门冬酰胺酶的制备与分析
重组l-门冬酰胺酶的提取纯化工艺
重组l-门冬酰胺酶的提取纯化工艺介绍如下:
L-门冬酰胺酶是一种能够将L-门冬氨酸催化转化为（S）-去羧肟丙氨酸的酶，具有极大的应用潜力。
本文将介绍一种可行的重组L-门冬酰胺酶的提取纯化工艺。
1.酶表达及收获：利用基因重组技术，将L-门冬酰胺酶基因克隆进入大肠杆菌中表达。
将表达产物通过超声波破碎将细胞内的酶抽出并离心，上清液即是未纯化的粗酶液。
2.酶列层析：未纯化的粗酶液在硫酸铵饱和度为70%的情况下进行酶柱层析，选用阳
离子交换层析分离酶的分子量和荷电性质，如Q-Sepharose FF层析柱。
将符合条件的酶进行批量收集，去除未得到的酶和杂质。
3.碘盐化学修饰：经过第一次纯化后，酶的纯度和活性仍然不够高，需要进行进一步
的纯化。
碘盐处理可以提高酶的稳定性和特异性，有助于去除表型或变形的酶。
将适量的KI添加到酶液中，在适当pH和温度下干燥，直至酶不再吸收碘化物。
4.透析纯化：将经碘盐处理的酶溶解在透析缓冲液中，在温和的离子强度和pH条件
下进行亲和层析，可以去除KI和其它大分子的杂质，提高酶液的纯度。
该阶段的纯化大量使用隔膜，有选择性地对酶进行分离和缓冲溶液交换。
5.尿素剪切：通过尿素等离子体进行酶剪切工艺，可以去除酶的表面氨基酸，去除肽
链信号，提高酶的纯度和催化活性。
酶剪切后，可以进一步通过透析等工艺进行纯化。
以上是一种可行的重组L-门冬酰胺酶的提取纯化工艺流程，这个工艺流程可以根据酶的性质和制备目的进行改变和改进，以做到最佳的提取效果。
ENKTL门冬酰胺合成酶的表达及以门冬酰胺酶为基础化疗方案的疗效分析的开题报告
ENKTL门冬酰胺合成酶的表达及以门冬酰胺酶为基础化疗方案的疗效分析的开题报告
1. 研究背景和意义
恶性淋巴瘤是一种常见的血液肿瘤，其中鼻咽癌是一种罕见的非霍奇金淋巴瘤亚型。
ENKTL是常见的鼻咽癌亚型之一，常伴有循环系统、消化系统等器官的转移，严重影响生存率。
当前的治疗方案多样化，但是尚缺少有效的靶向治疗药物。
门冬酰胺基是鼻咽癌细胞中的重要生化代谢途径。
门冬酰胺酶能够将门冬酰胺酶底物转化为门冬酰胺，起到抑制细胞凋亡的作用。
因此，ENKTL的治疗中可能存在着门冬酰胺酶过度表达的现象，导致治疗效果不佳。
ENKTL门冬酰胺合成酶的表达及涉及其调节可能为鼻咽癌的诊断和治疗提供新思路。
2. 研究内容
本研究计划通过收集和筛选ENKTL患者的鼻咽癌组织和正常对照组织进行实验室实验，探讨ENKTL中门冬酰胺合成酶的表达水平及其对治疗效果的影响。
具体研究内容如下：
（1）收集ENKTL患者的鼻咽癌组织和正常对照组织，采用免疫组化和实时荧光定量PCR比较门冬酰胺合成酶的表达水平，并分析其与临床病理特征的关系。
（2）建立ENKTL细胞的稳定转染系统，通过siRNA及/或CRISPR-Cas9技术抑制门冬酰胺合成酶的表达，并检测细胞增殖、转移和凋亡的变化。
（3）通过门冬酰胺酶的体外检测和体内试验评估其作为鼻咽癌的治疗靶点的可行性和效果。
3. 研究意义
本研究可探讨ENKTL中门冬酰胺合成酶的表达和调控机制，为鼻咽癌的诊断和治疗提供新思路，拓展ENKTL的治疗选项，促进临床治疗水平的提高。
同时，该项目还可为其他淋巴瘤亚型的研究提供参考模板。
L-天门冬酰胺酶的提取和纯化
L-天门冬酰胺酶的提取和纯化【实验目的】1.了解实验室常用酶的提取和纯化技术方法和原理。
2.掌握L-天门冬酰胺酶的制备的操作技术方法。
【实验材料】1 大肠杆菌菌体细胞由本室自行培养，培养条件基本参照文献。
2 DEAE一纤维素oE52、eM一纤维素eM52为Wharman公司产品. Sepharose CL-6B凝胶3 其它试剂均为国产分析纯【实验仪器】1高速台式离心机2 标准净化工作台3.微量移液枪4.旋转混合器5.层析柱6.烧杯，玻璃棒7.灭菌的Eppendorf管8.灭菌的移液枪头9.滴定管10.恒温水浴锅11.Pellicon超滤浓缩系统【实验流程】1.提取。
将菌体悬浮于破壁液(45%蔗糖,10 mmol/LEDTA,200 mg/L溶菌酶)中,在30℃搅拌70 min后搅拌下倾入大量水中,加入MnCl2沉淀菌体碎片和核酸,离心,取上清液即得酶提取液。
2.硫酸铵分级沉淀和乙醇分级沉淀。
酶提取液中加入硫酸铵至55%饱和度,离心除去沉淀,上清液中加入硫酸铵至90%饱和度,离心收集沉淀,沉淀物使溶解并透析脱盐。
脱盐酶液中加入乙醇至33%(v/v),离心除去沉淀的杂蛋白,上清液部分加乙醇至40%(v/v),得沉淀A。
沉淀A部分用50mmol/L PBS(pH6.4)悬浮,离心后于上清液中加乙醇至45%(v/v),得沉淀B,沉淀B用5 mmol/LPBS(pH6.4)溶解即得纯度较高的酶3.CM-Sephadex层析柱纯化。
将酶液过用10mM、pH6.0的磷酸缓冲液平衡的CM-Sephadex层析柱,用50mM、pH8.8的磷酸缓冲液洗脱,收集OD280大于0.1的含有L-天门冬酰胺酶活性成分的洗脱液4.DEAE-Sepharose层析柱纯化。
将洗脱液调pH7.0,过用10mM、pH7.0的磷酸缓冲液平衡的DEAE-Sepharose层析柱,用50mM的磷酸缓冲盐洗脱,收集OD280大于0.1的含有L-天门冬酰胺酶活性成分的洗脱液。
门冬酰胺酶产生菌工艺流程
门冬酰胺酶产生菌工艺流程下载温馨提示：该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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门冬酰胺酶的制备与分析
重组天冬酰胺酶的制备、纯化与鉴定赵雅嫱黄妤璠龙益如王敏敏白华山1 原理本实验主要是利用基因工程手段构建L-天冬酰胺酶基因工程菌。
L-天冬酰胺酶的生理作用主要体现于其抗癌抗肿瘤活性，特别是对非霍奇金淋巴瘤和ALL 的有很强的抑制作用，目前适用于治疗黑色素瘤、非何杰金病淋巴瘤等，也可以用于治疗急性单核细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病等。
目前，我国虽已投入生产L-天冬酰胺酶，但是较国外生产成本高、菌种产酶活性低，提取纯化工艺落后。
针对这些问题，本实验对大肠杆菌重组L-天冬酰胺酶的制备、纯化与鉴定进行了系统性的探究，意图改进重组L-天冬酰胺酶的表达，优化其纯化工艺，分析其鉴定方法与性质。
本实验主要进行了重组克隆载体和表达载体构建、表达与鉴定的摸索；酶蛋白的诱导表达条件分析；酶蛋白分离纯化手段的比较和选择，如蔗糖溶液提取、硫酸铵分级沉淀、CM-Sephadex和DEAE-Sepharose 离子交换层析以及亲和层析；重组蛋白酶活力监控与本底蛋白活力测定等等。
2 实验材料实验仪器见表1.1。
型号和生产厂家根据实验室现有条件核定。
表1.1 实验仪器或装置仪器名称型号生产厂家超净工作台PCR扩增仪恒温培养箱超低温冰箱台式离心机恒温摇床涡轮振荡器高压灭菌锅蛋白电泳仪核酸电泳仪凝胶成像仪紫外分光光度计高效液相色谱仪扫描型紫外分光光度计制冰机超声清洗机实验试剂和材料见表1.2。
材质或规格以及来源根据实验需求以及实验室现有条件核定。
表1.2 试剂和材料试剂或材料材质或规格来源E.coli 野生型菌株CPU21009 实验室储存pMD18-T 50ng/μl 宝生物工程有限公司pET-22b 50ng/μl 宝生物工程有限公司Nde Ⅰ10U/μl 宝生物工程有限公司Xho Ⅰ10U/μl 宝生物工程有限公司T4 DNA Ligase 350U/μl 宝生物工程有限公司DNA纯化试剂盒离心柱型天根生化科技（北京）有限公司Ni-NTA树脂纯化试剂盒离心柱型天根生化科技（北京）有限公司质粒提取试剂盒离心柱型天根生化科技（北京）有限公司胶回收试剂盒离心柱型天根生化科技（北京）有限公司CaCl60mmol/L 实验室储存2PBS 50x 实验室储存NaCl 分析纯Taq 酶 Mix 分析纯(NH4)2S2O8分析纯C 2H6OS 分析纯CH4O 分析纯冰乙酸分析纯C 2H6O 分析纯氨基丁三醇分析纯考马斯亮蓝分析纯SDS 分析纯Nessler's 试剂Reagent,ACS 美国Spectrum公司酵母粉分析纯L-天冬酰胺分析纯英国OXOID公司蛋白胨分析纯甘氨酸分析纯琼脂糖分析纯葡萄糖食品级TEMED 优级纯溴酚蓝分析纯IPTG 优级纯丙三醇分析纯3 实验思路与步骤本实验设计从大肠杆菌野生型菌株CPU210009中提取总DNA，通过PCR 扩增目的基因ansB，随后对PCR产物进行纯化。
L-门冬酰胺酶(Asp)新纯化工艺项目总结
L-门冬酰胺酶（Asp）新纯化工艺项目总结1项目背景L-门冬酰胺酶(L-asparaginase: Asp)是一种酰胺基水解酶，是从大肠杆菌菌体中提取分离的酶类药物，它能专一地水解L-门冬酰胺生成L-门冬氨酸和氨，是一种重要的抗肿瘤药物，临床适用于治疗急性淋巴细胞性白血病、急性粒细胞性白血病、急性单核细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、何杰金病及非何杰金病淋巴瘤、黑色素瘤等。
尤其是对儿童急性淋巴细胞性白血病（ALL）的诱导缓解期疗效最好。
目前生产门冬酰胺酶的工艺很多，纯化工艺更是千差万别。
以往的研究一般仅局限于实验室制备或小批量生产，经过复杂的纯化步骤获得纯度及活性符合要求的产品，但收率低，成本高，特别是操作成本占整个纯化成本的很大部分。
如果不考虑产品成本，仅为获得符合要求的产品，上述数种工艺尚还可行，但是从获取生产利润的角度这些工艺就不可行，而且在所有这些工艺中，生产过程的复杂性成为规模化生产的制约因素，如何开发即简洁又具有实际操作性的新生产工艺，实现Asp生产的规模化，获得高纯度、高活性、高收率的目标产品成为我们所要研究的课题。
公司自生产Asp以来，一直采用初期研发阶段的生产工艺，步骤复杂、操作成本高、生产能力受限。
基于此我们从探索方便、简洁、高效的生产工艺入手，主要在纯化过程及精制过程两方面对现有工艺进行改进。
2新工艺介绍新工艺分以下几步：（1）丙酮粉制作：将丙酮、离心后的湿菌体按2：1（v/w）比例混合，搅拌20～30min，离心，过筛，自然晾干得丙酮干粉（2）抽提：将丙酮干粉与抽提buffer按1：20（w/v）比例混合，37℃，搅拌1～1.5hr，得抽提液（3）纯化：抽提液加适量1M MnCl2溶液(1.5ml/g powder)，沉淀菌体碎片及核酸，离心取上清；以1M Tris buffer调上清pH值至8.0，沉淀析出，离心取上清；加入0.5倍体积的乙醇，搅匀静置过夜，沉淀杂蛋白，离心得上清；再加入0.5～0.75倍体积的乙醇，静置沉淀6～8 hr，离心得沉淀。
重组门冬酰胺酶 设计性实验
目的
原理
方法
应用
原理
• • 1、提取 • 2、纯化 • • ①. 蔗糖溶液提取法： 离子交换层析： • • ②. 冷丙酮干燥破壁 • 亲和层析 • 法： • ③. 反复冻融法： • ④. 超声破壁法： 3．L-ASP的修饰：
聚乙二醇(PEG)修 饰的L-ASP： 单甲氧基聚乙二醇 (mPEG2)修饰的LASP：
目的原理ຫໍສະໝຸດ 方法应用• •
• •
• •
3．L-ASP的修饰： L-ASP来源于大肠杆菌，有较强的免疫原性，易在人体中产生针对L-ASP 的抗体，引发临床上常见的进行性免疫反应和全身性过敏反应等副作用。 另外，L-ASP制剂的抗肿瘤活性与其在体内的半衰期有关，天然的L-ASP 在体内易被蛋白酶水解，半衰期短，治疗效果差[10]。 3.1. 聚乙二醇(PEG)修饰的L-ASP： 利用PEG与L-ASP连接，从而改变这个酶的理化特性和生物学特性，进而 减少它的过敏反应。Soares[11]等利用中等分子量的PEG对大肠杆菌的L天冬酞胺酶进行修饰。研究结果表明，PEG-酶在PH3 .5 至pH 12.5的广 泛范围内保持稳定，而且在酸性介质中的稳定性大大增加，在pH3.5时维 持稳定1h。 PEG-酶在生理溶液中，65°1 h后，仍有32%的活性。体外 试验中，PEG-酶在人血清中，在40 mm内保持活性不变。同时冻干法处 理PEG-酶，不影响酶的催化活性。因此PEG对L-天冬酞胺酶的修饰，改 善了酶的理化特性和生物学特性，从而导致L-天冬酰胺酶的治疗特性的显 著改善。 3.2. 单甲氧基聚乙二醇(mPEG2)修饰的L-ASP： 国内的史凌洋[12]等使用活化的mPEG2对大肠杆菌的L-ASP进行修饰， 修饰过程中加人底物L-天冬酰胺保护酶的活性中心。得到的mPEG2-酶的 抗体结合能力消失，保留酶比活力32.8% ，酶的常温稳定性和热稳定性 均有显著提高。
L—天门冬酰胺酶是酰胺基水解酶
L—天门冬酰胺酶是酰胺基水解酶，是从大肠杆菌菌体中提取分离的酶类药物，其商品名Elspar ，用于治疗白血病。
性状呈白色粉末状，微有吸湿性，溶于水，不溶于丙酮、氯仿、乙醚及甲醇。
20 ％水溶液贮存7 天， 5 ℃贮存14 天均不减少酶的活力。
干燥品50 ℃、15min 酶活力降低30 ％，60 ℃、1h 内失活。
最适pH8.5 ，最适温度37 ℃。
L —天门冬酰胺酶的产生菌是霉菌和细菌，故可作制造酶的原料。
( 二) 生产工艺1 ．工艺路线：L —天门冬酰胺酶生产的工艺流程见图5 —1 。
图5 —1 门冬酰胺酶生产工艺流程图2 ．工艺过程：①菌种培养采取大肠杆菌AS1-375 ，普通牛肉培养基，接种后于37 ℃培养24h 。
②种子培养16 ％玉米浆，接种量1 ％～1.5 ％，37 ℃通气搅拌培养4 ～8h 。
③发酵罐培养玉米浆培养基，接种量8 ％，37 ℃通气搅拌培养 6 ～8h ，离心分离发酵液，得菌体，加2 倍量丙酮搅拌，压滤，滤饼过筛，自然风干成菌体干粉。
④提取、沉淀、热处理每千克菌体干粉加入0.Olmol ／L pH8.0 的硼酸缓冲液lOL 37 ℃保温搅拌1.5h ，降温到30 ℃以后，用5mol ／L 醋酸调节pH4.2 ～ 4.4 进行压滤，滤液中加入0.2 倍体积的丙酮，放置3 ～4h ，过滤，收集沉淀，自然风干，即得干粗酶。
取粗制酶，加入0.3 ％甘氨酸溶液，调节pH8.8 ，搅拌1.5h ，离心，收集上清液，加热到60 ℃30min 进行热处理。
离心弃去沉淀，上清液加 2 倍体积的丙酮，析出沉淀，离心，收集酶沉淀，用0.01mol ／L ，pH8.0 磷酸缓冲液溶解，再离心弃去不溶物，得上清酶溶液。
⑤精制、冻干上述酶溶液调节pH8.8 ，离心弃去沉淀，清液再调pH7.7 加入50 ％聚乙二醇，使浓度达到16 ％。
在2 ～ 5 ℃放置4 ～ 5 天，离心得沉淀。
用蒸馏水溶解，加4 倍量的丙酮，沉淀，同法反复 1 次，沉淀用pH6.4 ，0.05mol ／L 磷酸缓冲液溶解，50 ％聚乙二醇反复处理 1 次，即得无热原的L —天门冬酰胺酶。
门冬酰胺酶
【成份】本品主要成份为门冬酰胺酶，来源于大肠杆菌中提取制备的具有酰胺基水解作用的酶。
辅料：甘露醇、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠。
【性状】本品为白色冻干块状物或粉末。
【适应症】适用于治疗急性淋巴细胞性白血病(简称急淋)、急性粒细胞性白血病、急性单核细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、霍奇金病及非霍奇金病淋巴瘤、黑色素瘤等。
本品对上述各种瘤细胞的增殖有抑制作用，其中对儿童急淋的诱导缓解期疗效最好，有时对部分常用化疗药物缓解后复发的患者也可能有效，但单独应用时缓解期较短，而且容易产生耐药性，故多与其他化疗药物组成联合方案应用，以提高疗效。
【规格】（1）5000单位（2）10000单位【用法用量】根据不同病种，不同的治疗方案，本品的用量有较大差异。
以急淋的诱导缓解方案为例：剂量可根据体表面积计，日剂量500单位／m2，或1000单位／m2，最高可达2000单位／m2；以10～20日为一疗程。
【不良反应】成人较儿童多见。
1、较常见的有过敏反应、肝损害、胰腺炎、食欲减退，凝血因子Ⅴ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ及纤维蛋白原减少等，过敏反应的主要表现为突然发作的呼吸困难、关节肿痛、皮疹、皮肤瘙痒、面部水肿，严重者可发生呼吸窘迫、休克甚至死亡。
在用肌注给药的晚期儿童白血病，虽其轻度过敏反应的发生率较高，但有报告认为其严重过敏反应的发生率较静注给药低。
过敏反应一般在多次反复注射者易发生，但曾有皮内敏感试验(简称皮试)阴性的患者发生。
另有某些过敏体质者，即使注射做皮试剂量的门冬酰胺酶时，偶然也会产生过敏反应。
肝脏损害通常在开始治疗的2周内发生，可能出现多种肝功能异常，包括血清丙氨酸氨基转移酶[ALT(SGPT)]、门冬氨酸氨基转移酶[AST(SGOT)]、胆红素等升高、血清白蛋白等降低，曾有经肝穿刺活检证实有脂肪肝病变的病例。
患者如感觉剧烈的上腹痛并伴有恶心、呕吐，应疑有急性胰腺炎，其中暴发型胰腺炎很危重，甚至可能致命。
其他尚有恶心、呕吐、腹泻等。
门冬酰胺酶
【成份】本品主要成份为门冬酰胺酶，来源于大肠杆菌中提取制备的具有酰胺基水解作用的酶。
辅料：甘露醇、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠。
【性状】本品为白色冻干块状物或粉末。
【适应症】适用于治疗急性淋巴细胞性白血病(简称急淋)、急性粒细胞性白血病、急性单核细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、霍奇金病及非霍奇金病淋巴瘤、黑色素瘤等。
本品对上述各种瘤细胞的增殖有抑制作用，其中对儿童急淋的诱导缓解期疗效最好，有时对部分常用化疗药物缓解后复发的患者也可能有效，但单独应用时缓解期较短，而且容易产生耐药性，故多与其他化疗药物组成联合方案应用，以提高疗效。
【规格】（1）5000单位（2）10000单位【用法用量】根据不同病种，不同的治疗方案，本品的用量有较大差异。
以急淋的诱导缓解方案为例：剂量可根据体表面积计，日剂量500单位／m2，或1000单位／m2，最高可达2000单位／m2；以10～20日为一疗程。
【不良反应】成人较儿童多见。
1、较常见的有过敏反应、肝损害、胰腺炎、食欲减退，凝血因子Ⅴ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ及纤维蛋白原减少等，过敏反应的主要表现为突然发作的呼吸困难、关节肿痛、皮疹、皮肤瘙痒、面部水肿，严重者可发生呼吸窘迫、休克甚至死亡。
在用肌注给药的晚期儿童白血病，虽其轻度过敏反应的发生率较高，但有报告认为其严重过敏反应的发生率较静注给药低。
过敏反应一般在多次反复注射者易发生，但曾有皮内敏感试验(简称皮试)阴性的患者发生。
另有某些过敏体质者，即使注射做皮试剂量的门冬酰胺酶时，偶然也会产生过敏反应。
肝脏损害通常在开始治疗的2周内发生，可能出现多种肝功能异常，包括血清丙氨酸氨基转移酶[ALT(SGPT)]、门冬氨酸氨基转移酶[AST(SGOT)]、胆红素等升高、血清白蛋白等降低，曾有经肝穿刺活检证实有脂肪肝病变的病例。
患者如感觉剧烈的上腹痛并伴有恶心、呕吐，应疑有急性胰腺炎，其中暴发型胰腺炎很危重，甚至可能致命。
其他尚有恶心、呕吐、腹泻等。
纯化l-门冬酰胺酶的方法
纯化l-门冬酰胺酶的方法L-门冬酰胺酶是一种重要的酶类，在药物合成、特殊化学品的生产中有着广泛的应用。
为了获得高纯度的L-门冬酰胺酶，需要进行有效的纯化和富集操作。
以下是一种基于悬浮液分级离心技术的L-门冬酰胺酶纯化方法，具体步骤如下：1. 制备细胞悬浮液在培养中积累的L-门冬酰胺酶的菌体经过收获、离心、冻干、机械破碎等处理后，制备得到含有L-门冬酰胺酶的细胞悬浮液。
2. 预处理悬浮液将制备好的悬浮液进行预处理，去除杂质和胶体成分，以便后续的分级离心操作。
本实验中，使用超声波破碎仪进行预处理，操作条件为：频率为20KHz，功率为100W，处理时间为15min。
3. 分级离心操作将预处理好的悬浮液经过分级离心操作，以得到L-门冬酰胺酶的纯化物。
本实验中，使用的是高速离心机，操作条件为：预离心速度为3000r/min，离心时间为20min；第一次分级离心时转速为10000r/min，制备好的上清液作为下一个离心泵进的样品；第二次分级离心时转速为15000r/min，得到的上清液即为L-门冬酰胺酶的纯化物。
4. 对纯化物进行分子筛分析采用SDS-PAGE对得到的纯化物进行分子筛分析，确定得到的L-门冬酰胺酶的纯度和分子量。
在本实验中，采用了贪婪蓝染色法对蛋白质进行染色，并进行标准电泳分析。
5. 对纯化物进行酶活测定采用酶活测定法对得到的L-门冬酰胺酶的酶活力进行检测，以确定纯化效果和L-门冬酰胺酶的活性。
采用乙酰化胆碱酯酶偶联酶颜色法进行测定，具体条件为：反应液体积为2mL，反应温度为25℃，反应时间为5min。
经过以上步骤的纯化方法可以获得高纯度、高纯性的L-门冬酰胺酶纯化物，为其在工业生产中的应用提供了保障。
门冬酰胺酶生产工艺流程
门冬酰胺酶生产工艺流程
稿子一：
嗨，亲爱的小伙伴们！今天咱们来聊聊门冬酰胺酶的生产工艺流程，这可有趣啦！
你知道吗，一开始啊，得准备好多好多的原材料。
就像做菜一样，食材得选好。
然后呢，把这些原材料放进大大的反应釜里，让它们在一起好好地“玩耍”。
然后呀，经过一段时间的反应，会产生一些混合物。
这时候，就需要用各种神奇的过滤和分离设备，把我们想要的门冬酰胺酶从里面挑出来。
再接着，还要对挑出来的酶进行提纯和精制，把杂质都赶走，让它变得更加纯净和厉害。
怎么样，是不是感觉很神奇？这就是门冬酰胺酶的生产过程哦！
稿子二：
嘿，朋友们！今天来给你们讲讲门冬酰胺酶是怎么生产出来的哟！
呢，得有一群超级厉害的科学家和工程师们一起努力。
他们就像魔法师一样，要施展魔法把普通的东西变成宝贝。
在这个过程中，要时刻盯着各种数据，就像看着自己的宝贝孩子长大一样，不能有一点差错。
等反应进行得差不多了，就要把有用的东西和没用的东西分开，这可需要一些厉害的工具和技术。
之后呢，把它装在漂亮的小瓶子或者小袋子里，准备出发去帮助需要它的人们。
整个过程就像是一场奇妙的冒险，充满了挑战和惊喜。
是不是很有意思呀？
希望你们也能喜欢这个门冬酰胺酶的生产工艺流程的小故事！。
实验三十 重组门冬酰胺酶Ⅱ的纯化与分析
实验三十重组门冬酰胺酶Ⅱ的纯化与分析注：此实验来自项目重组E.coli L-门冬酰胺酶制备研究（科技部）的成果【目的要求】1．了解基因工程菌发酵培养、分泌表达酶蛋白及表达酶蛋白纯化、分析鉴定的基本原理。
2．掌握以基因工程菌种E.coli/pANS2为材料进行工程菌发酵培养、分泌表达酶蛋白重组门冬酰胺酶Ⅱ及表达酶蛋白制备和酶活力测定、SDS-PAGE电泳分析鉴定的工作原理和技术方法。
【实验原理】L-门冬酰胺酶(L-asparaginase，EC3.5.1.1)广泛存在于动物的组织、细菌、植物和部分啮齿类动物的血清中，但在人体的各种组织器官中的分布未见报道。
L-门冬酰胺酶活性形式为一同源四聚体，每一亚基由330个氨基酸组成，分子质量为34 564u，能专一地水解L-门冬酰胺生成L-门冬氨酸和氨。
由于某些肿瘤细胞缺乏L-门冬酰胺酶合成酶，细胞的存活需要外源L-门冬酰胺的补充，如果外源门冬酰胺被降解，则由于蛋白质合成过程中氨基酸的缺乏，导致肿瘤细胞的死亡。
因此，L-门冬酰胺酶是一种重要的抗肿瘤药物，多年来一直是小儿急性成淋巴细胞性白血病(Acute Lumphoblastic Leukaemia,ALL)和淋巴肉瘤(Lymphosarcoma)临床化疗中重要的配伍药物之一。
用微生物，特别是大肠杆菌来生产L-门冬酰胺酶已有广泛深入的研究。
大肠杆菌能产生2种天冬酰胺酶，即L-门冬酰胺酶Ⅰ和L-门冬酰胺酶Ⅱ，分别由其染色体上基因ansA和ansB编码。
只有L-门冬酰胺酶Ⅱ才有抗肿瘤活性。
美、德、日均有L-门冬酰胺酶Ⅱ商品出售。
我国天津生化厂曾于1974年投产，后因菌种退化，产量降低而停产。
国内目前用药全靠进口。
1995年，本院构建了高效分泌表达L-门冬酰胺酶Ⅱ的基因工程菌，重组L-门冬酰胺酶Ⅱ(rL-ASPⅡ)在大肠杆菌细胞中合成后分泌到细胞周质中。
表达的rL-ASPⅡ相对分子质量为138 356 Da，pI为4.85，紫外最大吸收值在278nm处。
重组门冬酰胺酶Ⅱ的制备
重组门冬酰胺酶Ⅱ的制备摘要：L-天冬酰胺酶具有显著的抗肿瘤作用，尤其是广泛应用于儿童急性淋巴细胞白血病(ALL)的治疗。
采用渗透振扰破壁法、硫酸铵分级沉淀、乙醇分级沉淀、DEAE-纤维素层析等步骤提取和纯化重组L-门冬酰胺酶Ⅱ。
关键字：L-门冬酰胺酶Ⅱ;制备；分离;纯化；稳定剂1.L-天冬酰胺酶治疗ALL的作用机制L-天冬酰胺酶(E.C，3.5.1.1)是酰胺基水解酶，是1个广泛应用于儿童急性淋巴细胞白血病(ALL)治疗的酶类药物。
L-天冬酰胺酶在机体内可催化天冬酰胺的水解，生成天冬氨酸和氨，在大量的ALL病人中，其肿瘤细胞依赖外源性的L-天冬酰胺才能生存，而正常细胞自身能合成L-天冬酰胺。
L-天冬酰胺酶抗白血病的作用机制是它能够快速消耗血循环中的L-天冬酰胺，从而消耗肿瘤细胞合成蛋白质所必需的底物，快速抑制蛋白质合成，而不影响正常细胞，此即L天冬酰胺酶的选择性细胞毒作用。
[1]2.L-天冬酰胺酶的分离纯化工艺2.1酶的几种提取方法L-天冬酰胺酶最初是从豚鼠的血清中提取的，含量很低，后来开发发酵法生产，采用大肠杆菌;欧文菌以及粘质赛氏杆菌( serraliamarcescem)等产生菌制备。
大肠杆菌产生的L-天冬酰胺酶包括天冬酰胺酶I和天冬酰胺酶Ⅱ，其中天冬酰胺酶I没有抗癌活性，存在于细胞质中，而有抗癌活性的天冬酰胺酶Ⅱ则分泌到细胞周质中。
大肠杆菌来源的天冬酰胺酶的提取方法常用有冷丙酮干燥破壁、蔗糖溶液提取法和反复冻融法、超声破壁法等.2.1.1蔗糖溶液提取法向菌体细胞中加入5倍体积的蔗糖抽提液(蔗糖40%，溶菌酶200mg/L，EoTA10mmol/L，pH7·5)，在30C振荡2小时，8000r/min离心30分钟，收集上清酶液。
2.1.2冷丙酮干燥破壁法将菌体悬液倒入10倍量预先冷却的丙酮中，搅拌15分钟，5000r/min离心20分钟收集沉淀，于室温风干、研碎。
向菌体干粉中加入10倍体积0.0lmol/L，pH8.0硼酸缓冲液.于室温下搅拌30分钟，加入氯化锰溶液沉淀核酸，离心收集上清酶液。
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重组天冬酰胺酶的制备、纯化与鉴定赵雅嫱黄妤璠龙益如王敏敏白华山1 原理本实验主要是利用基因工程手段构建L-天冬酰胺酶基因工程菌。
L-天冬酰胺酶的生理作用主要体现于其抗癌抗肿瘤活性，特别是对非霍奇金淋巴瘤和ALL 的有很强的抑制作用，目前适用于治疗黑色素瘤、非何杰金病淋巴瘤等，也可以用于治疗急性单核细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病等。
目前，我国虽已投入生产L-天冬酰胺酶，但是较国外生产成本高、菌种产酶活性低，提取纯化工艺落后。
针对这些问题，本实验对大肠杆菌重组L-天冬酰胺酶的制备、纯化与鉴定进行了系统性的探究，意图改进重组L-天冬酰胺酶的表达，优化其纯化工艺，分析其鉴定方法与性质。
本实验主要进行了重组克隆载体和表达载体构建、表达与鉴定的摸索；酶蛋白的诱导表达条件分析；酶蛋白分离纯化手段的比较和选择，如蔗糖溶液提取、硫酸铵分级沉淀、CM-Sephadex和DEAE-Sepharose 离子交换层析以及亲和层析；重组蛋白酶活力监控与本底蛋白活力测定等等。
2 实验材料实验仪器见表1.1。
型号和生产厂家根据实验室现有条件核定。
表1.1 实验仪器或装置仪器名称型号生产厂家超净工作台PCR扩增仪恒温培养箱超低温冰箱台式离心机恒温摇床涡轮振荡器高压灭菌锅蛋白电泳仪核酸电泳仪凝胶成像仪紫外分光光度计高效液相色谱仪扫描型紫外分光光度计制冰机超声清洗机实验试剂和材料见表1.2。
材质或规格以及来源根据实验需求以及实验室现有条件核定。
表1.2 试剂和材料试剂或材料材质或规格来源E.coli 野生型菌株CPU21009 实验室储存pMD18-T 50ng/μl 宝生物工程有限公司pET-22b 50ng/μl 宝生物工程有限公司Nde Ⅰ10U/μl 宝生物工程有限公司Xho Ⅰ10U/μl 宝生物工程有限公司T4 DNA Ligase 350U/μl 宝生物工程有限公司DNA纯化试剂盒离心柱型天根生化科技（北京）有限公司Ni-NTA树脂纯化试剂盒离心柱型天根生化科技（北京）有限公司质粒提取试剂盒离心柱型天根生化科技（北京）有限公司胶回收试剂盒离心柱型天根生化科技（北京）有限公司CaCl260mmol/L 实验室储存PBS 50x 实验室储存NaCl 分析纯Taq 酶 Mix 分析纯(NH4)2S2O8分析纯C 2H6OS 分析纯CH4O 分析纯冰乙酸分析纯C 2H6O 分析纯氨基丁三醇分析纯考马斯亮蓝分析纯SDS 分析纯Nessler's 试剂Reagent,ACS 美国Spectrum公司酵母粉分析纯L-天冬酰胺分析纯英国OXOID公司蛋白胨分析纯甘氨酸分析纯琼脂糖分析纯葡萄糖食品级TEMED 优级纯溴酚蓝分析纯IPTG 优级纯丙三醇分析纯3 实验思路与步骤本实验设计从大肠杆菌野生型菌株CPU210009中提取总DNA，通过PCR 扩增目的基因ansB，随后对PCR产物进行纯化。
后分别构建重组克隆载体和表达载体，将克隆载体导入宿主中，筛选阳性克隆，再经双酶切和测序鉴定。
后将构建的工程菌在合适的培养条件下发酵培养，利用IPTG诱导表达重组蛋白，对重组蛋白进行提取纯化。
再由考马斯亮蓝法测定蛋白浓度，SDS-PAGE电泳测定分子量以及进行肽图分析和紫外扫描并与天然产品比较。
同时，实验过程中以纳氏试剂法监控L-天冬酰胺酶酶活力，并计算回收率。
3.1大肠杆菌L-天冬酰胺酶II基因ansB的获取3.1.1 大肠杆菌ansB基因的选择与引物从NCBI中查找获取大肠杆菌ansB的基因序列，其Gene ID为947454，基因长度为1047bp,序列如下：1 atggagtttt tcaaaaagac ggcacttgcc gcactggtta tgggttttag tggtgcagca61 ttggcattac ccaatatcac cattttagca accggcggga ccattgccgg tggtggtgac121 tccgcaacca aatctaacta cacagtgggt aaagttggcg tagaaaatct ggttaatgcg181 gtgccgcaac taaaagacat tgcgaacgtt aaaggcgagc aggtagtgaa tatcggctcc241 caggacatga acgataatgt ctggctgaca ctggcgaaaa aaattaacac cgactgcgat301 aagaccgacg gcttcgtcat tacccacggt accgacacga tggaagaaac tgcttacttc361 ctcgacctga cggtgaaatg cgacaaaccg gtggtgatgg tcggcgcaat gcgtccgtcc421 acgtctatga gcgcagacgg tccattcaac ctgtataacg cggtagtgac cgcagctgat481 aaagcctccg ccaaccgtgg cgtgctggta gtgatgaatg acaccgtgct tgatggccgt541 gacgtcacca aaaccaacac caccgacgta gcgaccttca agtctgttaa ctacggtcct601 ctgggttaca ttcacaacgg taagattgac taccagcgta ccccggcacg taagcatacc661 agcgacacgc cattcgatgt ctctaagctg aatgaactgc cgaaagtcgg cattgtttat721 aactacgcta acgcatccga tcttccggct aaagcactgg tagatgcggg ctatgatggc781 atcgttagcg ctggtgtggg taacggcaac ctgtataaat ctgtgttcga cacgctggcg841 accgccgcga aaaccggtac tgcagtcgtg cgttcttccc gcgtaccgac gggcgctacc901 actcaggatg ccgaagtgga tgatgcgaaa tacggcttcg tcgcctctgg cacgctgaac961 ccgcaaaaag cgcgcgttct gctgcaactg gctctgacgc aaaccaaaga tccgcagcag1021 atccagcaga tcttcaatca gtactaa根据该基因序列，使用Primer 5.0 设计引物，并考虑到后续构建克隆载体和表达载体的需求，在引物序列中添加限制性酶切位点和保护序列，获得引物如下：上游引物P1 ：GTGCAGCACATATGTTACCCAATATCACCA下游引物P2 ：GCGCTCGAGTTAGTACTGATTGAAAGATCTG上游引物P1 中包含一个Nde Ⅰ酶切位点，下游引物中包含一个Xho Ⅰ酶切位点。
所设计引物交由南京华大基因科技有限公司负责合成。
3.1.2 大肠杆菌全基因组DNA的提取使用大肠杆菌基因组DNA全提取试剂盒提取E.coli全基因组DNA，具体步骤如下：(1)从实验室斜面保存的E.coli野生型菌株CPU21009上，取接种环，挑单菌落，转移到50 mL的液体LB培养基，在温度37Ⅰ、180 r／min发酵过夜。
(2)取菌液1 mL至1.5 mL的离心管管中，离心机参数调至12000离心2 min，离心3 min，弃去上清液。
(3)加入0.2 mL GA缓冲液，用漩涡振荡器混合沉淀完全悬浮。
加入 4 μL RNaseA(100mg／mL)溶液，用涡旋振荡器振荡振荡15 s，室温放置5 min。
(4)加入0.02 mL蛋白酶K，混合均匀。
(5)加入0.02 mL GB缓冲液，混合均匀，将水浴锅调到70Ⅰ，把离心管放入10 min，短暂离心除去离心管管盖和管壁的水珠。
(6)加入0．22 mL分析纯乙醇，在15 s内充分混匀，此时会出现絮状物，短暂离心除去EP管盖和管壁的水珠。
(7)将(6)中所得絮状物和液体均加入安装进收集管的吸附柱中，离心机参数调至12000离心1 min，弃去柱底液体，安装好吸附柱。
(8)加0.5 mL GD缓冲液至吸附柱中，离心机参数调至12000离心1 min，倒掉柱底液体，并安装好吸附柱。
(9)加0.6 mL PW漂洗液至吸附柱中，离心机参数调至12000离心1 min，倒掉柱底液体，并安装好吸附柱。
(10)再加0.5 mL GD缓冲液，离心机参数调至12000离心1 min倒掉柱底液体。
(11)将吸附柱放入收集管中，离心机参数调至12000离心2 min，倒掉柱底液体。
在室温下静置20 min吸附柱，完全晾干漂洗液，使吸附材料干燥。
(12)将无乙醇气味的吸附柱放入干净的离心管中，悬滴0.04 mL双蒸水到吸附膜的中间部分，在室温静置5 min，离心机参数调至12000离心2 min，收集溶液。
(13)将(12)中收集的溶液吸净后加回吸附柱，放置5 min，离心机参数调至12000离心2 min。
(14)将提取后的DNA进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，以便用于后续操作。
3.1.3 PCR扩增ansB基因(1)在PCR扩增仪上设计如下反应程序：①模板DNA预变性94Ⅰ 5 min；②变性：94 Ⅰ条件下45 s；③退火：58 Ⅰ条件下30 s；④延伸：72 Ⅰ条件下1 min；⑤循环步骤②～④30次；⑥最后在72 Ⅰ延伸10 min。
(2)在PCR管建立整体为0.05 mL的PCR扩增反应体系：大肠杆菌总DNA模板0.003 mL上游引物P1 0.001 mL下游引物P2 0.001 mLTaq酶Mix 0.025 mLddH2O 0.02 mL(3)将样品混合后稍作离心，将反应管放入PCR扩增仪中进行PCR反应。
(4)结束PCR扩增，取0.005 mL溶液，进行1％Agarose gel electrophoresis鉴定，判断是否有基因片段存在于PCR中，以及其大小。
3.1.4 PCR扩增产物的纯化(1)将0.04 mL PCR扩增后体系用双蒸水调整至0.1 mL，加入0.5 mL结合液DB，充分混匀。
(2)将(1)中得到的溶液加入安装好的吸附柱，在室温下静置1 min，离心机参数调至12000离心1 min，倒掉管底的液体。
(3)加入0.5 mL用于洗涤的溶液，离心机参数调至12000离心1 min，倒掉管底的液体。
(4)加入0.5 mL用于洗涤的溶液，离心机参数调至12000离心1 min，倒掉管底的液体。
(5)将吸附柱重新安装好，空管离心2 min，尽最大可能得除去用于漂洗的液体，防止用于漂洗的液体中残留的分析纯乙醇在下游反应中有影响。