺酶活性形式为一同源四聚体，每一亚基由330个氨基酸组成，分子质量为34 564u，能专一地水解L-门冬酰胺生成L-门冬氨酸和氨。
由于某些肿瘤细胞缺乏L-门冬酰胺酶合成酶，细胞的存活需要外源L-门冬酰胺的补充，如果外源门冬酰胺被降解，则由于蛋白质合成过程中氨基酸的缺乏，导致肿瘤细胞的死亡。
因此，L-门冬酰胺酶是一种重要的抗肿瘤药物，多年来一直是小儿急性成淋巴细胞性白血病(Acute Lumphoblastic Leukaemia,ALL)和淋巴肉瘤(Lymphosarcoma)临床化疗中重要的配伍药物之一。
用微生物，特别是大肠杆菌来生产L-门冬酰胺酶已有广泛深入的研究。
大肠杆菌能产生2种天冬酰胺酶，即L-门冬酰胺酶Ⅰ和L-门冬酰胺酶Ⅱ，分别由其染色体上基因ansA和ansB 编码。
只有L-门冬酰胺酶Ⅱ才有抗肿瘤活性。
美、德、日均有L-门冬酰胺酶Ⅱ商品出售。
我国天津生化厂曾于1974年投产，后因菌种退化，产量降低而停产。
国内目前用药全靠进口。
1995年，本院构建了高效分泌表达L-门冬酰胺酶Ⅱ的基因工程菌，重组L-门冬酰胺酶Ⅱ(rL-ASPⅡ)在大肠杆菌细胞中合成后分泌到细胞周质中。
表达的rL-ASPⅡ相对分子质量为138 356 Da，pI为，紫外最大吸收值在278nm处。
本实验以此工程菌为材料采用蔗糖溶液渗透振扰提取法和酶解法联用提取周质中的rL-ASPⅡ，再用硫酸铵分级沉淀、DEAE-52阴离子纤维素交换层析等步骤提取和纯化，得到较高纯度表达产物rL-ASPⅡ。
并对rL-ASPⅡ进行酶活力分析和12%SDS-PAGE电泳分析。
rL-ASPⅡ酶活性的测定参照Peterson的方法修订。
取1 mol/L L-门冬酰胺，1 ml mol/L 硼酸-硼酸钠缓冲液，ml细胞悬液或酶液于37℃保温15 min，速加1 ml 50%三氯乙酸终止反应，4 000 r/min离心沉淀细胞。
取上清液1 ml，加奈氏试剂2 ml和双蒸水7 ml，放置15 min 后，于500 nm波长比色。
在上述规定条件下，将每分钟催化L-门冬酰胺水解释放1μg分子氨所需的酶量定义为1个酶活力单位（OD500=时为1 U）。
比活力测定方法为：精称纯化产物10mg，溶解于1 ml H2O中，采用Lowry法测定蛋白质含量，并测定酶活力，经以下公式换算即得单位质量的rL-ASPⅡ比活力。
rL-ASPⅡ比活力=酶活力(U)/蛋白含量。
【实验材料】1．器材（1) 基因工程菌菌种：pANS2为本实验室保存；（2) 其他同前实验二十三器材。
2．试剂重组L-门冬酰胺酶Ⅱ制备和酶活力测定：（1) 培养基：种子培养基（LB 液体培养基）；发酵培养基（玉米浆培养基）：玉米浆50g/L，牛肉浸膏35g/L，味精10g/L，，高压灭菌。
接种前在无菌条件下加入抗生素氨苄青霉素。
（2) 氨苄青霉素(Amp)；（3) 破壁液：45%蔗糖，10 mmol/L EDTA，200mg/L溶菌酶，pH ；（4) 奈氏试剂：称碘化钾5g加入5ml蒸馏水中，边搅拌边滴加25％氯化汞饱和液至稍有红色沉淀出现。
再加40ml 50％氢氧化钠溶液，最后用蒸馏水稀释至100ml，混匀入棕色试剂瓶中置暗处保存；（5) 1 mol/L氯化锰（MnCl2）；（6) 5 mol/L 磷酸缓冲液；（7) 硼酸缓冲液：0.858g硼砂(MW=，0.680g硼酸(MW=，用蒸馏水稀释至100 ml；（8) 溶菌酶；（9) 蔗糖；（10) 氯化钠；（11) 三（羟甲基）胺基甲烷（Tris）；（12) 乙醇；（13) 氢氧化钠；（14) 硫酸铵；（15) 谷氨酸钠（或含99%谷氨酸钠的味精）；（16) 四甲基乙二胺（EDTA）；（17) 盐酸；（18) 玉米浆；（19) 低分子量标准蛋白(14. 4 ～94 K Da)；12%SDS-PAGE电泳分析：同实验九。
【实验方法】1. 表达制备方法：一：PCR扩增ANSB基因：1模板的制备用接种环挑取菌体少许，在裂解液中震散，95摄氏度加热10MIN，吸取处理液用于PCR 2 扩增条件84℃变形1分钟，60℃复性2分钟，72℃延伸2分钟，循环28次二：重组质粒PKK 233 ANSB 的构建扩增后的DNA 片段及质粒同时分别用限制酶消化并用琼脂搪凝胶电泳分离和回收质粒大片段将消化后的DNA片段和电泳回收的质粒大片段用T4DNA连接酶连接,连接产物经琼脂糖凝胶电泳回收后转化, 筛选获得相应的阳性转化子。
三：阳性转化子的筛选将涂布在含氨节青霉素的LB 平板上生长出的单菌落用牙签逐个挑入方格化的新鲜平板上,为每个克隆编号。
平板置37℃温箱中过夜,待菌落形成后,用灭菌牙签逐个挑取少量菌体,移入预先加有L 硼酸缓冲液50UL的酶标板反应孔内,待菌体分散后,每孔各加入L 天门冬酞胺底物溶液50UL,保温37℃,加奈氏试剂50UL,呈深棕红色孔内对应的单菌落即为阳性转化子。
2. 工程菌发酵培养（1）从平板上挑取菌种接种于新鲜的含氨苄青霉素(终浓度为100 μg/ml )的LB液体培养基中，37℃，摇床转速220 r/min，培养至OD600为～。
（2）摇瓶培养：再按2%接种量转接于发酵培养基(三角瓶20%装液量)中，37℃，250r/min，20h，12 000r/min离心收集细胞。
（3）批式发酵培养：20L的发酵罐装入14L发酵培养基, 初始pH值为，121℃下灭菌20 min，待温度降至37℃时加氨苄青霉素至最终浓度为100μg/ml ，接入种子液700ml，37℃培养12～14h，罐压力。
3．重组L-门冬酰胺酶Ⅱ分离纯化制备（1）蔗糖溶液渗透振扰法和酶解法联用提取酶将发酵收获的菌体细胞悬浮于5倍体积的破壁液中，在30℃温和振荡70 min后搅拌下倾入大量水中，4 ℃，边搅拌边加入1 mol/L MnCl2 %，V/V)，沉淀核酸和菌体碎片，8 000r/min，离心30min，收集上清液即得酶提取液。
采用Lowry法和Peterson修订法分别检测目的蛋白重组L-门冬酰胺酶Ⅱ含量和酶活性及进行12%SDS-PAGE电泳分析。
计算收率。
（2）硫酸铵分级沉淀在酶提取液中加入硫酸铵至55%饱和度，调pH到，冰水浴磁力搅拌60 min，4 ℃静置过夜，12 000r/min离心10min除去沉淀。
再在上清液中加入硫酸铵至90%饱和度，调pH 至等电点附近（约），搅拌60 min，4 ℃静置过夜，12 000r/min离心10min，收集沉淀。
采用Lowry法和Peterson修订法分别检测目的蛋白重组L-门冬酰胺酶Ⅱ含量和酶活性及进行12%SDS-PAGE电泳分析。
计算收率。
（3）透析脱盐上述沉淀物用5 mol/L 磷酸缓冲液溶解，透析脱盐。
（4) DEAE-52阴离子交换柱层析DEAE-纤维素柱经5 mmol/L磷酸缓冲液平衡后，上样品脱盐酶液，用相同缓冲液洗涤至基线平稳，改用50 mmol/L磷酸缓冲液洗脱，分部收集器收集，min,每管收集6ml，测定每管的A280值和酶活性。
绘制洗脱曲线。
收集显示酶活性组分，冷冻干燥后即得高纯度的L-门冬酰胺酶冻干粉。
采用Lowry法和Peterson修订法分别检测目的蛋白重组L-门冬酰胺酶Ⅱ含量和酶活性及进行12%SDS-PAGE电泳分析。
计算收率。
4．重组L-门冬酰胺酶Ⅱ酶活性测定吸取1ml菌液入Ep管，12 000 r/min离心5min，收集菌体弃去上清，加入蒸馏水1ml洗涤，混悬，12 000r/min离心5min，弃上清。
重复上述操作2～3次，加入硼酸缓冲液1ml混悬。
准备一组(2支)蒸馏水准备管：取10ml的洁净试管2只，每管加蒸馏水。
另取2支10ml的洁净试管，分别加入mol/L天冬酰胺底物，mol/L 硼酸缓冲液各1ml，37℃水浴5min，其中一只加入细胞悬液20μl，另一支为对照管。
反应15min后分别加入50%三氯乙酸1ml终止反应。
再从终止反应管中各支取500μl进蒸馏水准备管，每管分别加入与25%NaOH以1:1配好的奈氏液1ml显色，500nm处测OD值。
计算：酶活力(U)=[(OD×1000)/×15x)]×(3+x/1000)x为取样体积(本实验为20μl)5．比活力测定方法精确称取纯化产物10mg，溶解于1 mlH2O中，采用Lowry法测定蛋白质含量，并测定酶活力，经以下公式换算即得单位质量的rL-ASPⅡ比活力。
rL-ASPⅡ比活力=酶活力(U)/蛋白含量。
6．12%SDS-PAGE电泳分析样品纯度电泳方法同实验九。
（1) 按常规制备电泳用聚丙烯酰胺凝胶，浓度12％。
（2) 将发酵收获的细胞、酶提取液、硫酸铵分级沉淀和离子交换洗脱液样品处理后，进行电泳分析。
（3) 电泳2～3h后，取出凝胶，用%考马斯亮蓝-R250进行染色。
过夜后倾出染液，不断脱色，起初每20min换液1次，1h后每小时换液1次，直到区带明显，画出电泳区带图谱。
7．结果处理（1）用箭头图表示重组L-门冬酰胺酶Ⅱ制备的操作流程。
（2）绘制洗脱曲线。
（3）重组L-门冬酰胺酶Ⅱ的纯化过程分析重组L-门冬酰胺酶Ⅱ的纯化过程分析纯化步骤总蛋白(mg) 总活力(U) 比活(U/mg) 纯化倍数收率(%)A.粗提酶液B.硫酸铵沉淀纤维素柱层析（4) 电泳图谱分析。