氨基酸柱前衍生化HPLC方法发展及应用

分别以邻苯二甲醛（ＯＰＡ）及２，４·二硝基氟苯（ＤＮＦＢ）为衍生化试剂，发展氨基酸的 柱前衍生ＨＰＬＣ分析方法。考察了柱温、衍生试剂用量、反应时间及流动相ｐＨ值等 因素对分析结果的影响。结果表明，柱温对分离选择性的影响很大，改变柱温甚至可 能影响到氨基酸ＤＮＦＢ衍生产物（ＤＮＰ．ＡＡ）的出峰顺序；衍生反应时间对ＯＰＡ衍生氨 基酸的定量分析影响显著。
１．２．２氨基酸ＨＰＬＣ分析方法的分类
氨基酸ＨＰＬＣ分析，按是否衍生可分为两大类：一类是直接分析法；另一类是衍 生化间接分析法刚。
１．２．２．１直接分析法
近年来，氨基酸直接分析法得到迅速发展，基于离子交换色谱的氨基酸分析仪己 成为直接分析法的主流，戴安公司上世纪推出的氨基酸ＡＡＡ－ＤｉｒｅｃｔｌＭ系统就是此种 方法的代表，采用高效阴离子交换色谱积分脉冲安培捡Ｎ法（ＨＰＡＥＣ．ＩＰＡＤ）。此法可 同时对一级和二级氨基酸进行检测，无需柱前、后衍生，直接进样；分离效果好、灵 敏度高、操作简单。但此类氨基酸分析仪专属性强，价格昂贵，大大限制其推广与应 用【２１２２１。
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氧基酸柱前衍生化ＨＰＬＣ方法发展及应用
ｌ绪论 １．１氨基酸
１．１．１氨基酸的定义
羧酸分子中烃基上的一个或几个氢原子被氨基取代的化合物叫做氨基酸，它是一 种小分子的两性化合物，相对分子量在７５－＇２００之间，是构成蛋白质的基本单元，其 化学通式如图１．１．１所示。
Ｈ Ｒ—Ｃ—ｅＯＯＨ
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１．１３氨基酸的应用【４．５】
１．１３．１临床、医学方面的应用
氨基酸在医药上的应用很广，各种氨基酸及氨基酸衍生物达１００多种。例如，氨 基酸的混合液可供病人注射用，氨基酸的混合粉剂可作宇航员、飞行员的补品。又如， Ａｒｇ药物用于治疗由氨中毒造成的肝昏迷；Ｓｅｔ药物用作疲劳恢复剂；Ｍｅｔ、Ｃｙｓ用于 治疗脂肪肝；Ｇｌｙ、Ｏｌｕ用于调节胃液等。 １．１３．２农业方面的应用
Ｔｏ ｉｍｐｒｏｖｅ ｔｈｅ ｐｏｏｒ ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｓｏｌｏ－ｐａｃｋｉｎｇ ｃｏｌｕｍｎｓ，ｔｈｅ Ｌｉｎｋ Ｍｏｄｅｌ ａｎｄ ｔｈｅ Ｃｏｍｂｉｎｅｄ Ｍｏｄｅｌ ｏｆｔｗｏ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｐａｃｋｉｎｇ ｍａｔｅｒｉａｌｓ ｗｅｒｅ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ，ａｆｔｅｒ ｔｈｅ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｂｅｈａｖｉｏｒ ｏｆ ５ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ Ｃ１８ ｐａｃｋｉｎｇ ｍａｔｅｒｉａｌｓ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ谢ｔｈ ＤＮＰ－ＡＡ．Ｉｔ ｐｒｏｖｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｌｉｎｋ ｍｏｄｅｌ ｕｓｉｎｇ Ｃ１８·－Ｂ ａｎｄ Ｃ１８··ＳＡ ｃｏｕｌｄ ｇｒｅａｔｌｙ ｉｍｐｒｏｖｅ ｔｈｅ ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ，ｗｈｉｌｅ ｔｈｅ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｍｏｄｅｌ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｔｗｏ ｐａｃｋｉｎｇｓ ｃｏｕｌｄ ａｃｈｉｅｖｅ ｂｅｔｔｅｒ ｐｅａｋ ｓｈａｐｅ ａｎｄ ｃｏｌｕｍｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ．
在生物体内出现的氨基酸都是Ｌ型，而Ｄ型氨基酸仅在少数微生物来源的多肽中出 现［２，３１。
１．１．２．３根据酸碱性分类
根据氨基酸分子中所含氨基和羧基数目的不同，可以将其分为酸性氨基酸、中性 氨基酸、碱性氨基酸。酸性氨基酸主要包括Ｇｌｕ、Ａｓｐ：碱性氨基酸主要有：Ｌｙｓ、Ａｒｇ、 Ｈｉｓ；其余基本氨基酸均为中性氨基酸。
ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｔｏ ｄｅｖｅｌｏｐ ｗｉｄｅｌｙ－ｓｕｉｔｅｄ ＨＰＬＣ ａｎａｌｙｓｉｓ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ａｎｌｍｏ ａｃｉｄｓ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ
ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ，ｇｏｏｄ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｓ ｗｅｌｌ ａｓ ｇｏｏｄ ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｉｌｉｔｙ．
Ｔｈｅ ｈｉｐ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ ｍｅｔｈｏｄｓ ｗｉｔｈ ｐｒｅ－ｃｏｌｕｍｎ
１．１．２．４从营养学角度分类
营养学上将氨基酸分为两大类，必需氨基酸和非必需氨基酸。对成人来说，必需 氨基酸有８种，包括Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ和Ｐｈｅ。对婴儿来说，Ｈｉｓ 也是必需氨基酸。非必需氨基酸包括Ｇｌｕ、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ｇｌｙ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｐｒｏ、Ｓｅｔ和
Ｂｙ ｔｈｅ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｍｅｔｈｏｄｓ ａｂｏｖｅ，ｔｈｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｏｆ ｓｏｍｅ ａｃｔｕａｌ ｓａｍｐｌｅｓ，ｓｕｃｈ ａｓ ｂｅｅｒ ａｎｄ Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ Ｓｉｎｅｎｓｉｓ，ｗｅｒｅ ｍｅａｓｕｒｅｄ．Ｍｅａｎｗｈｉｌｅ，ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ ｓａｍｐｌｅ ｐｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｗｅｒｅ ｉｍｐｒｏｖｅｄ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｍｅｔｈｏｄｓ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｗｉｄｅｌｙ ｓｕｉｔｅｄ．
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１．１．２．２根据旋光性分类 分子旋光性一般分为两种，一种是左旋，Ｌ型；一种是右旋，Ｄ型。通常情况下，
２
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氨摹酸柱前衍生化ＨＰＬＣ方法发展及应用
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：
ａｍｍｏ ａｃｉｄｓ；ｐｒｅ－ｃｏｌｍｕｎ ｄｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎ；
２，４－ｄｉｎｉｔｒｏ—ｆｌｕｏｒｏｂｅｎｚｅｎｅ； ｎｅｗ ＨＰＬＣ ｃｏｌｕｍｎ
ｏ－ｐｈｔｈａｌｄｉａｌｄｅｌｈｙｄｅ；
２
声明 本学位论文是我在导师的指导下取得的研究成果，尽我所知，在本 学位论文中，除了加以标注和致谢的部分外，不包含其他人已经发表或 公布过的研究成果，也不包含我为获得任何教育机构的学位或学历而使 用过的材料。与我一同工作的同事对本学位论文做出的贡献均已在论文
ＮＨ２ 图１．１．１氨基酸化学通式
１．１．２氨基酸的分类
１．１．２．１基本氨基酸
氨基酸的种类繁多，有成千上万种，其中与人类生活息息相关的基本氨基酸有 １８种，表１．１．２．１列出了１８种基本氨基酸的种类及基本性质。
表１．１．２．１基本氨基酸砷类及基本性质【１１
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氨基酸柱前衍生化ＨＰＬＣ方法发展及应用
农业上，一些氨基酸在体外并无杀菌功能，但它们能干扰植物与病原菌之间的生 化关系，使植物的代谢及抗病能力发生变化，从而达到杀菌的目的。例如，Ｐｈｅ和 Ａｌａ可用于治疗苹果疮痂病。Ｌｙｓ、Ｍｅｔ添加在饲料中，能加速家畜、家禽的生长，改 善肉的质量。
１．１．３３食品方面的应用
食品工业中，Ｇｌｙ、Ａｌａ具有甜味，Ａｓｐ、Ｏｌｕ具有酸味，谷氨酸钠、Ａｓｐ具有鲜 味，它们都可用作食品添加剂。Ｌｙｓ、Ｍｅｔ等人体必需的氨基酸常作为食品添加剂， 用以提高食品的营养价值。
ｄｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｗｅｒｅ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ，ｗｈｉｌｅ ＯＰＡ ａｎｄ ＤＮＦＢ ｗｅ北ｕｓｅｄ ａｓ ｔｈｅ ｄｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎ ａｇｅｎｔｓ．Ｓｅｖｅｒａｌ ｆａｃｔｏｒｓ，ｓｕｃｈ ａｓ ｃｏｌｕｍｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ，ｔｈｅ ｑｕａｎｔｉｔｙ ｏｆ ａｇｅｎｔｓ，ｒｅａｃｔｉｏｎ ｔｉｍｅ ａｎｄ ｔｈｅ ｐＨ ｏｆ ｍｏｂｉｌｅ ｐｈａｓｅ ｗｅｒｅ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ，ａｌｌ ｏｆ ｗｈｉｃｈ ｈａｄ ｅｆｆｅｃｔ Ｏｌｌ ｔｈｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｒｅｓｕｌｔｓ．Ａｓ ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ：ｔｈｅ ｃｏｌｕｍｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｃｏｕｌｄ ｔａｒｇｅｌｙ ａｆｆｅｃｔ ｔｈｅ ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ，ａｎｄ ｓｏｍｅｔｉｍｅｓ ｅｖｅｎ ｔｈｅ ｐｅａｋ ｏｒｄｅｒ ｏｆ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ’ｓ ＤＮＦＢ ｄｅｒｉｖａｔｅｓ（ＤＮＰ－ＡＡ）；ｗｈｉｌｅ，ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｄｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｔｉｍｅ ｈａｄ ｏｎ ｔｈｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆａｍｉｎｏ ａｃｉｄ’ｓ ＯＰＡｄｅｒｉｖａｔｅｓ ｗａｓ ｄｒａｍａｔｉｃａｌｌｙ．
１．１．３．４其它方面
此外，氨基酸及其衍生物与皮肤的成分相似，具有调节皮肤ｐＨ和保护皮肤的功 能，现已广泛用于配制各种化妆品。例如，Ｃｙｓ用于护发素中，Ｓｅｔ用于面霜中。又
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氨基酸柱前衍生化ＨＰＬＣ方法发展及应用
如，Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ａｌａ与脂肪酸形成的表面活性剂，具有清洗、抗菌等功能。用于护肤 品、洗发剂中。
为弥补单一色谱填料分离选择性的不足，通过对ＤＮＰ－ＡＡ在６种不同Ｃ１８填料 上分离行为的考察，发展了“串联”和“混装”的色谱柱模式。采用Ｃ１８．Ｂ与Ｃ１８．ＳＡ 串联的操作模式，可以使ＤＮＰ－ＡＡ的分离选择性得到较大改善。而以Ｃ１８．Ｂ和Ｃ１８．ＳＡ 填料混合装填色谱柱进行ＤＮＰ－ＡＡ的分离，所得峰形、柱效等更佳。
综上不难看出，氨基酸与人类生活密切相关。
１．２氨基酸ＦＩＰＬＣ分析
由于氨基酸对人类生活的重要性，氨基酸分析也一直是分析领域研究的重要课题 之一．
１．２．１氨基酸分析的发展
１９５４年，Ｈｉｔｓ、Ｍｏｏｒ、Ｓ画ｎ【６川较早提出采用磺酸盐离子交换树脂分析氨基酸， 并在此后几年将此项技术进一步发展；１９５８年，Ｓｐａｃｋｍａｎ、Ｍｏｏｒ、Ｓｔｅｉｎ合作嘲研制 出世界上第一台用离子交换树脂和柱后茚三酮衍生检测法的自动氨基酸分析仪，使氨 基酸定量分析进入一个崭新的阶段。２０世纪６０至８０年代，氨基酸分析的速度、灵 敏度、自动化程度均大大提高［９－１４１。２０世纪８０年代中后期，柱前衍生ＨＰＬＣ方法已 逐渐占据主导地位ｎ习。其中，激光诱导荧光检测器在ＨＰＬＣ中的应用，使检测灵敏 度提高到一个新的台阶【１６１。２０世纪９０年代戴安公司开发了ＡＡＡ－Ｄｉｒｅｅｔ ＴＭ氨基酸分 析系统，采用积分脉冲安培检测器直接检测。近年来，质谱、核磁与ＨＰＬＣ联用技术 引入氨基酸分析，大大提高了定性分析的准确性１１７－１９１。
南京理工大学 硕士学位论文 氨基酸柱前衍生化HPLC方法发展及应用 姓名：唐涛 申请学位级别：硕士 专业：物理化学 指导教师：王风云;李彤
20060601
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氨基酸柱前衍生化ＨＰＬＣ方法发展及应用
摘要
氨基酸是蛋白质的基本单元，是人体完成生理功能的必须物质。发展普适性广、 灵敏度高、分离效能好、重复性优良的ＨＰＬＣ分析方法，一直是分析化学领域探索的 重要课题。
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基于发展的新方法，测定了啤酒、冬虫夏草等实际样品中的氨基酸，并对样品的 预处理方法加以改进。结果表明，方法具有很好的普适性。
关键词：氨基酸柱前衍生化邻苯二甲醛２，４．二硝基氟苯新型ＨＰＬＣ柱
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氨基酸柱前衍生化ＨＰＬＣ方法发展及应用
Ａｂｓｔｒａｃｔ
Ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ，ｗｈｉｃｈ ｉｓ ｔｈｅ ｂａｓｉｃ ｕｎｉｔ ｏｆｐｒｏｔｅｉｎｓ，ｉｓ ｏｎｅ ｏｆｔｈｅ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｔｏ ｈｕｍａｎ ｂｅｉｎｇ．Ｔｈｕｓ，ｉｔ ｈａｓ ａｌｗａｙｓ ｂｅｅｎ ａｌｌ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｔｈｅｍｅ ｉｎ ｔｈｅ ｆｒｏｎｔｉｅｒ ｏｆ ａｎａｌｙｔｉｃａｌ
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