真菌菌悬液的制备

真菌菌悬液的制备
1）白色念珠菌悬液的制备
1）取冻干菌种管，在无菌操作下打开，以毛细吸管吸加适量沙堡液体培养基于管中，轻柔吹吸数次，使菌种融化分散。

取含 5.0 ml～10.0ml 沙堡液体培养基试管，滴入少许菌种悬液，置37℃培养18h～24h。

用接种环取第 1 代培养的菌悬液，划线接种于沙堡琼脂培养基平板上，于37℃培养18h～24h。

挑取上述第 2 代培养物中典型菌落，接种于沙堡琼脂斜面，于37℃培养18h～24h，即为第 3 代培养物。

2）取第3代～14代的沙堡琼脂培养基斜面新鲜培养物（18h～24h），
用 5.0 ml 吸管吸取 3.0 ml～5.0ml 稀释液加入斜面试管内，反复吹吸，洗下菌苔。

随后，用 5.0ml 吸管将洗液移至另一无菌试管中，用电动混合器混合20s，或在手掌上振敲80次，以使白色念珠菌菌悬浮均匀。

3）菌悬液的含菌量和菌片制备按2.1.1.2 要求进行。

4）菌悬液保存在4℃冰箱内备用。

当天使用不得过夜。

5）怀疑有污染时，应以菌落形态、革兰染色与生化试验等法进行鉴定。

菌落形态可直接用显微镜观察。

菌体形态可在涂片后直接用高倍显微镜观察，也可用墨水阴地法染色（将菌与黑墨水在玻片上混匀，推成薄膜）后观察。

（2）黑曲霉ATCC 16404 悬液或菌片的制备。

1) 在无菌操作下打开冻干菌种管，以毛细管吸取少量麦芽浸膏营养肉汤培养基加到菌种管中，轻轻吹吸，使菌种沉淀物融化分散。

取少许沉淀物悬液加到含 5.0ml 麦芽浸膏营养肉汤培养基试管中，置30℃±1℃培养42h～48h。

用接种环划线接种
第 1 代培养物于MEA 培养基平板，置30℃±1℃培养箱中培养42h～48h。

取平板培养物中的典型菌落，接种于麦芽浸膏营养肉汤培养基，置30℃±1℃培养箱中培
养42h～48h，即为第3代培养物。

2) 用10.0ml 吸管吸取5.0 ml～10.0ml 第 3 代培养物，接种罗氏瓶，并摇动使菌液布满MEA 培养基表面，然后将多余肉汤培养物液体吸出，置30℃±1℃培养42h～48h。

3) 向罗氏瓶培养物中加入5.0 ml～10.0ml 0.05%（V/V）吐温80 生理盐水溶液, 刮洗黑曲霉分生孢子于溶液中，将孢子悬液移入装有玻璃珠的三角瓶中，轻轻振
摇1min 后,滤过除去菌丝。

滤过后，显微镜下（400 倍）观察是否存在菌丝，若悬液中有菌丝存在，可经5000 r/min～6000 r/min，离心20min。

再次在显微镜下（400 倍）观察，若悬液中仍有菌丝存在，须再离心。

4) 黑曲霉分生孢子悬液在2℃～8℃储存不能超过 2 d，使用前，混合均匀，在显微镜下（400 倍）观察是否有孢子出芽，若有孢子出芽，则弃之不用。

5) 使用时，可用稀释液适当稀释。

6) 制备染菌样片时染菌方法为滴染法,每片加菌悬液10μl。

染菌后，
置37℃培养箱内烤干(约30min)，或置室温下自然阴干后再使用。

7) 回收菌数应达5×`10^5`cfu/片～5×`10^6`cfu/片，可依试验要求确定。

生孢梭菌菌悬液制备
其实无菌方法验证中的菌悬液的制备也是依中国药典（2005年版二部）附录XI H无菌检查法中“培养基灵敏度检查”项下的方法，制备成小于100 CFU/ml的对照用菌液。

所以无论你做什么，菌悬液的制备方法都是一样的。

具体方法就是，先把生孢梭菌在硫乙醇中培养24小时，然后吸取1毫升培养液用生理盐水进行10倍稀释，我的经验是，稀释到10的-7次方就是在100cfu以下了（这个你得自己多做几次平行实验或验证实验，看到底稀释到多少倍。

最初不好把握的时候可以同时培养几个临近的梯度），然后取至少200ml的硫乙醇酸盐培养基到试管里（要求无菌），然后接种1ml 制备好的菌悬液到硫乙醇试管里，在32.5度下培养18h，然后开始计数。

生孢梭菌在液体的硫乙醇里会长成梭子一样的单个菌落，这时拿的时候千万不要震动，然后开始计数（一个单独的“梭子”计一个菌落）。

注：如果培养时间太长会产生浑浊，不便于计数。

如果震动试管也会浑浊。

硫乙醇的量尽量大一点，这样便于计数。