双酶切连接反应
双酶切实验
双酶切概述双酶切反应(Double Digests)1、同步双酶切同步双酶切是一种省时省力的常用方法。
选择能让两种酶同时作用的最佳缓冲液是非常重要的一步。
NEB每一种酶都随酶提供相应的最佳NEBuffer，以保证100%的酶活性。
NEBuffer的组成及内切酶在不同缓冲液中的活性见《内切酶在不同缓冲液里的活性表》及每支酶的说明书。
能在最大程度上保证两种酶活性的缓冲液即可用于双酶切。
由于内切酶在非最佳缓冲液条件下的切割速率会减缓，因此使用时可根据每种酶在非最优缓冲液中的具体活性相应调整酶量和反应时间。
2、分步酶切如果找不到一种可以同时适合两种酶的缓冲液，就只能采用分步酶切。
分步酶切应从反应要求盐浓度低的酶开始，酶切完毕后再调整盐浓度直至满足第二种酶的要求，然后加入第二种酶完成双酶切反应。
3、使用配有特殊缓冲液的酶进行双酶切（图）使用配有特殊缓冲液的酶进行双酶切也不复杂。
在大多数情况下，采用标准缓冲液的酶也能在这些特殊缓冲液中进行酶切。
这保证了对缓冲液有特殊要求的酶也能良好工作。
由于内切酶在非最佳缓冲液中进行酶切反应时，反应速度会减缓，因此需要增加酶量或延长反应时间。
通过《内切酶在不同缓冲液里的活性表》可查看第二种酶在特殊缓冲液相应盐浓度下的作用活性。
双酶切建议缓冲液注：只要其中一种酶需要添加BSA，则应在双酶切反应体系中加入BSA。
BSA不会影响任何内切酶的活性。
注意将甘油的终浓度控制在10%以下，以避免出现星号活性，详见《星号活性》。
可通过增加反应体系的总体积的方法实现这一要求。
某些内切酶的组合不能采用同步双酶切法，只能采用分步法进行双酶切。
上表中这些组合以“se q”标注。
[编辑本段]双酶切的注意事项1、做转化的时候，进行酶连接反应时，注意保持低温状态，因为LIGASE酶很容易降解.为保险起见，一般连接3小时，16度。
2、对含有AMP-RESISTENCE的质粒铺板时，注意加AMP时的温度，温度过高，会使克隆株无法筛选出来.我的方法是培基高温消毒后放在烤箱里，烤箱一般温度为55-60度，然后做的时候拿出来，这样好掌握温度。
双酶切及连接
限制性内切酶的类型
根据限制酶的识别切割特性， 催化条件及是 否具有修饰酶活性可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三大 类。
限制性内切酶的类型
第一类（I型）限制性内切酶：能识别专一 的核苷酸顺序，它们在识别位点很远的地 方任意切割DNA链，但是切割的核苷酸顺 序没有专一性，是随机的。这类限制性内 切酶在DNA重组技术或基因工程中用处不 大，无法用于分析DNA结构或克隆基因。 这类酶如EcoB、EcoK等。
dna完全没有被内切酶切割原因对策内切酶活性下降内切酶稀释不正确dna不纯反应条件不佳内切酶识别的dna位点上的碱基被甲基化或存在其它修饰部分dna溶液粘在管壁上内切酶溶液粘度大取样不准酶切后dna粘末端退火由于反应溶液温度强烈振荡使内切酶变性过度稀释使酶活性降低反应条件不适识别位点两侧插入了可影响酶切效率的核酸顺序用510倍量过量消化用酶贮藏液或反应缓冲液稀释酶同上同上反应前离心数秒将内切酶稀释增大取样体积电泳前将样品置65保温510分钟取出后置冰浴骤冷使用标准反应缓冲液及温度避免强烈振荡适当稀释酶液反应液稀释的酶不能贮藏使用最佳反应体系加大酶量510倍问题二
限制性内切酶的类型
第二类（III型）限制性内切酶：也有专一的
识别顺序，在识别顺序旁边几个核苷酸对的固 定位置上切割双链。但这几个核苷酸对也不是 特异性的。因此，这种限制性内切酶切割后产 生的一定长度DNA片段，具有各种单链末端。 因此也不能应用于基因克隆。
限制性内切酶的类型
第三类（Ⅱ型）限制性内切酶：就是通常指的ＤＮＡ限制性 内切酶. 它们能识别双链ＤＮＡ的特异顺序，并在这个顺序内进行 切割，产生特异的ＤＮＡ片段； Ⅱ型酶分子量较小，仅需Mg2+作为催化反应的辅助因子，识 别顺序一般为４～６个碱基对的反转重复顺序； Ⅱ型内切酶切割双链ＤＮＡ产生３种不同的切口－－５’端 突出；３’端突出和平末端。 正是得益于限制性的内切酶的发现和应用， 才使得人们能 在体外有目的地对遗传物质ＤＮＡ进行改造，从而极大地推 动了分子生物学的兴旺和发展。
双酶切连接反应之全攻略(
双酶切连接反应之全攻略(双酶切连接（Double Digestion）是一种常用的分子生物学技术，用于在DNA分子上选择性地切割两个特定的限制性内切酶位点。
它可以用于构建重组DNA，进行基因克隆，等等。
下面是一个全面的双酶切连接反应的攻略，包括实验前的准备工作，实验步骤和注意事项。
实验前的准备工作：1.获得限制性内切酶：选择两个互不相容的限制性内切酶。
确保这两个酶能够在相同的反应缓冲液中活性工作。
2.准备DNA底物：获得需要连接的DNA片段。
可以通过PCR扩增，限制性消化或DNA合成等方法获得。
3.选择连接载体：选择合适的连接载体，如质粒。
确保载体具有想要插入的目标基因的适当特性，如选择性标记物（如抗生素抗性基因）和启动子等。
4.验证限制酶位点：使用限制性内切酶图谱检测DNA片段和连接载体中的限制酶位点。
这有助于确定两个限制酶是否能够溶解目标DNA片段。
实验步骤：1.提取DNA：从细菌培养基中提取所需的DNA片段。
可以使用商用试剂盒或自制提取方法。
2.酶切反应：在适当的反应条件下，将需要连接的DNA片段和连接载体分别与两个限制性内切酶一起孵育。
反应条件包括酶的浓度，缓冲液的类型和pH值，反应温度和孵育时间。
3.酶停止反应：通过加入酶停止缓冲液或加热短暂孵育，停止酶切反应。
这样可以避免过度消化和限制酶反应继续进行。
4.凝胶电泳：将切割后的DNA片段经过琼脂糖凝胶电泳分析。
这一步骤可以检测酶切效率和特异性。
将反应样品和相应的对照样品（未经酶切）加载到琼脂糖凝胶上，然后运行电泳以分离DNA片段。
5.库仑凝胶纯化：根据所选的DNA片段大小，可以选择不同浓度的琼脂糖凝胶切片进行纯化。
将所需大小的DNA片段切割下来并进行库仑凝胶分离。
6.连接反应：将纯化的DNA片段与连接载体进行连接反应。
可以使用商业化的连接试剂盒，其中包含待连接DNA和连接载体之间的连接酶，以及其他必要的试剂。
7.转化：将连接后的DNA样品转化到合适的宿主细胞中。
双酶切连接反应的注意要点
双酶切连接反应的注意要点1.选择适当的酶切位点：在进行双酶切连接反应之前，需要选择适当的酶切位点。
这些酶切位点应该满足以下几个要求：-位点不应该在目标DNA序列中出现，以避免酶切产生剪切产物；-两种酶切位点应该在目标DNA序列中相对靠近，以确保连接的有效性；-酶切位点的序列应该被两种酶同时识别和切割。
2.协议的优化：双酶切连接反应的协议需要进行优化，以确定最适合的条件。
一些重要的实验条件包括反应缓冲液的成分和浓度、酶的浓度和反应温度。
对于每个反应参数，应该进行范围的优化实验，以确定最佳的条件。
3.应用正确的酶切酶：双酶切连接反应需要同时使用两种酶来进行切割。
这些酶应该是互相兼容的，并且能够在相同的反应缓冲液中活性。
此外，酶的纯度和活性也应该得到保证，以确保酶切的效果。
4.反应的时间和温度：双酶切连接反应的时间和温度都需要进行优化。
反应时间应该足够长，以确保两种酶都能充分切割目标DNA序列，并且不会出现过度切割的情况。
反应温度也应该适中，通常在酶的推荐温度范围内选择。
5.质量控制：在完成双酶切连接反应之后，应该进行质量控制以确保反应的成功。
常用的方法包括琼脂糖凝胶电泳和DNA测序。
通过这些方法，可以检测连接产物的大小和纯度，并确认连接的正确性。
6.反应产物的处理：根据实验需要，对双酶切连接反应的产物进行处理。
这可能包括：-凝胶电泳分离：使用琼脂糖凝胶电泳分离不同大小的连接产物；-提取纯化：通过凝胶电泳或商业化学试剂盒，从琼脂糖凝胶中提取并纯化连接产物；-DNA测序：对连接产物进行测序，以确认连接的正确性。
总之，双酶切连接反应是一种常用的分子生物学技术，但在实验中需要注意一系列要点。
选择适当的酶切位点、优化实验条件、正确选择酶切酶、时间和温度的控制，以及进行质量控制和反应产物的处理，对于确保双酶切连接反应的成功至关重要。
这些注意要点的遵守可以确保实验结果的准确性和可靠性。
双酶切连接反应
【原创】双酶切连接反应之全攻略（原创）双酶切连接反应之全攻略前一阵子一直在做双酶切质粒重组，失败了很多次，不过很快改善了实验方法，用2周重组了14个质粒。
现就自己的体会，结合战友的宝贵经验，谈一下质粒重组的一些个人经验。
1、回收PCR产物：在进行PCR扩增时候，给引物两端设计好酶切位点，一般说来，限制酶的选择非常重要，尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶，如BamHI,HindIII,提前看好各公司的双切酶所用公用的BUFFER，以及各酶在公用BUFFER里的效率。
选好酶切位点后，在各个酶的两边加上保护碱基，其原则可参照：双酶切时间及其体系：需要强调的是很多人建议酶切过夜，其实完全没有必要，我一般酶切3个小时，其实1个小时已经足够。
应用大体系，如100微升。
纯化问题：纯化PCR产物割胶还是柱式，我推荐柱式，因为割胶手法不准，很容易割下大块的胶，影响纯化效率。
现在的柱式纯化号称可以祛除引物，既然如此，酶切掉的几个碱基肯定也会被纯化掉了。
所以，PCR产物和双酶切产物的纯化均可应用柱式纯化。
我用的是TAKARA的纯化柱试剂盒酶量的问题：以TAKARA的为例，其对1单位酶的定义如下：在50 μl 反应液中，30℃温度下反应1小时，将1 μg 的λDNA完全分解的酶量定义为1个活性单位(U)。
而该酶浓度约为15单位/微升，在除外酶降解的因素外，该酶可分解15μg的DNA，而一般从1-4ml菌液提出的DNA约为3μg，而PCR纯化后的产物（50体系）约为3μg，所以即便全部加进去，只要纯化的质量好，酶切完全切得动。
2、酶切、回收后的PCR产物与载体的连接摩尔比的计算，很多人凭经验也可以。
但对于初学者从头认真计算则非常有必要。
回收的载体片段：回收的PCR产物片段=1：10，一般取前者，后者取。
pmol为单位的DNA转换为为µg单位的DNA：（X pmoles×长度bp×650）/ 1,000,000 （注：长度bp×650是该双链DNA的分子量）所得数值即为µg,也可以直接用这个公式套.1pmol 1000bp DNA=μg,如载体是5380bp，则为××=µg。
双酶切
【原创】双酶切连接反应之全攻略（原创）双酶切连接反应之全攻略前一阵子一直在做双酶切质粒重组，失败了很多次，不过很快改善了实验方法，用2周重组了 14个质粒。
现就自己的体会，结合战友的宝贵经验，谈一下质粒重组的一些个人经验。
1、回收PCR产物：在进行PCR扩增时候，给引物两端设计好酶切位点，一般说来，限制酶的选择非常重要，尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶，如BamHI,HindIII,提前看好各公司的双切酶所用公用的BUFFER，以及各酶在公用BUFFER里的效率。
选好酶切位点后，在各个酶的两边加上保护碱基，其原则可参照：/upload/2006/08/13/31219184.pdf。
双酶切时间及其体系：需要强调的是很多人建议酶切过夜，其实完全没有必要，我一般酶切3个小时，其实1个小时已经足够。
应用大体系，如100微升。
纯化问题：纯化PCR产物割胶还是柱式，我推荐柱式，因为割胶手法不准，很容易割下大块的胶，影响纯化效率。
现在的柱式纯化号称可以祛除引物，既然如此，酶切掉的几个碱基肯定也会被纯化掉了。
所以，PCR产物和双酶切产物的纯化均可应用柱式纯化。
我用的是TAKARA的纯化柱试剂盒酶量的问题：以TAKARA的为例，其对1单位酶的定义如下：在50 μl 反应液中，30℃温度下反应1小时，将1 μg 的λDNA完全分解的酶量定义为1个活性单位(U)。
而该酶浓度约为15单位/微升，在除外酶降解的因素外，该酶可分解15μg的DNA，而一般从1-4ml菌液提出的 DNA约为3μg，而PCR纯化后的产物（50体系）约为3μg，所以即便全部加进去，只要纯化的质量好，酶切完全切得动。
2、酶切、回收后的PCR产物与载体的连接摩尔比的计算，很多人凭经验也可以。
但对于初学者从头认真计算则非常有必要。
回收的载体片段：回收的PCR产物片段=1：10 ，一般取前者0.03pmol，后者取0.3pmol。
pmol为单位的DNA转换为为µg单位的DNA：（X pmoles×长度bp×650）/ 1,000,000 （注：长度bp×650是该双链DNA的分子量）所得数值即为µg,也可以直接用这个公式套.1pmol 1000bp DNA=0.66μg,如载体是5380bp，则0.03pmol为0.03×5.38×0.66=0.106524µg。
双酶切编辑
2连接反应
3注意事项
1简介编辑双酶切反应(Double Digests)
1、同步双酶切
同步双酶切是一种省时省力的常用方法。选择能让两种酶同时作用的最佳缓冲液是非常重要的一步。NEB每一种酶都随酶提供相应的最佳NEBuffer，以保证100%的酶活性。NEBuffer的组成及内切酶在不同缓冲液中的活性见《内切酶在不同缓冲液里的活性表》及每支酶的说明书。能在最大程度上保证两种酶活性的缓冲液即可用于双酶切。由于内切酶在非最佳缓冲液条件下的切割速率会减缓，因此使用时可根据每种酶在非最优缓冲液中的具体活性相应调整酶量和反应时间。
双酶切建议缓冲液
注：
只要其中一种酶需要添加BSA，则应在双酶切反应体系中加入BSA。BSA不会影响任何内切酶的活性。
注意将甘油的终浓度控制在10%以下，以避免出现星号活性，详见《星号活性》。可通过增加反应体系的总体积的方法实现这一要求。
某些内切酶的组合不能采用同步双酶切法，只能采用分步法进行双酶切。上表中这些组合以“seq”标注。
3、转化：
a、一般转化仅需要加入2μl加入至100μl正常的TOP10感受态细胞中，冰浴放置30分钟。
b、再在水浴中42℃热激一般90～120秒钟后，再在冰中放置3分钟。
c、加入800μl无抗生素培养基，37℃全温振荡摇床培养40分钟。
取100μl涂布平板。一般转化质粒不建议离心涂布（除非感受态效价特别低），
双酶切编辑
做转化的时候，进行酶连接反应时，注意保持低温状态，因为LIGASE酶很容易降解。为保险起见，一般连接3小时，16度；对含有AMP-RESISTENCE的质粒铺板时，注意加AMP时的温度，温度过高，会使克隆株无法筛选出来。我的方法是培基高温消毒后放在烤箱里，烤箱一般温度为55-60度，然后做的时候拿出来，这样好掌握温度。铺板前后注意用吹风机吹干；对照的设立：为验证双酶切是否成功。
《双酶切及连接》课件
• 双酶切技术简介 • 双酶切的实验步骤 • 双酶切的应用 • 双酶切的注意事项 • 双酶切技术的发展趋势
01
双酶切技术简介
酶切技术的定义
01
02
03
酶切技术定义
酶切技术是一种利用酶的 专一性对特定底物进行切 割的生物技术。
酶的专一性
酶只对特定的底物起作用 ，切割位点具有高度专一 性。
双酶切技术的改进与创新
新型限制性核酸内切酶的 开发
随着生物技术的不断发展，新型限制性核酸 内切酶不断涌现，为双酶切技术提供更多选 择和灵活性。
自动化双酶切系统的研发
通过自动化技术实现双酶切的快速、高效和 标准化操作，提高实验效率并减少人为误差
。
双酶切技术的发展前景
01
双酶切技术在基因克隆和基因治 疗等领域的应用前景广阔，未来 将继续发挥重要作用。
05
双酶切技术的发展趋势
双酶切与其他技术的结合
双酶切与PCR技术的结合
通过双酶切技术将目的基因和载体进行酶切，再利用PCR技术进行扩增和鉴定，提高基 因克隆的效率和准确性。
双酶切与基因编辑技术的结合
将双酶切技术与CRISPR-Cas9等基因编辑技术结合，实现对特定基因的敲除、敲入和 定点突变等操作，为基因功能研究和基因治疗提供有力工具。
02
随着生物技术的不断进步，双酶 切技术将与其他技术不断融合创 新，为生命科学研究提供更多有 力工具。
THANKS
感谢观看
酶切技术的分类
单酶切技术
使用一种限制性内切核酸酶对 DNA进行切割。
双酶切技术
使用两种不同的限制性内切核酸酶 对DNA进行切割，通常用于产生 具有不同黏性末端的DNA片段， 便于后续的连接反应。
双酶切实验
双酶切实验双酶切实验是一种常见的分子生物学技术，旨在通过不同特异性的限制性内切酶对DNA分子进行切割，从而得到指定的DNA序列片段，有助于进一步分析、鉴定和应用DNA分子。
本文将从实验原理、实验材料、实验步骤、实验结果和分析等多方面介绍双酶切实验的具体过程和应用。
一、实验原理双酶切实验是一种分子生物学实验，其基本原理是通过限制性内切酶对DNA分子进行识别和切割，以获取所需的DNA序列片段。
限制性内切酶是一种酶，在特定的识别酶切位点中切割DNA分子，多数限制性内切酶都会切割对称型的序列，并产生黏性末端或平滑末端，这些末端能够用于DNA的连接、克隆或标记等。
双酶切实验是指利用两种或更多不同的限制性内切酶对同一个DNA分子进行切割，从而得到所需的DNA序列片段。
此时，需要将两种内切酶同时进行切割，以确保所需的DNA序列片段能够有效地被切割并分离出来，避免产生假阳性结果。
一般情况下，需要确保两种限制性内切酶不会相互重叠的切割同一段DNA序列，以避免影响实验结果的准确性。
二、实验材料1、DNA样本：需要纯度较高的DNA样本。
2、限制性内切酶：需要两种或多种不同的限制性内切酶。
3、相应的缓冲液和相关酶切盒。
4、电泳仪：实验完成后需要进行电泳检测。
5、夹心式电泳胶：用于制备凝胶板。
6、DNA分子量标准：用于校准电泳结果。
7、琼脂糖：用于制备凝胶板。
8、蒸馏水、乙醇、氯仿等：用于实验样本的获取和处理。
三、实验步骤1、制备DNA样本：需要先采集样本，并通过DNA提取试剂盒等方式获得纯度较高的DNA样本。
2、准备酶切反应体系：根据限制性内切酶的不同特性和酶切反应的需要，分别配置不同的酶切体系，并在冰箱中保存以备实验使用。
3、将DNA溶液与酶切反应体系混合：将DNA溶液与所需的酶切反应体系按比例混合，并进行酶切反应，一般需要保持恒定的温度和酶切时间来确保切割效果。
4、制备凝胶板：通过加热琼脂糖、混合等操作，制备夹心式电泳凝胶板，并在凝胶板中插入电极。
双酶切
反应条件：温度37℃，酶切h • 琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果 • UVP凝胶成像系统记录结果（电泳图）
结果及分析
• 双酶切结果跑出一条 带，质粒无条带。 • 分析：质粒无条带， 可能是模板问题。 • 双酶切跑出一条带， 可能是酶切后DNA片 段太小，导致结果模 糊。
注意事项
• 任何时候2种酶的总量不能超过反应体系的1/10体积。 • 双酶切时如果两种酶反应温度一致而buffer不同时，可查 阅内切酶供应商在目录后的附录中提供的各种酶在不同 buffer中的活力表，如果有一种buffer能同时使2种酶的活 力都超过70%的话，就可以用这种buffer作为反应buffer。 如果两种酶厂家不同无法查时可比较其buffer成份，相似 的话可以考虑各取一半中和。 • 如果2种酶的buffer成份相差较大或2种酶的反应温度不同 则必须分别做酶切 • 特别注意：在双酶切载体时如果2个酶切位点*得很近，必 须注意酶切顺序。因为有的限制性内切酶要求其识别序列 的两端至少保留有若干个碱基才能保证酶的有效切割。有 的酶要求识别序列两端有多个碱基的，则必须先切，否则 就可能造成酶切失败。
李婷王鹏飞王鹏飞高峰高峰实验原理实验原理用限制性内切酶去切割dna片断由于酶具有专一性一种酶只能识别一种特定的脱氧核苷酸序列所以可以用特定的这种酶去切割相应的dna片断进而达到定向切割的目的
双酶切及连接
指导老师：陈思 组员：李婷 王鹏飞 高峰 姜威 邵振天
实验原理
• 用限制性内切酶去切割DNA片断，由于酶 具有专一性，一种酶只能识别一种特定的 脱氧核苷酸序列，所以可以用特定的这种 酶去切割相应的DNA片断，进而达到定向 切割的目的。
思考题
影响限制性内切酶活性 的因素有哪些？
• • • • • • DNA的纯度 DNA的甲基化程度 酶切消化反应的温度 DNA的分子结构 溶液中离子浓度及种类 缓冲液的pH值
双酶切连接反应全攻略
双酶切连接反应全攻略一、实验材料和试剂准备1.DNA片段：需要连接的两个DNA片段，通常分别由PCR法或酶切法获得。
2. 双酶切酶：选择两种具有互补端切位点的酶，如常用的 EcoRI 和HindIII。
3.T4DNA连接酶或其他适用的连接酶。
4.DNA连接试剂盒：如T4DNA连接试剂盒等。
5.反应缓冲液：根据连接酶选择合适的反应缓冲液。
二、双酶切连接反应步骤1.酶切：将两个DNA片段用各自的切割酶酶切，生成互补的粘性末端。
注意，切割反应需要在适当的反应缓冲液和温度下进行，在所选择的酶切位点附近不得有其他酶切位点。
2.酶活化：将酶切后的DNA片段进行热变性处理，加入适当的酶活化缓冲液，在65-80℃下进行5-10分钟的热处理，以去除酶切过程产生的内切酶的限制性影响。
3.连接反应：将酶活化处理后的DNA片段加入连接反应体系中，加入适量的连接酶和缓冲液，并在适当的温度下进行连接反应。
连接反应温度一般为16-20℃，反应时间根据试剂的不同而有所差异，一般为2-4小时至过夜。
4.构建：将连接反应后的DNA取出，可根据需要进行进一步的DNA构建，如转化到宿主细胞中进行复制或进行其他分子生物学操作。
三、实验条件和注意事项1.酶切反应：根据所选择的切割酶的活性要求选择合适的反应缓冲液和酶切温度。
2.热变性处理：确保将酶切后的DNA片段充分变性，去除酶切产生的限制性影响，但同时避免过度变性导致DNA不可恢复的损伤。
3.连接反应：根据所选择的连接酶和试剂盒的要求进行适当的缓冲液和温度选择。
4.连接效率：连接效率可能受到多种因素的影响，如DNA片段的完整性、浓度、连接酶的活性和反应条件等。
在实验过程中，可以调节影响连接效率的参数来优化实验结果。
5.阳性对照：在连接试验中可以设计阳性对照样品，即将两个DNA片段直接连接，并通过测序确认连接效果。
四、技巧和优化1.控制DNA片段的完整性：在连接前，确保DNA片段经过正确的PCR扩增或酶切，以获得理想的DNA片段完整性。
双酶切连接反应的注意要点
双酶切连接反应的注意要点双酶切：1、在双酶切载体时如果2个酶切位点靠得很近，必须注意酶切顺序。
因为有的限制性内切酶要求其识别序列的两端至少保留有若干个碱基才能保证酶的有效切割。
有的酶要求识别序列两端有多个碱基的，则必须先切，否则就可能造成酶切失败。
2、回收PCR产物：回收的PCR产物片段=1：10，一般取前者0.03pmol，后者取0.3pmol。
pmol为单位的DNA转换为为?g单位的DNA：（X pmoles×长度bp×650）/ 1,000,000 （注：长度bp×650是该双链DNA的分子量）所得数值即为?g,也可以直接用这个公式套.1pmol 1000bp DNA=0.66μg,如载体是5380bp，则0.03pmol为0.03×5.38×0.66=0.106524?g。
3、双酶切时间及其体系：需要强调的是很多人建议酶切过夜，其实完全没有必要，一般酶切3个小时，对于PCR产物，可以过夜酶切，效果会很好。
酶切体系不宜过大，会影响质粒和酶的碰撞机会，效果降低；质粒量不应该超过酶切要求的最大量，否则酶切不完全，酶的用量控制在1U酶在15-20ul体系中酶解1ugDNA。
4、两种酶切的条件不同时，分别进行两次酶切，切完一个纯化后再切：温度要求不同，先酶切低温要求的，再酶切高温要求的；若盐浓度要求不同，先酶切低盐浓度要求的，再酶切高盐浓度要求的。
5、若质粒是在TE中保存的，TE 中的EDTA可能与酶的激活因子螯合，影响酶切效果，可放大酶切体积或重新浓缩质粒。
6、限制酶的选择非常重要，尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶，提前看好各公司的双切酶所用公用的BUFFER，以及各酶在公用BUFFER里的效率。
选好酶切位点后，在各个酶的两边加上保护碱基。
7、纯化问题：纯化PCR产物割胶还是柱式，推荐柱式，因为割胶手法不准，很容易割下大块的胶，影响纯化效率。
双酶切反应
双酶切buffer的选择：1、U ：Supplied with its own unique reaction buffer that is different from the four standard NEBuffers. Its compatibility with the four standard NEBuffers is indicated by the chart.2、BSA ：Supplied with a separate vial of bovine serum albumin (10 mg/ml). To obtain 100% activity BSA should be added to the 1X reaction mix to a final concentration of 100 μg/ml.3、SAM ：Supplied with a separate vial of S-adenosyl-methionine (SAM). To obtain 100% activity, SAM should be added to the 1X reaction mix as specified on the product data card.4、dd ：When performing a double digest with this enzyme, this NEBuffer is recommended because it minimizes star activity. Purified by scientists at SibEnzyme and supplied with a SibEnzyme buffer (B, K, O, W or Y) which ensures 100% activity. Its compatibility with the NEBuffer System is indicated on the chart.5、NR :This buffer is not recommended for use with with this enzyme。
双酶切连接反应
双酶切连接反应1、回收PCR产物：在进行PCR扩增时候，给引物两端设计好酶切位点，一般说来，限制酶的选择非常重要，尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶，如BamHI,HindIII,提前看好各公司的双切酶所用公用的BUFFER，以及各酶在公用BUFFER里的效率。
选好酶切位点后，在各个酶的两边加上保护碱基。
双酶切时间及其体系：需要强调的是很多人建议酶切过夜，其实完全没有必要，我一般酶切3个小时，其实1个小时已经足够。
应用大体系，如100微升。
纯化问题：纯化PCR产物割胶还是柱式，我推荐柱式，因为割胶手法不准，很容易割下大块的胶，影响纯化效率。
现在的柱式纯化号称可以祛除引物，既然如此，酶切掉的几个碱基肯定也会被纯化掉了。
所以，PCR产物和双酶切产物的纯化均可应用柱式纯化。
我用的是TAKARA的纯化柱试剂盒酶量的问题：以TAKARA的为例，其对1单位酶的定义如下：在50 μl 反应液中，30℃温度下反应1小时，将1 μg 的λDNA完全分解的酶量定义为1个活性单位(U)。
而该酶浓度约为15单位/微升，在除外酶降解的因素外，该酶可分解15μg的DNA，而一般从1-4ml菌液提出的 DNA约为3μg，而PCR纯化后的产物（50体系）约为3μg，所以即便全部加进去，只要纯化的质量好，酶切完全切得动。
2、酶切、回收后的PCR产物与载体的连接摩尔比的计算，很多人凭经验也可以。
但对于初学者从头认真计算则非常有必要。
回收的载体片段：回收的PCR产物片段=1：10 ，一般取前者0.03pmol，后者取0.3pmol。
pmol为单位的DNA转换为为μg单位的DNA：（X pmoles×长度bp×650）/ 1,000,000 （注：长度bp ×650是该双链DNA的分子量）所得数值即为μg,也可以直接用这个公式套.1pmol 1000bp DNA=0.66μg,如载体是5380bp，则0.03pmol为0.03×5.38×0.66=0.106524μg。
双酶切
做转化的时候，进行酶连接反应时，注意保持低温状态，因为LIGASE酶很容易降解.为保险起见，一般连接3小时，16度；对含有AMP-RESISTENCE的质粒铺板时，注意加AMP时的温度，温度过高，会使克隆株无法筛选出来.我的方法是培基高温消毒后放在烤箱里，烤箱一般温度为55-60度，然后做的时候拿出来，这样好掌握温度。
铺板前后注意用吹风机吹干；对照的设立：为验证双酶切是否成功。
1、同步双酶切同步双酶切是一种省时省力的常用方法。
选择能让两种酶同时作用的最佳缓冲液是非常重要的一步。
NEB每一种酶都随酶提供相应的最佳NEBuffer，以保证100%的酶活性。
NEBuffer的组成及内切酶在不同缓冲液中的活性见《内切酶在不同缓冲液里的活性表》及每支酶的说明书。
能在最大程度上保证两种酶活性的缓冲液即可用于双酶切。
由于内切酶在非最佳缓冲液条件下的切割速率会减缓，因此使用时可根据每种酶在非最优缓冲液中的具体活性相应调整酶量和反应时间。
2、分步酶切如果找不到一种可以同时适合两种酶的缓冲液，就只能采用分步酶切。
分步酶切应从反应要求盐浓度低的酶开始，酶切完毕后再调整盐浓度直至满足第二种酶的要求，然后加入第二种酶完成双酶切反应。
3、使用配有特殊缓冲液的酶进行双酶切如图使用配有特殊缓冲液的酶进行双酶切也不复杂。
在大多数情况下，采用标准缓冲液的酶也能在这些特殊缓冲液中进行酶切。
这保证了对缓冲液有特殊要求的酶也能良好工作。
由于内切酶在非最佳缓冲液中进行酶切反应时，反应速度会减缓，因此需要增加酶量或延长反应时间。
通过《内切酶在不同缓冲液里的活性表》可查看第二种酶在特殊缓冲液相应盐浓度下的作用活性。
双酶切建议缓冲液注：只要其中一种酶需要添加BSA，则应在双酶切反应体系中加入BSA。
BSA 不会影响任何内切酶的活性。
注意将甘油的终浓度控制在10%以下，以避免出现星号活性，详见《星号活性》。
可通过增加反应体系的总体积的方法实现这一要求。
双酶切连接反应之全攻略
双酶切连接反应之全攻略一、实验原理：1.首先，将待连接的两个DNA片段通过限制性内切酶酶切，产生两个具有互补末端的DNA片段。
2.再利用DNA连接酶，以这些互补末端为引导，将两个DNA片段连接在一起。
3.最后，通过热激励反应，将连接酶不活性化。
二、实验步骤：1.设计引物：根据待连接的两个DNA片段的序列，设计合适的引物，使得限制性内切酶切割后的末端具有互补性。
2.DNA酶切：将待连接的两个DNA片段与限制性内切酶一同反应，根据内切酶的适宜反应条件进行酶切反应。
3.酶切产物纯化：将酶切产物进行电泳分离，通过切胶取带的方式将目标片段分离出来，然后进行片段纯化。
4.连接反应：将纯化后的两个DNA片段与DNA连接酶一同反应，根据连接酶的适宜条件进行连接反应。
一般而言，反应体系中还需要包含ATP供能和缓冲液等。
5.连接产物纯化：对连接反应的产物进行纯化，一般选择柱层析法（如凝胶过滤法、离心柱法等）或酸酶消化法（如酚氯仿法）等方法。
6.验证连接效果：通过DNA测序等方法验证连接效果，确保连接成功。
三、实验注意事项：1.引物设计要合理：引物的设计要充分考虑到限制性内切酶的切割位点和连接效率。
合理选择引物长度和碱基组成，避免引物之间产生非特异性连接。
2.内切酶酶切条件的选择：根据所使用的内切酶的反应条件和切割位点，合理选择反应温度和反应时间，确保内切酶可以有效切割DNA片段。
3.DNA连接酶的选择和反应条件：根据实验需要，选择合适的DNA连接酶，考虑到连接效率和连接酶的活性等因素。
同时需要注意反应缓冲液的pH和温度等条件。
4.连接产物纯化：选择合适的纯化方法，确保连接产物的纯度和浓度。
同时注意纯化过程中的温度和pH等条件，避免产物降解或损失。
5.连接效果的验证：通过DNA测序方法验证连接效果，并且需要对连接的序列进行分析，确保连接正确。
四、实验应用：1.基因克隆：用于将外源基因克隆到载体上，以便于大规模扩增和表达。
双酶切连接全攻略
双酶切连接全攻略一、背景知识1.DNA序列：DNA是生物体中的遗传物质，它由四种碱基（腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、鸟嘌呤(G)和胞嘧啶(C)）组成的序列。
DNA的信息是以碱基的顺序编码的，其中两条互补的DNA链可以通过碱基配对形成双螺旋结构。
2.酶切：酶是一类能够催化特定化学反应的蛋白质，酶切是指通过酶的作用，将DNA序列切割成特定的片段。
3.限制性内切酶：也称为限制酶，是一类具有特异性的酶，可以识别并切割特定的DNA序列。
每种限制酶都有自己的切割位点，当DNA序列中出现与其切割位点相匹配的序列时，限制酶将在该位点切割DNA。
二、原理三、步骤1.设计引物：根据需要连接的两段DNA序列，设计引物使其能够加在两端。
引物可以通过计算机辅助设计软件进行设计，同时要确保引物与DNA序列的互补性和合适的长度。
2.DNA提取：从细胞中提取目标DNA序列，可以使用常见的DNA提取试剂盒或其他方法进行提取。
3.PCR扩增：使用引物对DNA进行PCR扩增，产生需要连接的两段DNA序列。
4.DNA酶切：根据已设计的引物，使用限制酶切割两段DNA序列。
注意选择限制酶与引物切割位点相互匹配的酶。
5.酶切后处理：将切割后的DNA片段进行凝胶电泳，用紫外线照射后可见DNA条带。
根据所需片段的大小，选择合适的片段进行提取。
6.连接反应：将两段DNA片段的黏性末端连接在一起。
可以使用商业化的连接试剂盒，也可以自行设计反应体系。
7.改造端：将连接后的DNA进行磷酸化和去磷酸化处理，加入连接酶，使连接更加稳定。
8.转化：将连接后的DNA转化到适当的宿主细胞中，例如大肠杆菌等。
9.鉴定：通过PCR扩增或其他方法对转化细胞进行检验，确认连接是否成功。
注意事项：1.引物设计要合理：引物的长度一般为18-25个碱基，其中含有5'末端的限制酶切割位点。
引物之间应避免互相重叠或互相穿插。
2.限制酶选择要合适：根据所需连接的DNA序列，选择适合的限制酶，并确保其切割位点不会干扰彼此。
双酶切及连接-PPT课件
内切酶失活
2.
DNA不纯，含有SDS，酚 ，EDTA等内切酶抑制因子
条件不适（试剂、温度） DNA酶切位点上的碱基被 甲基化 DNA酶切位点上没有甲基 化（如Dpn I）
3. 4.
对 策
5.
5.
6.
6.
7.
DNA位点上存在其它修饰
DNA不存在该酶识别顺序
7.
六、限制性内切酶酶切常见问题分析 问题二：DNA切割不完全
原 因
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11.
1. 2.
用5-10倍量过量消化 用酶贮藏液或反应缓冲液稀释酶
内切酶活性下降 内切酶稀释不正确 DNA不纯，反应条件不佳 内切酶识别的DNA位点上的碱 基被甲基化或存在其它修饰 部分DNA溶液粘在管壁上 内切酶溶液粘度大，取样不准 酶切后DNA粘末端退火 由于反应溶液、温度、强烈振 荡使内切酶变性 过度稀释使酶活性降低 反应条件不适 识别位点两侧插入了可影响酶 切效率的核酸顺序
加体系离心 37℃ 水浴1h 跑电泳
结果
结果与分析
• 质粒的双酶切没有出现结果但marker出了 条带说明胶没有问题，而PCR的酶切产物 出现了较好的实验结果。
五、注意事项——限制性内切酶酶切
１．内切酶： 不应混有其它杂蛋白特别是其它内切酶或外切酶的污染； 注意内切酶的识别位点及形成的粘性末端； 内切酶的用量：根据内切酶单位和ＤＮＡ用量而定。 同时内切酶体积不能超过反应体系１０％，因内切酶中含 ５０％甘油，体系中甘油超过５％会抑制内切酶活力； 内切酶操作应在低温下进行（冰上）；使用时防止操作中 对内切酶的污染。
限制性内切酶的类型
第二类（III型）限制性内切酶：也有专一的
双酶切连接反应全攻略
双酶切连接反应全攻略一、实验步骤1.准备实验材料。
包括DNA片段、酶切酶、连接酶、缓冲液、ATP、dNTPs等。
确保实验材料的质量和纯度。
2.酶切反应。
将待连接的DNA片段用适当的酶切酶进行消化，生成所需的酶切位点。
注意控制酶切反应的时间和温度，避免反应过度，影响后续实验。
3.酶切产物纯化。
将酶切反应产物通过凝胶电泳或商用DNA纯化试剂盒等方法进行净化，去除杂质和未消化的DNA片段。
4.连接反应。
将纯化的酶切产物加入连接酶反应体系中，与连接酶和ATP一起进行连接反应。
注意控制连接反应的时间和温度，避免反应过度或反应不足。
5.连接产物纯化。
将连接反应产物进行纯化，可通过凝胶电泳、商用DNA纯化试剂盒等方法除去杂质和未连接的DNA片段。
6.连接产物验证。
通过酶切酶切剖析或测序等方法验证连接产物的正确性。
确保所得到的连接产物与设计的预期一致。
二、注意事项1.实验室操作要无菌，采取合适的消毒措施，避免外源性DNA的污染。
2.实验中使用的酶切酶和连接酶要选择高纯度、高活性的产品，确保实验的可靠性。
3.实验设定对应的阴性对照组，用于排除实验中可能出现的假阳性结果。
4.在实验过程中，遵守所有相关安全操作规程，特别是对于有害和易燃易爆品的操作，要严格遵守相关安全规定。
5.实验过程中，注意消耗品的浓度和保存，确保实验的稳定性和一致性。
三、优化建议1.酶切反应时间和温度的优化：根据实验材料的不同，可以对酶切反应的时间和温度进行优化。
通过改变反应时间和温度，调节酶切反应的效率和特异性。
2.连接反应时间和酶浓度的优化：连接反应的时间和连接酶的浓度会影响连接产物的生成率和质量。
建议在实验中进行时间和浓度的优化，找到最适合的条件。
3.连接产物纯化方法的优化：连接反应产物的纯化方法对于后续实验结果的可靠性和准确性非常重要。
可以尝试不同的纯化方法，选择最适合实验需要的方法。
4.连接产物验证方法的优化：连接产物的验证方法可以采用酶切纯化、测序、PCR扩增等多种方法。
双酶切连接全攻略
双酶切连接反应之全攻略前一阵子一直在做双酶切质粒重组，失败了很多次，不过很快改善了实验方法，用2周重组了14个质粒。
现就自己的体会，结合丁香园战友的宝贵经验，谈一下质粒重组的一些个人经验。
1、回收PCR产物：在进行PCR扩增时候，给引物两端设计好酶切位点，一般说来，限制酶的选择非常重要，尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶，如BamHI,HindIII,提前看好各公司的双切酶所用公用的BUFFER，以及各酶在公用BUFFER里的效率。
选好酶切位点后，在各个酶的两边加上保护碱基，其原则可参照：/upload/2006/08/13/31219184.pdf。
双酶切时间及其体系：需要强调的是很多人建议酶切过夜，其实完全没有必要，我一般酶切3个小时，其实1个小时已经足够。
应用大体系，如100微升。
纯化问题：纯化PCR产物割胶还是柱式，我推荐柱式，因为割胶手法不准，很容易割下大块的胶，影响纯化效率。
现在的柱式纯化号称可以祛除引物，既然如此，酶切掉的几个碱基肯定也会被纯化掉了。
所以，PCR产物和双酶切产物的纯化均可应用柱式纯化。
我用的是TAKARA的纯化柱试剂盒酶量的问题：以TAKARA的为例，其对1单位酶的定义如下：在50 μl 反应液中，30℃温度下反应1小时，将1 μg 的λDNA完全分解的酶量定义为1个活性单位(U)。
而该酶浓度约为15单位/微升，在除外酶降解的因素外，该酶可分解15μg的DNA，而一般从1-4ml 菌液提出的DNA约为3μg，而PCR纯化后的产物（50体系）约为3μg，所以即便全部加进去，只要纯化的质量好，酶切完全切得动。
2、酶切、回收后的PCR产物与载体的连接摩尔比的计算，很多人凭经验也可以。
但对于初学者从头认真计算则非常有必要。
回收的载体片段：回收的PCR产物片段=1：10，一般取前者0.03pmol，后者取0.3pmol。
pmol为单位的DNA转换为为µg单位的DNA：（X pmoles×长度bp×650）/ 1,000,000 （注：长度bp×650是该双链DNA的分子量）所得数值即为µg,也可以直接用这个公式套.1pmol 1000bp DNA=0.66μg,如载体是5380bp，则0.03pmol为0.03×5.38×0.66=0.106524µg。
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【原创】双酶切连接反应之全攻略（原创）双酶切连接反应之全攻略前一阵子一直在做双酶切质粒重组，失败了很多次，不过很快改善了实验方法，用2周重组了14个质粒。
现就自己的体会，结合战友的宝贵经验，谈一下质粒重组的一些个人经验。
1、回收PCR产物：在进行PCR扩增时候，给引物两端设计好酶切位点，一般说来，限制酶的选择非常重要，尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶，如BamHI,HindIII,提前看好各公司的双切酶所用公用的BUFFER，以及各酶在公用BUFFER里的效率。
选好酶切位点后，在各个酶的两边加上保护碱基，其原则可参照：双酶切时间及其体系：需要强调的是很多人建议酶切过夜，其实完全没有必要，我一般酶切3个小时，其实1个小时已经足够。
应用大体系，如100微升。
纯化问题：纯化PCR产物割胶还是柱式，我推荐柱式，因为割胶手法不准，很容易割下大块的胶，影响纯化效率。
现在的柱式纯化号称可以祛除引物，既然如此，酶切掉的几个碱基肯定也会被纯化掉了。
所以，PCR产物和双酶切产物的纯化均可应用柱式纯化。
我用的是TAKARA的纯化柱试剂盒酶量的问题：以TAKARA的为例，其对1单位酶的定义如下：在50 μl 反应液中，30℃温度下反应1小时，将1 μg 的λDNA完全分解的酶量定义为1个活性单位(U)。
而该酶浓度约为15单位/微升，在除外酶降解的因素外，该酶可分解15μg的DNA，而一般从1-4ml菌液提出的DNA约为3μg，而PCR纯化后的产物（50体系）约为3μg，所以即便全部加进去，只要纯化的质量好，酶切完全切得动。
2、酶切、回收后的PCR产物与载体的连接摩尔比的计算，很多人凭经验也可以。
但对于初学者从头认真计算则非常有必要。
回收的载体片段：回收的PCR产物片段=1：10，一般取前者，后者取。
pmol为单位的DNA转换为为μg单位的DNA：（X pmoles×长度bp×650）/ 1,000,000 （注：长度bp×650是该双链DNA的分子量）所得数值即为μg,也可以直接用这个公式套.1pmol 1000bp DNA=μg,如载体是5380bp，则为××=μg。
测DNA浓度可以在专用机子上测，注意OD值，一般约另外，如果嫌麻烦，也可用MARKER进行估测，如MARKER2000，5微升的MARKER每个条带约50ng。
连接反应：TAKARA的连接酶上的说明写的过夜，而其对连接酶单位的定义为：在20 μl的连接反应体系中，6 μg的λDNA-HindIII的分解物在16℃下反应30分钟时，有90%以上的DNA片段被连接所需要的酶量定义为1个活性单位（U）。
而它的浓度为个小时足已。
3，所以完全够用。
连接酶容易失活，注意低温操作，最好在冰上。
时间350 U/μl3、转化：a、全量（10 μl）加入至100 μl JM109感受态细胞中，冰中放置30分钟。
b、42℃加热45秒钟后，再在冰中放置1分钟。
c、加入890 μl AMP阴性培养基，37℃振荡培养60分钟。
取100μl铺板。
也可离心后余100μl几个非常重要的问题1 做转化的时候,进行酶连接反应时,注意保持低温状态,因为LIGASE酶很容易降解.为保险起见,一般连接3小时,16度.2 对含有AMP-RESISTENCE的质粒铺板时,注意加AMP时的温度,温度过高,会使克隆株无法筛选出来.我的方法是培基高温消毒后放在烤箱里，烤箱一般温度为55-60度，然后做的时候拿出来，这样好掌握温度。
铺板前后注意用吹风机吹干3对照的设立：为验证双酶切是否成功,可做如下对照:A 酶切反应时加各单酶分别切,两管,用同一种BUFFER,跑胶,看单切的两管是否成线性.如两管均成线性可初步判断双酶切成功.做转化时,也要进行对照.设4个:A.即拿双酶切的质粒产物也进行连接反应,这个对照可进一步看双酶切是否成功,如果长出克隆,说明很有可能只进行了单酶切,如没长出克隆,则证明双酶切成功,当然要保证感受态,培基,连接酶都'正常'的情况下.B.酶切过的未进行连接反应的双酶切产物,进行转化,这一步可以证明是否有残留的未被任何酶切的原始质粒C.设原始质粒为对照,意为检测整个操作过程中是否有误.阴性板上用同一批感受态细胞铺板20微升足够,检测感受态状况.4.所有的试剂切记低温保存.一步一个脚印.不要偷懒,图省事最后却更费事.注意设立对照。
经PCR鉴定，克隆90%-100%的阳性率，所以在后面的挑克隆中，我只挑选4个就足够了。
然后双酶切鉴定，测序。
希望大家不断补充。
Ding一下，和我的方法差不多。
ligase和buffer，马上置于冰上冷却，再加入5min度水浴45连接前最好将水、插入片段和载体混合好以后置于springwel wrote:用2周重组了14个质粒。
这个效率非常不错！佩服！smartkevin wrote:Ding一下，和我的方法差不多。
连接前最好将水、插入片段和载体混合好以后置于45度水浴5min，马上置于冰上冷却，再加入buffer和ligase。
这个操作是什么原理为什么要选择45C其实也不一定45度，估计50度也行，45度对于几个碱基结合（酶切位点）的打开绰绰有余。
分子克隆3的经典操作，个人认为主要目的如下：插入片段和载体在之前的操作过程中有部分粘性末端已经匹配，如果直接连接可能会有多重插入和多载体自连的情况，45度处理是其粘性末端打开。
由于片段与载体混合、预热后马上置于冰上，使得片段与载体最大限度匹配，从而提高连接效率。
springwel wrote:酶量的问题：以TAKARA的为例，其对1单位酶的定义如下：在50 μl 反应液中，30℃温度下反应1小时，将1 μg 的λDNA完全分解的酶量定义为1个活性单位(U)。
而该酶浓度约为15单位/微升，在除外酶降解的因素外，该酶可分解15μg的DNA，而一般从1-4ml菌液提出的DNA约为3μg，而PCR纯化后的产物（50体系）约为3μg，所以即便全部加进去，只要纯化的质量好，酶切完全切得动。
．[color=red]但是公司给推荐的一般都是2。
0ul体系加1ul，其实我有的时候为了省酶，在20ul只加酶，切的也很好。
我不明白的是，我们一般的质粒载体是否象lamda DNA一样好切，如果是那样的话，100ul体系加1ul可能也够了，会省好多钱啊，尤其是有的酶，一支才10ul，按推荐量加，做两个100ul体系需要两管，不知道有人试过没有。
smartkevin wrote:其实也不一定45度，估计50度也行，45度对于几个碱基结合（酶切位点）的打开绰绰有余。
分子克隆3的经典操作，个人认为主要目的如下：插入片段和载体在之前的操作过程中有部分粘性末端已经匹配，如果直接连接可能会有多重插入和多载体自连的情况，45度处理是其粘性末端打开。
由于片段与载体混合、预热后马上置于冰上，使得片段与载体最大限度匹配，从而提高连接效率。
如果真的是这样我觉得对于非同源粘性末端和平末端作用不大，对于同源粘性末端可能有作用。
不知道还有没有其他的解释我倒是没有仔细看过分子克隆。
mybbff wrote:如果真的是这样我觉得对于非同源粘性末端和平末端作用不大，对于同源粘性末端可能有作用。
不知道还有没有其他的解释我倒是没有仔细看过分子克隆。
刚才查了一下分子克隆3，只说了一句“以消除重新复性而导致的末端相互聚合”（中文版p71）。
其实如果是粘性末端酶切的话都是有用的，无所谓非同源和同源末端，就算是非同源末端，载体和载体，片段和片段也能聚合。
对于平末端应该就没有什么作用了。
．autumnsun wrote:但是公司给推荐的一般都是2。
0ul体系加1ul，其实我有的时候为了省酶，在20ul只加酶，切的也很好。
我不明白的是，我们一般的质粒载体是否象lamda DNA一样好切，如果是那样的话，100ul体系加1ul可能也够了，会省好多钱啊，尤其是有的酶，一支才10ul，按推荐量加，做两个100ul体系需要两管，不知道有人试过没有。
如果100ul里的DNA太多了也不行啊，酶和DNA还是要匹配的我不明白的是，我们一般的质粒载体是否象lamda DNA一样好切，如果是那样的话，100ul体系加1ul可能也够了，会省好多钱啊，尤其是有的酶，一支才10ul，按推荐量加，做两个100ul体系需要两管，不知道有人试过没有。
其实除了考虑酶浓度（每微升多少个单位）以外，还应该考虑这种酶在lamda DNA上的酶切位点数目。
比如用HincII和XbaI双切pUC118，这两个酶在pUC118上都只有一个酶切位点，而在lamda DNA上的酶切位点分别是35个和1个。
根据酶活性的定义，相同单位的HincII和XbaI对pUC118的酶切效率是35比1，所以在双酶切体系中，所用的HincII显然应该要少很多。
好！！！真实用！！！“回收的载体片段：回收的PCR产物片段=1：10，一般取前者，后者取。
”是不是应该前者，后者啊精华！投你一票！msher wrote:好！！！真实用！！！．“回收的载体片段：回收的PCR产物片段=1：10，一般取前者，后者取。
”是不是应该前者，后者啊已经改了,谢谢!昨天14个测序结果出来，全部是阳性克隆。
两边是载体的序列，中间是插入的目的片段。
回顾自己的实验现补充几点。
做转化时,也要进行对照.设4个:A.即拿双酶切的质粒产物也进行连接反应,这个对照可进一步看双酶切是否成功,如果长出克隆,说明很有可能只进行了单酶切,如没长出克隆,则证明双酶切成功,当然要保证感受态,培基,连接酶都'正常'的情况下.B.酶切过的未进行连接反应的双酶切产物,进行转化,这一步可以证明是否有残留的未被任何酶切的原始质粒C.设原始质粒为对照,意为检测整个操作过程中是否有误.阴性板上用同一批感受态细胞铺板20微升足够,检测感受态状况.就上面的对照简要说一下我的结果。
转化后第二天可见14个标本的平皿上长了很多克隆，约100个左右，我用的是直径6cm的板子，所以仍显较多，（我是先挑半个克隆并标记好行PCR鉴定后再对另外的一半进行摇菌抽提质粒），较难挑克隆，所以铺皿时不用离心，直接用100微升的铺皿就可以了，我其中一个是这样做的，长得克隆较大，很好挑选。
下面简要的说一下对照的结果。
A 只长出了3个克隆，以100的基数计算，约为3%。
即双酶切反应中质粒只有3%进行了单酶切B 约有5个克隆，即质粒完全没被切动的约5%C 长了很多克隆，证明操作系统没有问题。
为系统控制指标。
D 长了很多克隆，证明感受态没有问题。
这些对照相辅相成，扬长避短。
万一什么都没作出来，也好分析原因。
感受态细胞的制备JM108．刚开始做实验时，是向TAKARA购买的，一支30元，定了10支。