佐剂

1、我用两个注射器进行等量抗原与弗氏不完全佐剂的乳化,可是乳化了四个多小时后,滴在冰水里还是很快扩散,麻烦各位帮忙分析一下乳化失败的原因,多谢!

弗氏佐剂是目前动物实验中最常用的佐剂，分为不完全弗氏佐剂和完全弗氏佐剂。不完全弗氏佐剂是液体石蜡与羊毛脂混合而成，组分比为1～5：1，可根据需要而定，通常为2：1。不完全佐剂中加卡介苗(最终浓度为2～20mg/ml)或死的结核分枝杆菌，即为完全弗氏佐剂。上述佐剂经高压灭菌后，低温保存备用。

在免疫动物前，先将弗氏佐剂与抗原按一定比例混合，制备成"油包水"乳状液。佐剂和抗原体积比一般为1：1。佐剂与抗原乳化可按如下方法进行：（1）研磨法：先将佐剂加热并取适量放入无菌的玻璃研钵内，待冷却后再缓缓滴入等体积的抗原溶液，边滴边按同一方向研磨，滴加抗原的速度要慢。待抗原全部加入后，继续研磨一段时间，使之成为乳白色粘稠的油包水乳剂。本法适于制备大量的佐剂抗原，缺点是研钵壁上粘附大量乳剂，抗原损失较大。

（2）注射器混合法：将等量的弗氏佐剂和抗原溶液分别吸入两个注射器内，两注射器之间以一细胶管相连，注意排净空气，然后交替推动针管，直至形成粘稠的乳剂为止。本法优点是容易做到无菌操作，适用于制备少量的抗原乳剂。制备好的乳化剂经鉴定才能适用。鉴定方法是将乳化剂滴入冷水中，若保持完整不分散，成滴状浮于水面，即乳化完全，为合格的油包水剂。可以取弗式不完全佐剂滴在水里试试，看看是不是佐剂的问题！wo

我们常常用很细的匀浆器来乳化，很好用注意把水相推到油相，我试过，这样大概十几分钟就乳化好了，反过来可能怎么都不好（有两次我推反了足足2个小时我手都快抽筋了都不好），原理是油包水型的是水到大量的油中才行，反过来就成水包油了，在药剂书上有

弗氏佐剂

弗氏佐剂是目前动物实验中最常用的佐剂，分为不完全弗氏佐剂和完全弗氏佐剂。不完全弗氏佐剂是液体石蜡与羊毛脂混合而成，组分比为1～5：1，可根据需要而定，通常为2：1。不完全佐剂中加卡介苗（最终浓度为2～20mg/ml）或死的结核分枝杆菌，即为完全弗氏佐剂（FCA）。一般首次注射时用1／2体积FCA 加上1／2体积的抗原进行乳化，第二次或第三次注射时用不完全佐剂或不用佐剂。如不加佐剂，则抗原量增大10-20倍。

配制方法：按比例将羊毛脂与石蜡油置容器内，用超声波使之混匀，高压灭菌，置4℃下保存备用。

在免疫动物前，先将弗氏佐剂与抗原按一定比例混合，佐剂和抗原体积比一般为1：1，制备成"油包水"乳状液。因为含SDS很易促使其乳化成油包水抗原乳化复合物，注射入动物体内时一定要保持乳化状态。抗原用量视抗原分子量不同及免疫原性及免疫动物不同而有一定差异，无统一标准和固定模式。一般是每兔（约2kg重）或每羊（约20kg重）第1次注射抗原1mg，以后逐次增加抗原量，最多每次不超过3mg。佐剂与抗原乳化可按如下方法进行：

（1）研磨法

先将佐剂加热并取适量放入无菌的玻璃研钵内，待冷却后再缓缓滴入等体积的抗原溶液，边滴边按同一方向研磨，滴加抗原的速度要慢。待抗原全部加入后，继续研磨一段时间，使之成为乳白色粘稠的油包水乳剂。本法适于制备大量的佐剂抗原，缺点是研钵壁上粘附大量乳剂，抗原损失较大。

（2）注射器混合法

将等量的弗氏佐剂和抗原溶液分别吸入两个注射器内，两注射器之间以一细胶管相连，注意排净空气，然后交替推动针管，直至形成粘稠的乳剂为止。本法优点是容易做到无菌操作，抗原损失少，适用于制备少量的抗原乳剂。但同时难以乳化完全，个别抗原，用塑料注射器根本推不动，而用玻璃注射器又有渗漏。制备好的乳化剂经鉴定才能适用。鉴定方法是将乳化剂滴入冷水中，若保持完整不分散，成滴状浮于水面，即乳化完全，为合格的油包水剂。

（3）超声

实验室条件好点的，比如说有超声破碎仪的，一定要控制超声频率和时间，超声容易激发一些自由基，对抗原有未知损害。乳化方法要根据抗原和需要而定。

2、氢氧化铝佐剂

取5%硫酸铝溶液250ml，在强烈搅拌下加入5%氢氧化钠溶液100ml，用生理盐水离心洗涤沉淀2次，再悬入生理盐水中使达250ml。免疫接种时，取适量氢氧化铝佐剂加等体积抗原即可免疫。

佐剂与抗原乳化的方法

*研磨法：适于制备大量的佐剂抗原

-先将不彻底佐剂加热，取1.73ml放人无菌玻璃研钵内；缓缓滴入0.23ml活卡介苗，边滴边按同一方向研磨，使菌体彻底分散。

-按同样方法滴人抗原，每加一滴应研磨至小滴消失。滴加抗原的速度要慢，待抗原全部加人后，应成为乳白色粘稠的油包水乳剂。

*缺点：研钵壁上粘附大量乳剂，抗原损失较大，对微量或难得抗原不宜采用。

佐剂与抗原乳化的方法(续)

*注射器混合法

-将等量的彻底佐剂和抗原分别吸人两个5ml注射器内，然后插入三通管内，交替推动针管混匀，往复操作直至形成粘稠的乳剂为止。健康生活从开始！

*优点：无菌操作，节省抗原或佐剂。

*缺点：不易乳化，时间长。

佐剂与抗原乳化的方法(续)

*快速乳化法：利用超声波粉碎器可快速乳化抗原和佐剂混合物。

-将抗原和佐剂按所需量加入一离心管中，置于超声波粉碎器上，粉碎头浸入液面下0.5cm ，离瓶底0.5cm左右，以免打碎离心管。

-每次乳化10～15s ，然后置冰箱lmin左右。反复乳化3～4次即可彻底乳化。管内残余量800r/min离心5～10min收集。

*优点：简朴、快速、节省材料。

乳化剂的鉴定

*判断乳化是否充分，可以将一滴乳化好的液体滴在水面上(冷水中) ，如能长时间保持圆珠形而不散开，表示乳化达到要求。

(3) 免疫方法——免疫途径

1，疫苗,为本所自制混合疫苗．用量1%

2 佐剂：sigma公司产品

1ppm;2.5ppm.5ppm

【嗜水气单胞菌外膜蛋白W基因的表达及其免疫原性分析】

以体重25~30g的草鱼为免疫对象

用PBS稀释融合蛋白至所需浓度，与等体积的弗氏不完全佐剂完全混匀，腹腔注射0.2ml/尾。免疫两周后，再用相同的蛋白剂量加强免疫1次。分别从免疫2周和加强免疫2周后的每组鱼中取3尾鱼的血清。

加强免疫2周后，根据预实验结果采用半致死浓度进行攻毒。攻毒的菌液浓度为6×107 CFU/ml，每尾注射0.1ml。观察2周，每日记录发病与死亡鱼的数量，统计死亡率。

0.01M 磷酸盐缓冲液（PBS）配制方法