PAGE电泳原理与步骤

PAGE 电泳的操作步骤及试剂配方

聚丙烯酰胺凝胶电泳作为检测DNA 序列差异的有效手段，变性凝胶电泳在我室广泛使用，但是也有其使用范围。在我室还有一种常用的非变性凝胶电泳技术，简称SSCP （Single Strand Conformation Polymorphism ，单链构象多态性）。

原理：在SSCP 测定中，双链DNA （dsDNA ）被变性成为单链DNA （ssDNA ），每一条单链DNA 都基于它们的内部序列而呈现出一种独有的折叠构象，即使同样长度的DNA 单链因其碱基顺序不同、甚至单个碱基的不同会形成不同的构象。这些单链DNA 在非变性条件下，用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，单链DNA 的迁移率和带型，都取决于其折叠构象和电泳时的温度。

SSCP 与变性凝胶电泳基本一致，不同之处有以下几点：a ．SSCP 使用非变性凝胶进行电泳，即在凝胶配制中不加入变性剂。我室常用8%非变性胶（丙烯酰胺80g ，N-N ，-亚甲双丙烯酰胺 2.76g ，10×TBE 50ml ，加水定容到1L ）b ．工作环境，由于SSCP 受温度影响，所以在电泳过程中应防止温度的升高，所以电泳环境为电压400V ，电流50mA ，单板电泳功率为9W ，不用预热。缓冲液最好用新配制的。c ．由于电泳功率较低，所以电泳时间较长，通常需要10小时以上，因此一般电泳需要过夜。室温在25。C 以下。

1.聚丙烯酰胺凝胶电泳

聚丙烯酰胺凝胶电泳适宜分离鉴定低分子量的蛋白质，小于1kb 的DNA 片段和DNA 序列。分析装载的样品容量大，可回收，DNA 纯度高。在催化剂TEMED （N-N-N ，-N ，-四甲基乙二胺）和过硫酸胺的作用下，丙烯酰胺聚合成长链，聚丙烯酰胺链在交联剂，N-N ，-亚甲双丙烯酰胺的参与下，聚丙烯酰胺链与链之间交叉联结形成凝胶。

1.1配制30%丙烯酰胺：丙烯酰胺29g 、N-N ，-亚甲双丙烯酰胺1g 、加水至100ML ，40C 棕色瓶可保存1.2配制5×TBE 缓冲液：TRIS 碱54克、硼酸27.5克、EDTA 3.72克、加水至1L 1.3制备聚丙烯酰胺凝胶所用试剂体积

1.4DNA 在聚丙烯酰胺凝胶中有效分离范围

丙烯酰胺（%）

有效分离范围（bp ）

二甲苯氰FF

溴酚蓝3.51000-20004601005.080-500260658.060-4001604512.040-200702015.025-150601520.0

6-100

45

12

2.聚丙烯酰胺凝胶电泳具体步骤

2.1从NaOH 池中捞出浸泡的玻璃板，取出上面的残胶2.2把玻璃板拿到流动水处洗刷干净2.3洗干净的玻璃板至于玻璃板架上晾干2.4用乙醇擦洗玻璃板

试剂制备不同浓度（%）凝胶所用试剂体积（ml ）

3.5 5.08.012.020.030%丙烯酰胺

11.616.626.640.066.6水67.762.752.739.312.75×TBE 20.020.020.020.020.010%过硫酸铵

0.7

0.7

0.7

0.7

0.7

2.5带凹口的背板涂上硅化剂，面板则涂上粘合剂，防止电泳完毕发生撕胶和脱胶的可能（涂摸要均匀）2.6面板在下，背板在上。两侧用塑料板密封，并用夹子夹好。底部调节使之水平

2.7将加催化剂后的凝胶沿凹口均匀倒下，插入适当的封条。勿使封条下留下气泡。用夹子夹紧封条部位2.8室温聚合30分钟，小心取出凹口处封条，用水冲洗加样孔（否则封条所残留的丙烯酰胺在加样孔聚合产生不规则表面，引起DNA带变形）

2.9将凝胶固定在电泳槽里。带凹口背板朝里，面向缓冲液槽

2.10用0.5×TBE灌满电泳槽的缓冲液槽，接上电极，打开电源。调试工作环境为电压2000-2200V，电流150-200mA，单板电泳功率为80W。预热30分钟左右。

2.11点样之前需切断电源，用枪将点样孔的气泡及胶吹出，然后插入点样梳，注意不要插得太深，否则点样胶面会变形，影响美观及点样。

2.12枪吸加样品，PCR产物先加loading buffer10ul,再变性5分钟左右，接着在冰水中冷却5分钟以上方可点样，点样完毕，电泳开始。

2.13电泳至所需位置后，切断电源，拔出导线，回收缓冲液，卸下玻璃板。在工作台上，将背板撬起，放回原处。将面板进行银染

3.电泳后的银染检测

3.1原理：

影像产生是由于核酸在胶上所占部位与周围的氧化——还原势不同而产生。银染液中的银离子（Ag+）可与核酸形成稳定的复合物，然后用还原剂如甲醛使Ag+还原成银颗粒，这样核酸电泳带就染成了黑褐色。

3.2银染

银染液的配制：称2.5至3.0g AgNO3加1200---1400ml水

银染:将电泳完的面板首先在银染漂洗盆了漂洗赶紧，使胶面上没有异物。玻璃板反面没有污染物。

将加入银染液的银染盆放在摇床上后，将面板放入银染1小时左右。

3.3显影

显影液的配制：NaOH---20g,Na2CO3----0.6g,甲醛4.5ml，加水1200ml

显影：将面板从银染盆里取出，在银染漂洗盆里漂洗，震荡5-6次，取出后使其表面尽量无水，再放入已加入显影液的显影盆里（显影，显影液的配制及甲醛的加入都需要在通风橱的摇床上进行）显影过程大约10到15分钟，以DNA条带清晰可见为准。

将显现完毕的板子在显影漂洗盆里漂洗后，方可读带。

本实验室凝胶电泳相关常用试剂配方：

1.我实验室常用的聚丙烯酰胺凝胶是6%变性聚丙烯酰胺凝胶（简称变性胶，PAGE），就是在普通聚丙烯酰胺凝胶中加入变性剂。我们使用的变性剂是尿素。6%PAGE具体配制方法为:尿素210g，10×TBE25ml，丙烯酰胺28.5g，亚甲双丙烯酰胺 1.5g，加水定容至500ml，过滤后使用。考虑到方便使用的问题，一般一次配制2L（尿素840g，10×TBE100ml，丙烯酰胺114g，亚甲双丙烯酰胺6g）。

2.10×TBE（Tris-硼酸-EDTA）的配制：EDTA7.44g，硼酸55g，Tris108g，加水定容至1000ml

3.10%过硫酸氨（AP）：10g过硫酸氨，纯水定容至100ml

4.硅化剂配方：二甲基二氯硅烷：无水乙醇=13ml：500ml

5.反硅化剂（粘合剂）配制：无水乙醇500ml（一瓶），44ddH2O，3.3冰醋酸，550ul Bind silnce（3，

-Trimethoxysilyl propyl），配置完遮光4。C保存

6.loading buffer配制:0.1g二甲苯氰，0.1g溴酚蓝，1ml0.5molEDTA，100mL甲酰胺