ELISA试验技术要点
ELISA试验技术要点
1.抗原和抗体：ELISA试验的基础是抗原与抗体的特异性结合。抗原
是分子或物质，可以激发免疫系统产生抗体。抗体是由免疫系统产生的蛋
白质，可以与特定抗原结合。在ELISA试验中，通常至少需要一种抗原和
一种抗体。
2.固相载体：ELISA试验通常需要使用固相载体来固定抗原或抗体。
常用的固相载体包括微孔板、磁珠和膜。微孔板是最常用的固相载体，其
表面通常涂有抗原或抗体，并能与试样中的抗体或抗原发生特异性结合。
磁珠和膜在一些特定实验中也有应用。
3.目标分子的检测：ELISA试验可以用于检测和定量分析各种目标分子，包括蛋白质、抗体、细胞因子、药物、代谢产物等。通过选择合适的
抗体对，可以实现对目标分子的高灵敏度和高特异性的检测。
4.直接ELISA：直接ELISA是最简单的ELISA形式之一，其适用于检
测抗原。直接ELISA中，固相载体上涂有相应的抗体，待测抗原直接与抗
体发生特异性结合。通过将固相载体进行洗涤，去除未结合的物质，可以
测量已结合抗原的含量。
6.间接亲和ELISA：间接亲和ELISA在间接ELISA的基础上更进一步，通过添加竞争性抑制物来检测少量的抗体。这种方法可以在低浓度的抗体
中实现更高的敏感度。
7.双抗原ELISA：双抗原ELISA是另一种用于检测抗体的ELISA形式。在这种方法中，首先将抗原与抗体结合，然后再添加标记有酶的第二抗体
与待测抗体结合。通过测量标记物的酶活性，可以得出待测抗体的含量。
8.酶标记物和底物：为了检测待测分子的存在，ELISA试验常使用酶
标记物和底物。酶标记物是一种酶化合物，结合在抗体或抗原上。常用的
酶标记物包括辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶（AP）等。底物是一
种可以与酶催化产生颜色的反应物质，如TMB（3,3',5,5'-四甲基联苯二胺）或ABTS（2,2'-氨丙基苯并咪唑-2-磺酸盐）。通过测量底物的颜色
变化，可以确定待测分子的存在和含量。
9.数据分析和结果解释：ELISA试验通常通过比较标准曲线上的样品
测量值，来确定待测分子的浓度。标准曲线是用已知浓度的标准物制备的，通过测量标准物的浓度和对应的光密度，可以绘制出标准曲线。根据待测
样品的光密度，可以通过标准曲线插值计算出待测分子的浓度。
总结：ELISA试验是一种常用的生物医学和生物化学研究技术，具有
高灵敏度和高特异性的优点。通过选择合适的抗原和抗体，以及合适的酶
标记物和底物，可以实现对各种目标分子的定量检测。数据分析和结果解
释需要通过比较样品测量值和标准曲线来确定待测分子的浓度。ELISA试
验在医学诊断、药物研发和生物学研究中具有广泛的应用。
elisa检测方法操作要点
ELISA检测方法操作要点 1 标本的采取和保存 可用作ELISA测定的标本十分广泛，体液（如血清）、分泌物（唾液）和排泄物（如尿液、粪便）等均可作标本以测定其中某种抗体或抗原成份。有些标本可直接进行测定（如血清、尿液），有些则需经预处理（如粪便和某些分泌物）。大部分ELISA检测均以血清为标本。血浆中除尚含有纤维蛋白原和抗凝剂外，其他成份均同等于血清。制备血浆标本需借助于抗凝剂，而血清标本只要待血清自然凝固、血块收缩后即可取得。除特殊情况外，在医学检验中均以血清作为检测标本。在ELISA中血浆和血清可同等应用。血清标本可按常规方法采集，应注意避免溶血，红细胞溶解时会释放出具有过氧化物酶活性的物质，以HRP为标记的ELISA测定中，溶血标本可能会增加非特异性显色。 血清标本宜在新鲜时检测。如有细菌污染，菌体中可能含有内源性HRP，也会产生假阳性反应。如在冰箱中保存过久，其中的可发生聚合，在间接法ELISA中可使本底加深。一般说来，在5天内测定的血清标本可放置于4℃，超过一周测定的需低温冰存。冻结血清融解后，蛋白质局部浓缩，分布不均，应充分混匀宜轻缓，避免气泡，可上下颠倒混和，不要在混匀器上强烈振荡。混浊或有沉淀的血清标本应先离心或过滤，澄清后再检测。反复冻融会使抗体效价跌落，所以测抗体的血清标本如需保存作多次检测，宜少量分装冰存。保存血清自采集时就应注意无菌操作，也可加入适当防腐剂。 2 试剂的准备 按试剂盒说明书的要求准备实验中需用的试剂。ELISA中用的蒸馏水或去离子水，包括用于洗涤的，应为新鲜的和高质量的。自配的缓冲液应用pH计测量较正。从冰箱中取出的试验用试剂应待温度与室温平衡后使用。试剂盒中本次试验不需用的部分应及时放回冰箱保存。 3 加样 在ELISA中一般有3次加样步聚，即加标本，加酶结合物，加底物。加样时应将所加物加在LEI SA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡。 加标本一般用微量加样器，按规定的量加入板孔中。每次加标本应更换吸嘴，以免发生交叉污染，也可用一次性的定量塑料管加样。有此测定（如间接法ELISA）需用稀释的血清，可在试管中按规定的稀释度稀释后再加样。也可在板孔中加入稀释液，再在其中加入血清标本，然后在微型震荡器上震荡1分钟以保证混和。加酶结合物应用液和底物应用液时可用定量多道加液器，使加液过程迅速完成。 4 保温 在ELISA中一般有两次抗原抗体反应，即加标本和加酶结合物后。抗原抗体反应的完成需要有一定的温度和时间，这一保温过程称为温育(incubation)，有人称之为孵育，在ELISA中似不恰当。
ELISA操作原理、步骤及注意事项
ELISA操作原理、步骤及注意事项优质的试剂，良好的仪器和正确的操作是保证ELISA检测结果准确可靠的必要条件。 1 标本的采取和保存 可用作ELISA测定的标本十分广泛，体液、分泌物和排泄物）等均可作标本以测定其中某种抗体或抗原成份。有些标本可直接进行测定（如血清、尿液），有些则需经预处理（如粪便和某些分泌物）。大部分ELISA检测均以血清为标本。血浆中除尚含有纤维蛋白原和抗凝剂外，其他成份均同等于血清。制备血浆标本需借助于抗凝剂，而血清标本只要待血清自然凝固、血块收缩后即可取得。除特殊情况外，在医学检验中均以血清作为检测标本。在ELISA中血浆和血清可同等应用。血清标本可按常规方法采集，应注意避免溶血，红细胞溶解时会释放出具有过氧化物酶活性的物质，以HRP为标记的ELISA 测定中，溶血标本可能会增加非特异性显色。 血清标本宜在新鲜时检测。如有细菌污染，菌体中可能含有内源性HRP，也会产生假阳性反应。如在冰箱中保存过久，其中的可发生聚合，在间接法ELISA中可使本底加深。一般说来，在5天内测定的血清标本可放置于4℃，超过一周测定的需低温冰存。冻结血清融解后，蛋白质局部浓缩，分布不均，应充分混匀宜轻缓，避免气泡，可上下颠倒混和，不要在混匀器上强烈振荡。混浊或有沉淀的血清标本应先离心或过滤，澄清后再检测。反复冻融会使抗体效价跌落，所以测抗体的血清标本如需保存作多次检测，宜少量分装冰存。保存血清自采集时就应注意无菌操作，也可加入适当防腐剂（见3.2.4）。 2 试剂的准备 按试剂盒说明书的要求准备实验中需用的试剂。ELISA中用的蒸
馏水或去离子水，包括用于洗涤的，应为新鲜的和高质量的。自配的缓冲液应用pH计测量较正。从冰箱中取出的试验用试剂应待温度与室温平衡后使用。试剂盒中本次试验不需用的部分应及时放回冰箱保存。 3 加样 在ELISA中一般有3次加样步聚，即加标本，加酶结合物，加底物。加样时应将所加物加在LEISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡。 加标本一般用微量加样器，按规定的量加入板孔中。每次加标本应更换吸嘴，以免发生交叉污染，也可用一次性的定量塑料管加样。有此测定（如间接法ELISA）需用稀释的血清，可在试管中按规定的稀释度稀释后再加样。也可在板孔中加入稀释液，再在其中加入血清标本，然后在微型震荡器上震荡1分钟以保证混和。加酶结合物应用液和底物应用液时可用定量多道加液器，使加液过程迅速完成。 4 保温 在ELISA中一般有两次抗原抗体反应，即加标本和加酶结合物后。抗原抗体反应的完成需要有一定的温度和时间，这一保温过程称为温育(incubation)，有人称之为孵育，在ELISA中似不恰当。 ELISA属固相免疫测定，抗原、抗体的结合只在固相表面上发生。以抗体包被的夹心法为例，加入板孔中的标本，其中的抗原并不是都有均等的和固相抗结合的机会，只有最贴近孔壁的一层溶液中的抗原直接与抗体接触。这是一个逐步平衡的过程，因此需经扩散才能达到反应的终点。在其后加入的酶标记抗体与固相抗原的结合也同样如此。这就是为什么ELISA反应总是需要一定时间的温育。 温育常采用的温度有43℃、37℃、室温和4℃（冰箱温度）等。
ELISA试验技术要点
ELISA试验技术要点 1.抗原和抗体：ELISA试验的基础是抗原与抗体的特异性结合。抗原 是分子或物质，可以激发免疫系统产生抗体。抗体是由免疫系统产生的蛋 白质，可以与特定抗原结合。在ELISA试验中，通常至少需要一种抗原和 一种抗体。 2.固相载体：ELISA试验通常需要使用固相载体来固定抗原或抗体。 常用的固相载体包括微孔板、磁珠和膜。微孔板是最常用的固相载体，其 表面通常涂有抗原或抗体，并能与试样中的抗体或抗原发生特异性结合。 磁珠和膜在一些特定实验中也有应用。 3.目标分子的检测：ELISA试验可以用于检测和定量分析各种目标分子，包括蛋白质、抗体、细胞因子、药物、代谢产物等。通过选择合适的 抗体对，可以实现对目标分子的高灵敏度和高特异性的检测。 4.直接ELISA：直接ELISA是最简单的ELISA形式之一，其适用于检 测抗原。直接ELISA中，固相载体上涂有相应的抗体，待测抗原直接与抗 体发生特异性结合。通过将固相载体进行洗涤，去除未结合的物质，可以 测量已结合抗原的含量。 6.间接亲和ELISA：间接亲和ELISA在间接ELISA的基础上更进一步，通过添加竞争性抑制物来检测少量的抗体。这种方法可以在低浓度的抗体 中实现更高的敏感度。 7.双抗原ELISA：双抗原ELISA是另一种用于检测抗体的ELISA形式。在这种方法中，首先将抗原与抗体结合，然后再添加标记有酶的第二抗体 与待测抗体结合。通过测量标记物的酶活性，可以得出待测抗体的含量。
8.酶标记物和底物：为了检测待测分子的存在，ELISA试验常使用酶 标记物和底物。酶标记物是一种酶化合物，结合在抗体或抗原上。常用的 酶标记物包括辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶（AP）等。底物是一 种可以与酶催化产生颜色的反应物质，如TMB（3,3',5,5'-四甲基联苯二胺）或ABTS（2,2'-氨丙基苯并咪唑-2-磺酸盐）。通过测量底物的颜色 变化，可以确定待测分子的存在和含量。 9.数据分析和结果解释：ELISA试验通常通过比较标准曲线上的样品 测量值，来确定待测分子的浓度。标准曲线是用已知浓度的标准物制备的，通过测量标准物的浓度和对应的光密度，可以绘制出标准曲线。根据待测 样品的光密度，可以通过标准曲线插值计算出待测分子的浓度。 总结：ELISA试验是一种常用的生物医学和生物化学研究技术，具有 高灵敏度和高特异性的优点。通过选择合适的抗原和抗体，以及合适的酶 标记物和底物，可以实现对各种目标分子的定量检测。数据分析和结果解 释需要通过比较样品测量值和标准曲线来确定待测分子的浓度。ELISA试 验在医学诊断、药物研发和生物学研究中具有广泛的应用。
ELISA技术的操作要点
ELISA技术的操作要点 优质的试剂，良好的仪器和正确的操作是保证ELISA检测结果准确可靠的必要条件。 标本的采取和保存 可用作ELISA测定的标本十分广泛，体液（如血清）、分泌物（唾液）和排泄物（如尿液、粪便）等均可作标本以测定其中某种抗体或抗原成份。有些标本可直接进行测定（如血清、尿液），有些则需经预处理（如粪便和某些分泌物）。大部分ELISA检测均以血清为标本。血浆中除尚含有纤维蛋白原和抗凝剂外，其他成份均同等于血清。制备血浆标本需借助于抗凝剂，而血清标本只要待血清自然凝固、血块收缩后即可取得。除特殊情况外，在医学检验中均以血清作为检测标本。在ELISA中血浆和血清可同等应用。血清标本可按常规方法采集，应注意避免溶血，红细胞溶解时会释放出具有过氧化物酶活性的物质，以HRP为标记的ELISA测定中，溶血标本可能会增加非特异性显色。 血清标本宜在新鲜时检测。如有细菌污染，菌体中可能含有内源性HRP，也会产生假阳性反应。如在冰箱中保存过久，
其中的可发生聚合，在间接法ELISA中可使本底加深。 一般说来，在5天内测定的血清标本可放置于4℃，超过一周测定的需低温冰存。冻结血清融解后，蛋白质局部浓缩，分布不均，应充分混匀宜轻缓，避免气泡，可上下颠倒混和，不要在混匀器上强烈振荡。混浊或有沉淀的血清标本应先离心或过滤，澄清后再检测。反复冻融会使抗体效价跌落，所以测抗体的血清标本如需保存作多次检测，宜少量分装冰存。保存血清自采集时就应注意无菌操作，也可加入适当防腐剂。 试剂的准备 按试剂盒说明书的要求准备实验中需用的试剂。ELISA中用的蒸馏水或去离子水，包括用于洗涤的，应为新鲜的和高质量的。自配的缓冲液应用pH计测量较正。从冰箱中取出的试验用试剂应待温度与室温平衡后使用。试剂盒中本次试验不需用的部分应及时放回冰箱保存。 加样 在ELISA中一般有3次加样步聚，即加标本，加酶结合物，加底物。加样时应将所加物加在LEISA板孔的底部，避免加
ELISA原理(实验条件、技术要点)
ELISA原理（实验条件、技术要点） 实验条件和技术要点： 酶联免疫吸附测定（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay,简称ELISA）与免疫酶测定等名称所指的内容是不相同的，ELISA的内容专指固相吸附技术和免疫酶标抗体（或抗原）技术相结合的一种方法，它是将抗原或抗体包被在固相支持物（或称载体上），然后再进行免疫反应，形成酶标记的抗原抗体复合物，反应完毕，借助底物显示特异结合的标记抗体（或抗原）上的酶活性，用酶与底物反应后生成的有色产物进行光密度测定，达到抗原或抗体定量的目的。 在应用ELISA时，首先要清楚下面内容：1，是检测抗体还是抗原？2，检测的结果是定性还是定量？3，是否需要检测特异抗体的类型？4，所用抗体/单克隆抗体的亲和力怎样？ (1)检测抗原最常用于检测抗原的方法是非竞争性的双抗体夹心法，其次是竞争法。但竞争法在具体实验中有些困难，特别是检测微生物的抗原，因为需要标记抗原，这对于某些抗原是很难做到的，甚至是不可能的。另外在竞争法中，酶标记的抗原与标本直接混合在一起，许多标本中含有酶抑制剂或蛋白A样物质，可影响ELISA的结果。 (2)检测抗体检测抗体种类常用的方法是检测抗体种类的捕获法，这个方法常用于检测特异性IgG、IgA和IgM.。这个方法的第一步是捕获所需要检测的一个种类的抗体，接下来是检测捕获的抗体是否是特异性抗原的抗体。间接ELISA 在检测IgG时比较简单，但不适用于检测其他种类的抗体，因为血清中如果有特异IgG存在将与IgM或IgA等竞争结合抗原。 竞争法检测抗体有两种方法：一种是将标记的抗体和标本同时加入反应孔内，但标记的抗体和标本中的抗体必须是结合抗原的不同决定簇；另一种是先加标本，冲洗后再加标记的抗体。竞争法检测抗体比间接法容易判断结果，并且比较敏感和特异。不论选择哪种方法，ELISA都包括6个步骤：1，抗原或抗体吸附于固相；2.加标本和试剂；3，孵育和冲洗；4，加酶标抗原或抗体；5，加适当的底物；6，检测和分析结果。 虽然ELISA法在理论上十分简单，但每一步都有要注意的事项。不论是新设计的ELISA还是沿用其他ELISA方法都有以下几方面技术要点：固相载体的选择和试剂的制备，反应条件和操作的标准化。酶标记抗原竞争法利用混合的未标记抗原和酶标记抗原相互竞争抗体上的结合点，从而进行抗原的定量。未标记抗原的量越大，则酶标记抗原和抗体的结合就越受到抑制。但是竞争法在实验时比较复杂，有时在抗原混合液与相应抗体孵育后，在测定游离抗原与抗体相结合抗原的活性以前，要先进行盐析或有机溶剂沉淀或第二抗体沉淀等方法把两种不同存在形态的抗原分开。并且在加入底物后，容易产生血清色的物质。因此，每次测定时都需做空白对照。由于这些缺点，酶标记抗原竞争法使用不多。 促销期间有精美礼品赠送还可以享受免费代测服务。您只需要把标本寄给我们，一星期左右就可以出实验数据。欢迎购买我公司的ELISA试剂盒，我们承诺试剂盒有质量问题包退包换！
酶联免疫吸附技术(ELISA)的操作要点
酶联免疫吸附技术（ELISA）的操作要点 优质的试剂，良好的仪器和正确的操作是保证ELISA检测结果准确可靠的必要条件。ELISA的操作因固相载体的形成不同而有所差异，国内医学检验一般均用板式点。本文将叙述板式ELISA各个操作步骤的注意要点，珠式、管式及磁性球ELSIA，国外试剂均与特殊仪器配合应用，两者均有详细的使用说明，严格遵照规定操作，必能得出准确的结果。 1 标本的采取和保存 可用作 ELISA测定的标本十分广泛，体液（如血清）、分泌物（唾液）和排泄物（如尿液、粪便）等均可作标本以测定其中某种抗体或抗原成份。有些标本可直接进行测定（如血清、尿液），有些则需经预处理（如粪便和某些分泌物）。大部分ELISA检测均以血清为标本。血浆中除尚含有纤维蛋白原和抗凝剂外，其他成份均同等于血清。制备血浆标本需借助于抗凝剂，而血清标本只要待血清自然凝固、血块收缩后即可取得。除特殊情况外，在医学检验中均以血清作为检测标本。在ELISA中血浆和血清可同等应用。 血清标本可按常规方法采集，应注意避免溶血，红细胞溶解时会释放出具有过氧化物酶活性的物质，以HRP 为标记的ELISA测定中，溶血标本可能会增加非特异性显色。 2 试剂的准备 按试剂盒说明书的要求准备实验中需用的试剂。 ELISA中用的蒸馏水或去离子水，包括用于洗涤的，应为新鲜的和高质量的。自配的缓冲液应用pH 计测量较正。从冰箱中取出的试验用试剂应待温度与室温平衡后使用。试剂盒中本次试验不需用的部分应及时放回冰箱保存。 3 加样 在 ELISA中一般有3 次加样步聚，即加标本，加酶结合物，加底物。加样时应将所加物加在LEISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡。 加标本一般用微量加样器，按规定的量加入板孔中。每次加标本应更换吸嘴，以免发生交叉污染，也可用一次性的定量塑料管加样。有此测定（如间接法 ELISA）需用稀释的血清，可在试管中按规定的稀释度稀释后再加样。也可在板孔中加入稀释液，再在其中加入血清标本，然后在微型震荡器上震荡1 分钟以保证混和。加酶结合物应用液和底物应用液时可用定量多道加液器，使加液过程迅速完成。 4 保温 在 ELISA中一般有两次抗原抗体反应，即加标本和加酶结合物后。抗原抗体反应的完成需要有一定的温度和时间，这一保温过程称为温育(incubation) ，有人称之为孵育，在ELISA中似不恰当。 ELISA属固相免疫测定，抗原、抗体的结合只在固相表面上发生。以抗体包被的夹心法为例，加入板孔中的标本，其中的抗原并不是都有均等的和固相抗结合的机会，只有最贴近孔壁的一层溶液中的抗原直接与抗体接触。这是一个逐步平衡的过程，因此需经扩散才能达到反应的终点。在其后加入的酶标记抗体与固相抗原的结合也同样如此。这就是为什么ELISA反应总是需要一定时间的温育。温育常采用的温度有 43℃、37℃、室温和4℃（冰箱温度）等。37℃是实验室中常用的保温温度，也是大多数抗原抗体结合的合适温度。在建立ELI SA方法作反应动力学研究时，实验表明，两次抗原抗体反应一般在37℃经1-2 小时，产物的生成可达顶峰。为加速反应，可提高反应的温度，有些试验在43℃进行，但不宜采用更高的
ELISA原理及步骤(附教学视频)
ELISA的操作步骤 教学视频：/v_show/id_XMjI1MjUwNTk2.html 方法一：用于检测未知抗原的双抗体夹心法： 1.包被：用0.05M PH9，碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～10μg／ml，在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。 2.加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时。然后洗涤。（同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔）。 3.加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体（经滴定后的稀释度）0.1ml，37℃孵育0.5～1小时，洗涤。 4.加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB(四甲基联苯胺)底物溶液0.1ml，37℃10～30分钟。 5.终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。 6.结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。也可测OD值：在ELISA检测仪上，于450nm（若以ABTS显色，则410nm）处，以空白对照孔调零后测各孔OD值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。 方法二：用于检测未知抗体的间接法： 用包被缓冲液将已知抗原稀释至1～10μg／ml，每孔加0.1ml，4℃过夜。次日洗涤3次。加一定稀释的待检样品（未知抗体）0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时，洗涤。（同时做空白、阴性及阳性孔对照）于反应孔中，加入新鲜稀释的酶标第二抗体（抗抗体）0.1ml，37℃孵育30～60分钟，洗涤，最后一遍用DDW洗涤。其余步骤同“双抗体夹心法”的4、5、6。 酶联免疫分析技术(ELISA) 一、酶联免疫分析的基本原理和方法类型 1971年瑞典学者Engva11, 荷兰学者Van Weerman等分别报道将免疫技术发展为检测体液中微量物质的固相免疫
elisa操作过程中的注意事项
elisa操作过程中的注意事项 Elisa（酶联免疫吸附试验）是一种常用的实验方法，用于检测抗体或抗原的存在和浓度水平。在进行Elisa实验时，有一些注意事项需要遵循，以确保实验结果的准确性和可靠性。本文将介绍Elisa操作过程中的注意事项，帮助您顺利完成实验。 实验前的准备工作非常重要。确保所有试剂和设备都按照指示进行保存和储存，并检查它们的有效期。此外，实验室应保持清洁整洁，并遵循良好的实验室操作规范，如佩戴实验手套和实验室外套。 在进行Elisa实验之前，需要准备样品和标准曲线。样品的选取和处理要仔细进行，确保样品的纯度和稳定性。如果需要进行稀释，应根据实验要求选择适当的稀释液，并按照比例进行稀释。 接下来，选择合适的酶标板进行实验。酶标板的材质和孔数应根据实验要求进行选择。在将样品和标准品加入酶标板孔中之前，应先进行预洗步骤。预洗可以去除杂质和非特异性结合，从而提高实验的灵敏度和特异性。 在加入样品和标准品之前，要确保将酶标板孔标记清楚，并按照实验设计进行分组。此外，为了避免交叉污染，每个孔要使用新的吸头或移液器头。在加样过程中，要保持操作的准确性和稳定性，避免溅出或误操作。
加样完成后，将酶标板密封，并进行孵育步骤。孵育温度和时间应根据实验要求进行调整。在孵育过程中，要避免震动或移动酶标板，以免干扰反应。此外，为了保持温度的稳定性，可以将酶标板放置在恒温箱中进行孵育。 孵育完成后，需要进行洗涤步骤。洗涤的目的是去除非特异性结合物质，从而减少背景干扰。洗涤缓冲液的选择和洗涤次数要根据实验要求进行调整。洗涤过程中，要注意不要将吸头或移液器头碰到酶标板底部，以免损坏酶标板。 洗涤完成后，需要加入检测抗体或底物。在加入检测抗体之前，要先进行适当的稀释，并确保检测抗体的纯度和活性。加入检测抗体后，要进行二次孵育和洗涤步骤，以确保特异性结合和去除非特异性结合。 进行底物反应和读板步骤。底物的选择要根据实验要求进行，常见的底物有TMB（3,3',5,5'-四甲基苯基二氨基联苯基三甲基苯并噻唑啉）和ABTS（2,2'-联氨基双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)）。底物反应的时间和反应停止液的选择要根据实验要求进行调整。 在读板步骤中，要使用合适的酶标仪进行测量，并根据实验要求选择适当的波长。读板结束后，要及时记录和分析实验结果，并根据需要进行数据处理和统计分析。
ELISA的操作要点
ELISA的操作要点 ELISA（酶联免疫吸附试验）是一种常用的生物化学分析技术，用于 检测体液中特定抗原或抗体的存在。它通过将待测物与特异性的抗体反应，并利用酶广谱性的底物得到可观测的信号，从而确定待测物的存在。下面 是ELISA的一些操作要点： 1.准备实验材料：包括试剂、样本（血清、尿液、细胞上清等）、标 准物质、试剂盒、酶标仪、洗涤缓冲液、底物、显色缓冲液等。 2.样品的准备：将样品（血清、尿液等）加入离心管中，并进行离心，以去除杂质。根据需要，可以对样品进行稀释。 3.酶标板的处理：将酶标板中的每个孔分配给不同的标准物质、样品 或控制物。每个样品至少要有两个孔，以进行重复测量。 4.添加特异的抗原或抗体：将待测物或标准物质加入酶标板中的相应 孔中，并注意保持温度和时间的一致性。等温反应一般在37℃下进行， 持续一定的时间。 5.洗涤步骤：在每一步反应之后，使用洗涤缓冲液洗涤酶标板，以去 除未结合的物质。洗涤的时间、温度和液量应根据试剂盒提供的指引进行。 6.添加检测抗体或底物：根据实验需求，在完成洗涤步骤后，可以添 加特异的检测抗体或底物。检测抗体可以与待测物结合，并形成特定的复 合物。底物与酶结合后，可产生可观察的信号。 7.反应终止：通过添加反应终止剂（如酸）停止酶底物的反应。终止 剂的具体种类和添加量应根据试剂盒提供的指引进行。
8.读取结果：将反应终止后的酶标板放入酶标仪中，测量每个孔的吸光度或荧光强度。根据标准曲线，可以计算出待测物的浓度。 上述是一般ELISA实验的一般操作要点，实验过程中还需要根据具体的实验目的和试剂盒的要求进行相应的调整。在实验过程中应注意操作规范，并严格遵循实验室安全操作指南。同时，实验结果的准确性也取决于实验设备的仪器校准和试剂的稳定性，因此在进行ELISA实验前，应检查实验设备和试剂的有效期，并进行必要的校准和标定。
ELISA实验要点洗涤是关键
ELISA实验要点洗涤是关键 ELISA是一种基于特异性抗原-抗体反应的免疫测定方法，通常用于检测特定物质的存在和浓度。在进行ELISA实验时，洗涤是至关重要的步骤之一、本文将详细介绍ELISA实验中洗涤的要点，以确保实验结果的准确性和可靠性。 1. 使用合适的洗涤缓冲液：洗涤缓冲液在ELISA实验中起到去除非特异性结合和杂质的作用。常用的洗涤缓冲液包括PBS（含Tween 20）、TBST（含Tween 20）、PBST（含Tween 20）、Tris缓冲液等。选择合适的缓冲液要考虑免疫试剂的稳定性、抗体的特异性以及杂质的去除效果。 2.洗涤次数和时间：洗涤的次数和时间是影响洗涤效果的重要因素。通常情况下，建议进行3-5次洗涤，每次洗涤时间约为5-10分钟。过短的洗涤时间可能无法完全去除非特异性结合和杂质，而过长的洗涤时间则可能导致特异性结合的抗原-抗体反应受到影响。 3.洗涤液的温度：洗涤液的温度也是影响洗涤效果的因素之一、通常情况下，洗涤液的温度应接近室温，避免过热或过冷的情况发生。过热的洗涤液可能会导致抗原和抗体的失活，而过冷的洗涤液则可能影响特异性结合的发生。 4.洗涤的力度和频率：洗涤的力度和频率也会对洗涤效果产生影响。通常情况下，洗涤时的振荡力度要适中，避免产生气泡或引起试管内的液体溢出。此外，洗涤的频率要根据实验的具体要求来确定，可以根据试剂商提供的推荐条件进行操作。 5.避免交叉污染：为避免交叉污染，洗涤缓冲液和洗涤液的使用要严格分开。每次洗涤后，必须充分清洗洗涤缓冲液，并确保不留下任何残留
物。此外，使用专用的洗涤缓冲液瓶和洗涤液瓶，避免与其他实验室用品混淆。 6.避免干燥和过度吸液：在洗涤过程中，避免试管完全干燥，尽量在试管内液体完全排出后立即进行下一步操作。此外，在吸液过程中要注意避免过度吸液，以免将特异性结合的物质带走。 7.避免接触污染源：在进行洗涤操作时，要尽量避免接触可能引起交叉污染的物品，如手指、纸巾、实验台等。同时，在洗涤之前要确保试剂的质量和纯度，避免使用过期或受到污染的试剂。 综上所述，洗涤在ELISA实验中起着至关重要的作用。通过选择合适的洗涤缓冲液、控制洗涤次数和时间、调节洗涤液的温度和力度，以及避免交叉污染和接触污染源，可以保证ELISA实验结果的准确性和可靠性。
ELISA原理及操作注意事项
ELISA原理及操作注意事项 ELISA（酶联免疫吸附试验）是一种常用于检测抗体或抗原的实验技术。其原理是将待测物（抗体或抗原）通过特定的酶标记结合物与固定在 试板上的配体结合，然后用底物与酶催化出彩色或荧光产物，从而通过测 量产物的光学密度或荧光信号来定量检测待测物的含量。 1.实验仪器消毒：实验前应将使用的仪器、试剂瓶和器皿进行消毒， 以避免实验中的污染。 2.条件优化：不同的ELISA实验条件可能有所不同，包括涂被物、孵 育温度和时间、洗涤时间等，必须根据实验需要进行条件的优化。 3.阻断剂：在ELISA实验中，通常需要加入阻断剂（例如牛血清蛋白、鱼胶等）来减少非特异性的结合。不同的样品可能需要不同的阻断剂浓度 进行优化。 4.样品处理：对于待测物的检测，样品的处理包括稀释、加入试剂、 混合等步骤。处理时要注意对待测物的保存温度、避免阳性和阴性样品污染，以及避免样品的重复冻融过程，这可能会降低样品的稳定性。 5.孵育和洗涤步骤：酶标记物与涂被物结合的步骤通常需要进行一定 的孵育时间和温度。此外，洗涤步骤是为了去除不结合的物质，洗涤次数 和洗涤液的成分必须根据实验需要进行优化。 6.制备酶标荧光物：在选择酶标物时，需要确保酶的活性和稳定性， 并对荧光标记物的浓度和稀释倍数进行优化。 7.底物反应：根据所选择的酶，确定底物反应的最佳时间和温度。避 免底物超过反应时间，以防止过度反应导致结果不准确。
8.光学密度或荧光信号测定：ELISA的结果通常通过测量产物的光学密度（OD）或荧光信号来定量。在测定前，必须确保光学和荧光仪器的正常工作，并根据实验条件和要求进行仪器校准。 9.数据分析：根据实验设计和实验目的，将ELISA的结果进行统计学分析，包括计算均值、标准差、相关系数等。 总结来说，ELISA是一种常用的实验技术，其原理基于酶催化反应。在操作ELISA时需要注意实验仪器的消毒、条件的优化、样品的处理、酶标反应的制备和测定、以及数据的分析等方面。操作时最好遵循实验标准操作程序，同时根据实验需要对条件进行优化，以确保实验的准确性和可靠性。
ELISA试验技术要点
ELISA试验技术要点 ELISA（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay）是一种常用的生物分 析实验技术，广泛应用于生命科学和医学领域。ELISA能够高效、快速、 准确地检测和定量目标分子，如蛋白质、抗原、抗体、荷尔蒙等，具有灵 敏度高、特异性强、重复性好等优点，因此被广泛应用于临床诊断、药物 研发、疾病相关研究等领域。以下是ELISA试验技术的要点： 1.预实验准备： -购买适当的试剂和试验器材，如酶标板、酶标板孔板、洗板缓冲液、稀释缓冲液、辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗等。 -设计实验流程和实验方案，包括阳性对照、阴性对照和样本组织的 选择，以及相关的实验条件（温度、时间等）。 -准备相关的文献和参考资料。 2.样品制备： -收集样本（血清、尿液、细胞培养上清等）并储存在适当的条件下，如低温冷冻、避光等。 -样品的处理和预处理，如离心、过滤、洗涤、稀释等，以提高实验 灵敏度和准确性。 3.酶标板的涂布： -将目标蛋白、抗原或抗体等溶解在适当的缓冲液中。 -在酶标板中加入适量的溶液，如PBS（磷酸缓冲盐溶液）等。
-将溶液加入酶标板孔板中，并在适当的温度下孵育一段时间，使得目标分子均匀地附着在酶标板表面。 4.酶标记二抗的加入： -准备HRP标记的二抗，如HRP标记的兔抗小鼠IgG。 -加入一定体积的HRP标记的二抗到酶标板孔板中。 -在适当的温度下孵育一段时间，使得HRP标记的二抗与酶标板表面的目标分子结合。 5.洗板步骤： -加入洗板缓冲液，将其覆盖在酶标板孔板中。 -轻轻地洗涤酶标板孔板，以去除未结合的物质。 -重复洗涤步骤，通常为3-5次，以确保洗涤干净。 6.底物的加入： -准备底物，如TMB（3,3',5,5'-四甲基联苯胺）。 -加入一定体积的底物到每个酶标板孔板中。 -在适当的时间内，观察底物的颜色变化情况，颜色的深浅与目标分子的浓度成正比。 7.反应终止： -根据实验方案中的规定时间，加入适当的反应终止剂，如硫酸或盐酸。 -终止剂的加入能够停止底物的反应，防止颜色继续发展。
ELISA检测方法操作要点
ELISA检测方法操作要点 ELISA（酶联免疫吸附试验）是一种常用的免疫化学检测方法，用于 检测体液或体内细胞中的特定抗原或抗体。ELISA技术的成熟和广泛应用 使得它成为临床、生物学和分子生物学研究中常用的检测方法之一、以下 是ELISA检测方法操作要点的详细说明： 1.样品准备： -合理选择样品：根据实验目的，选择合适的样本类型，如血清、血浆、尿液、细胞提取物等。 -样品储存：样品应储存在适当的温度下，并避免反复冻融，以防止 抗原或抗体的降解。 2.酶标板涂层： -选择合适的酶标板：常用的有96孔和384孔酶标板，根据实验需要 进行选择。 -涂层溶液制备：根据实验方案中的要求，配制相应浓度的涂层溶液，如抗体或抗原。 -涂层操作：将涂层溶液加入酶标板孔中，静置一段时间，使其充分 吸附在孔壁上，再进行废液排空和孔洗涤。 3.酶标抗体制备： -选择合适的酶标抗体：根据实验目的和需要，选择适当的酶标抗体。 -酶标抗体质量控制：酶标抗体应经过质量控制，并充分稀释到合适 的浓度。
4.样品孔加样： -样品孔设置：根据实验设计，将需要检测的样品和相应质控品按照实验要求加到酶标板中。 -操作要点：如实验要求，控制加样量、加样顺序和均匀性，避免交叉污染。 5.洗涤步骤： -洗涤缓冲液：选择适当的洗涤缓冲液，用于洗涤酶标板孔，去除非特异性结合物质。 -洗涤方法：进行洗涤时，操作要轻柔而均匀，避免产生气泡。 6.标记抗体操作： -选择合适的标记抗体：标记抗体一般选择与目标抗原或抗体不同的免疫球蛋白。 -标记抗体质量控制：标记抗体应经过质量控制，并充分稀释到合适的浓度。 7.显色反应： -底物选择：根据实验方案，选择合适的底物，以产生特定的颜色反应。 -反应时间：根据实验方案，控制好反应时间，过长过短都可能对结果造成影响。 8.反应终止：
ELISA实验要点：洗涤是关键
ELISA实验要点：洗涤是关键 优化ELISA的重点之一在于洗涤。洗涤步骤可降低未结合抗体所引起的背景信号，从而增加分析的信噪比。每一步之间的洗涤确保只有特异的结合事件被保留，在最后一步产生信号。而不充分的洗涤会导致差异和高背景，从而带来不理想的结果。本文将为你介绍一些利用自动洗板机来洗涤ELISA平板的技巧。 免疫分析，比如ELISA，一般包含两个或以上的孵育步骤，中间以洗涤隔开。ELISA通常在96孔板中开展，其上包被了结合抗原或抗体。在封闭步骤后，包被后的平板首先与一抗或抗原孵育。随后通过一些洗涤步骤去除未结合（低亲和力）的抗原-抗体复合物。接着，平板与二抗孵育。这种带有酶的抗体与高亲和力的抗原-抗体复合物结合。之后，又是一轮洗涤。最后是添加底物并检测信号。 我们可使用多种底物来检测最终的抗原-抗体复合物。底物分为三类：自然发光、化学发光和荧光。准确说来，ELISA这个词指的是使用自然发光底物的分析。而使用化学发光底物的分析被称为Luminescent Immunoassay（LIA），使用荧光二抗的分析被称为Fluorescent Immunoassay（FIA）。 洗涤参数 一些参数会影响洗涤步骤的效果。第一个主要的参数是洗涤量。自动洗板机会分配洗涤液。如果你之前遭遇过高背景，那么不要犹豫，将洗涤量调为高，最好是比包被体积更高。太少的洗涤液会让一部分分析表面洗涤不到，从而明显增加背景。所有反应孔的洗涤量必须相同。ELISA板的制造商通常会在试剂盒的使用手册中列出包被量。行业中通常使用的包被量是200μl。如果你的试剂盒也是这样，那么制造商可能会建议使用300μl洗涤液进行洗涤，以便清洁整个反应孔的壁。一般来说，洗涤量越高，则孵育步骤残留的抗体或抗原量就越少。 洗涤次数的经验法则 第二个影响洗涤效果的主要参数是洗涤循环的量。当然，洗涤次数越多，背景越低。然而，太多次的洗涤会降低信号强度，使其难以测定。通常的做法是在每次抗体或抗原孵育后重复洗涤三次。不过，ELISA板的制造商会对洗涤次数提出建议。一般而言，制造商包被平板需要的洗涤次数比用户包被的平板要少。对于用户包被的ELISA板，必须优化洗涤次数。 控制洗涤量和洗涤次数的另一种方法是加入过量的洗涤液。一般来说，96孔板的每个孔能容纳330至460μl。不过，有些自动化洗板机可设置程序，分配远远超出这个量的洗涤液，比如1ml。它是如何做到的呢？其实很简单，就是在分液
ELISA试验技术要点
酶联免疫吸附试验 （Enzyme-Linked Immunoabsorbent Assay,ELISA） 一、基本原理： 利用标记技术将酶标记到抗体（抗原）上，使待检物中相应的抗原（抗体）与酶标记抗体（抗原）发生特异性反应。在遇到相应的酶底物时，酶能高效、专一催化、分解底物，生成有颜色的产物。根据颜色的深、浅，可以判断待检物中有无特异的抗原（抗体）以及量的大小。该方法可对待测样品进行定性和定量分析，同时具有微量、特异、高效、经济、简便等优点，因此是一种广泛应用于生物和医学领域的微量测定技术。 目前使用的酶联免疫检测方法很多，应用较多的有： 间接法——用于测定抗体 双抗体夹心法——主要用于测定大分子抗原 竞争抑制法——主要用于测定小分子抗原 二、试验材料及试剂 酶标板（聚苯乙烯微量96孔板） 包被液（0.05M pH9.6 碳酸盐冲液） 无水Na2CO3 1.59g NaHCO3 2.93g 蒸馏水定容至1000ml 洗涤液（0.1M pH7.4 磷酸盐缓冲液） NaCl 8.0g KCL 0.2g KH2PO40.2g Na2HPO4•12H2O 2.9g 吐温-20 0.5ml 蒸馏水加至1000 ml 封闭液 明胶1g 包被液100ml 抗体稀释液 明胶0.1g 洗涤液100ml
底物缓冲液（pH5.0 柠檬酸-磷酸缓冲液） 0.1M柠檬酸(19.2g/L) 24.3ml 0.2M Na2HPO4 (28.4g/L) 25.7ml 蒸馏水50ml TMB底物使用液 TMB储存液（100mg溶于10mlDMSO,40C保存）0.1ml 底物缓冲液10ml 30%H2O2 10ul 现用现配 终止液（2M H2SO4） H2SO4（96%）22.2ml 蒸馏水177.8ml 三、基本操作 1、间接ELISA 操作步骤如下： 包被酶标板：加适度稀释的抗原，0.1ml/孔，4℃孵育过夜； 洗涤：倾去孔内的液体，在吸水纸上拍干，加入洗涤液，0.3ml/孔，洗涤三次，3min/次； 封闭：加入1％明胶，0.2ml/孔； 37℃孵育1h，洗涤同上
ELISA检测方式操作要点
ELISA检测方式操作要点 1 标本的采取和保留 可用作ELISA测定的标本十分普遍，体液（如血清）、分泌物（唾液）和排泄物（如尿液、粪便）等都可作标本以测定其中某种抗体或抗原成份。有些标本可直接进行测定（如血清、尿液），有些那么需经预处置（如粪便和某些分泌物）。大部份ELISA检测均以血清为标本。血浆中除尚含有纤维蛋白原和抗凝剂外，其他成份均一样于血清。制备血浆标本需借助于抗凝剂，而血清标本只要待血清自然凝固、血块收缩后即可取得。除特殊情形外，在医学查验中均以血清作为检测标本。在ELISA中血浆和血清可一样应用。血清标本可按常规方式搜集，应注意幸免溶血，红细胞溶解时会释放出具有过氧化物酶活性的物质，以HRP为标记的ELISA测定中，溶血标本可能会增加非特异性显色。 血清标本宜在新鲜时检测。如有细菌污染，菌体中可能含有内源性HRP，也会产生假阳性反映。如在冰箱中保留太久，其中的可发生聚合，在间接法ELISA中可使本底加深。一样说来，在5天内测定的血清标本可放置于4℃，超过一周测定的需低温冰存。冻结血清融解后，蛋白质局部浓缩，散布不均，应充分混匀宜轻缓，幸免气泡，可上下倒置混和，不要在混匀器上强烈振荡。混浊或有沉淀的血清标本应先离心或过滤，澄清后再检测。反复冻融会使抗体效价跌落，因此测抗体的血清标本如需保留作多次检测，宜少量分装冰存。保留血清自搜集时就应注意无菌操作，也可加入适当防腐剂。 2 试剂的预备 按试剂盒说明书的要求预备实验中需用的试剂。ELISA顶用的蒸馏水或去离子水，包括用于洗涤的，应为新鲜的和高质量的。自配的缓冲液应用pH计测量较正。从冰箱中掏出的实验用试剂应待温度与室温平稳后利用。试剂盒中本次实验不需用的部份应及时放回冰箱保留。 3 加样 在ELISA中一样有3次加样步聚，即加标本，加酶结合物，加底物。加样时应将所加物加在LEI SA板孔的底部，幸免加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产动气泡。
ELISA的技术要点
ELISA的技术要点 ELISA的技术要点包括三个方面：试剂的制备、反应条件的选择和操作的标准化。 一、试剂的制备 ELISA的主要试剂为固相的抗原或抗体、酶标记的抗原或抗体和与标记酶直接关联的酶反应底物。以下叙述这些试剂的原料和制备方法。 （一）固相载体 可作ELISA中载体的物质很多，最常用的是聚苯乙烯。聚苯乙烯具有较强的吸附蛋白质的性能，抗体或蛋白质抗原吸附其上后保留原来的免疫活性。聚苯乙烯为塑料，可制成各种形式。在ELISA测定过程中，它作为载体和容器，不参与化学反应。加之它的价格低廉，所以被普遍采用。 ELISA载体的形状主要有三种：小试管、小珠和微量反应板。小试管的特点是还能兼作反应的容器，最后放入分光光度计中比色。小珠一般为直径0.6cm的圆球，表面经磨砂处理后吸附面积大增加。如用特殊的洗涤器，在洗涤过程中使圆珠滚动淋洗，效果更好。最常用的载体为微量反应板，专用于ELISA测定的产品也称为ELISA板，国际通用的标准板形是8×12的96孔式。为便于作少量标本的检测，有制成8联或12联孔条的，放入座架后，大小与标准ELISA板相同。ELISA板的特点是可以同时进行大量标本的检测，并可在特定的比色计上迅速读出结果。现在已有多种自动化仪器用于微量反应板型的ELISA检测，包括加样、洗涤、保温、比色等步骤，对操作的标准化极为有利。
良好的ELISA板应该是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之间和同一板各孔之间性能相近。聚苯乙烯ELISA板由于配料的不同和制作工艺的差别，各种产品的质量差异很大。因此每一批号的聚苯乙烯制品在使用前须检查其性能。常用的检查方法为：以一定浓度的人IgG（一般为10ng/ ml）包被ELISA板各孔后，每孔内加入适当稀释的酶标抗人IgG抗人IgG抗体，保温后洗涤，加底物显色，终止酶反应后分别测每孔溶液的吸光度。控制反应条件，使各读数在0.8左右。计算所有读数的平均值。所有单个读数与平均读数之差应小于10％。 与聚苯乙烯类似的塑料为聚氯乙烯。作为ELISA固相载体，聚氯乙烯板的特点为质软板薄，可切割，价廉、但光洁度不如聚苯乙烯板。聚氯乙烯对蛋白质的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值有时也略高。 为比较不同固相在某一ELISA测定中的优劣，可用以下方法加以检验：用其它免疫学测定方法选出一个典型的阳性标本和一个典型的阴性标本。将它们分别进行一系列稀释后，在不同的固相载体上按预定的ELISA操作步骤进行测定，然后比较测定结果。在哪一种载体上阳性结果与阴性结果判别最大，这种载体就是这一ELISA测定的最合适的固相载体。 除塑料制品外，固相酶免疫测定的载体还有两种材料：一是微孔滤膜，如硝酸纤维素膜、尼龙膜等，这类测定形式将在本章第五节“膜载体的酶免疫测定”中介绍。另一种载体是以含铁的磁性微粒制作的，反应时固相微粒悬浮在溶液中，具有液相反应的速率，反应结束后用磁铁吸引作为分离的手段，洗涤也十分方便，但需配备特殊的仪器。 （二）抗原和抗体
ELISA标准操作及技术服务的常见问题分析
ELISA标准操作及技术服务的常见问题分析 ELISA标准操作及技术服务的常见问题分析 一.ELISA 标准操作要点 优质的试剂，良好的仪器和正确的操作是保证ELISA 检测结果准确可靠的必要条件。ELISA 中用的蒸馏水或去离子水，包括用于洗涤的，应为新鲜的和高质量的本公司要求使用的纯化水电导率小于1.5μs/cm。 1. 标本的采取和保存 大部分ELISA 检测均以血清为标本。血清标本可按常规方法采集，应注意避免溶血，红细胞溶解时会释放出具有过氧化物酶活性的物质，以HRP 为标记的E LISA 测定中，溶血标本可能会增加非特异性显色。血清标本宜在新鲜时检测。如有细菌污染，菌体中可能含有内源性HRP，也会产生假阳性反应。一般说来，在5 天内测定的血清标本可放置于4℃，标本在冰箱中保存时间过长导致血清I gG 聚合，使间接法的试剂本底加深。超过一周测定的需－20℃保存。冻结血清融解后，蛋白质局部浓缩，分布不均，应充分混匀并避免产生气泡。混浊或有沉淀的血清标本应先离心或过滤，澄清后再检测。反复冻融会使抗体效价跌落，所以测抗体的血清标本如需保存作多次检测，宜少量分装冰存。保存血清自采集时就应注意无菌操作，也可加入适当防腐剂。 抗凝不完全的标本因纤维蛋白原的干扰而造成假阳性，建议尽量不用抗凝血尤其是肝素抗凝剂。 2.加样 加样时应将所加物加在ELISA 板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出。 3.保温 在建立ELISA 方法作反应动力学研究时，实验表明，两次抗原抗体反应一般在37℃经 1-2 小时，产物的生成可达顶峰。为避免蒸发，板上应加盖，也可用塑料贴封纸或保鲜膜覆盖板孔，反应板不宜叠放，以保证各板的