霉菌和酵母菌检验测试片操作方法PetrifilmandMoldcount
食品中霉菌和酵母的快速测定测试片法
食品中霉菌和酵母菌的快速测定测试片法1范围本标准规定了霉菌和酵母（molds and yeasts）的快速测定测试片方法。
本标准适用于食品中霉菌和酵母的快速测定。
2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。
其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB4789.15食品安全国家标准食品微生物学检验霉菌和酵母计数AOAC OMA2014.05《食品中霉菌酵母菌计数测定方法3M™Petrifilm™快速霉菌酵母计数测试片方法》3术语和定义GB4789.15界定的术语和定义适用于本文件。
4设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其它设备和材料如下：4.1培养箱：２８℃±１℃4.2恒温水浴锅：46℃±１℃4.3天平：感量为0.1g4.4均质器及均质袋4.5振荡器4.6无菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸头4.7无菌锥形瓶：容量500mL4.8放大镜或3M测试片判读仪（PPRA）用于辅助判读5.培养基和试剂5.13M快速霉菌酵母测试片和压板：见附录A5.2磷酸盐缓冲液：见附录B中B.1；无菌生理盐水：见附录B中B.26检验程序检验程序见图1。
检样25g（或25mL）样品+225mL稀释液，均质10倍系列稀释选择2个～3个适宜稀释度样品匀液，各取1mL分别加入测试片内，压好培养28℃±1℃48±2h计算各测试片菌落数计算总的菌落数报告图1霉菌和酵母平板计数法的检验程序7操作步骤7.1样品的稀释7.1.1固体和半固体样品：称取25g样品置于盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，8000r/min～10000r/min均质1min～2min，或放入盛有225mL稀释液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min～2min，制成1:10的样品匀液。
Petrifilm肠杆菌科测试片法霉菌和酵母菌测试片法ppt课件
Copyright 3M China Ltd.
Microbiology
国家汽车产业政策的相继出台和落实 ，势必 对汽车 消费起 到了拉 动作用 ；而银 行汽车 消费信 贷的推 出和实 现，则 是汽车 消费市 场快速 成长和 发展不 可或缺 的重要 手段。
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Microbiology
国家汽车产业政策的相继出台和落实 ，势必 对汽车 消费起 到了拉 动作用 ；而银 行汽车 消费信 贷的推 出和实 现，则 是汽车 消费市 场快速 成长和 发展不 可或缺 的重要 手段。
什么是肠杆菌科？
好氧或兼性厌氧发酵型G-杆菌
氧化酶阴性
氧化酶阳性
肠杆菌科
乳糖发酵
非乳糖发酵
3M PetrfilmTM 肠杆菌科测试片法
检样 25g(ml)样品＋225ml 稀释，接种Petrifilm测试片
371°C, 24 2h
菌落计数
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结果报告
Microbiology
国家汽车产业政策的相继出台和落实 ，势必 对汽车 消费起 到了拉 动作用 ；而银 行汽车 消费信 贷的推 出和实 现，则 是汽车 消费市 场快速 成长和 发展不 可或缺 的重要 手段。
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国家汽车产业政策的相继出台和落实 ，势必 对汽车 消费起 到了拉 动作用 ；而银 行汽车 消费信 贷的推 出和实 现，则 是汽车 消费市 场快速 成长和 发展不 可或缺 的重要 手段。
背景
1870年以来，大肠菌群检测一直用于 食品工业中卫生状况的监控
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国家汽车产业政策的相继出台和落实 ，势必 对汽车 消费起 到了拉 动作用 ；而银 行汽车 消费信 贷的推 出和实 现，则 是汽车 消费市 场快速 成长和 发展不 可或缺 的重要 手段。
霉菌和酵母菌检测
霉菌和酵母菌检测方法
GB 4789.15-2010
一、稀释
1、无菌吸管吸取25ml样品至装有225ml无菌蒸馏水的无菌锥形瓶中，充分混
匀。
2、吸取1ml混匀的样品，缓慢注入装有9ml稀释液的无菌试管中（枪头不要
接触液面），混匀。
3、按步骤2制备10倍系列稀释样品，每次更换无菌枪头。
4、根据估计，选择合适的2~3个样品匀液，吸取1ml至无菌平皿，每个梯度
做两个平皿，同时用1ml稀释液做空白对照。
5、将15~20ml冷却至46℃左右的马铃薯-葡萄糖-琼脂培养基倾注平皿，转动
混匀。
二、培养
1、琼脂凝固后倒置28℃±1℃培养5d，观察记录。
三、计数
1、选择菌落数在10~150之间的平皿，根据菌落形态分别计算霉菌和酵母数。
霉菌蔓延生长整个平板记录多不可计。
菌落数应采用两个平皿的平均数。
四、报告
1、计算两个平皿菌落的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数计算。
2、若所有平皿菌落数均大于150，则对稀释度最高的平皿进行计算，其他平皿
可记录为多不可计，结果按最高稀释倍数计算结果报告。
3、若所有平皿菌落数小于 10，则对稀释度最低的平皿进行计算。
4、若所有平皿均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释度计算，如为原液，
则以小于1计算。
5、小于100菌落数时，四舍五入原则取两位有效数字。
大于或等于100菌落
数时，第三位四舍五入原则，取前两位，剩余位数为0。
6、空白对照有菌落生长，结果无效。
酵母菌-霉菌二合一测试片产品说明书
酵母菌&霉菌测试片是由营养培养基、细菌抑制剂、酶显色底物等组成的一次性快速检测产品，与传统方法相比，省去了培养基的配置、培养器皿的清洗和灭菌处理等大量辅助性工作，操作简单，大大缩短了检测时间，通过酶底物的显色放大作用，使酵母菌和霉菌能在测试片上清晰的显示出来，同时将其培养时间缩短到48h左右。
本产品适合于各类食品、食品原料、水果中酵母菌和霉菌的检测，也可用于食品加工厂及设备表面的卫生检查。
执行标准：GB 4789.15-2010《食品安全国家标准、食品微生物学检测、霉菌和酵母计数》。
●样品处理：取样品25mL(g)放入225mL 无菌稀释液（磷酸盐缓冲液或生理盐水）的取样器或均质杯内，制成1:10的样品匀液，用1mL的灭菌吸管吸取1:10样品匀液1mL，注入含有9mL稀释液的试管内，摇匀后得到1:100的样品稀释液，依次往下稀释，制备10倍系列稀释样品匀液。
●接种：一般样品选1~2个稀释度进行检测，含菌量少的液体样品可直接吸取原液进行检测。
将测试片置于平坦实验台面，打开封口，用无菌吸管吸取1mL样品匀液加到测试片上，调整测试片角度使样品液湿润整张测试片。
每个稀释度接种两片，同时取1mL无菌稀释液接种另一测试片作空白对照。
●培养：将接种好的纸片（可叠放）放置于28±1℃培养箱中培养48～72h，堆叠片数不超过6片。
3结果判读酵母菌在测试片上生长呈现出蓝色菌落，霉菌在测试片上呈现表示。
5 保存条件未开封的产品需保存于2~8℃冰箱中，保质期为一年，铝箔袋打开后，未用完的测试片应放回铝箔袋中封好，放到2~8冰箱中，建议一个月内用完。
6 附加说明●样品匀液pH值应在6.5~7.5之间，否则用无菌的1mol/L氢氧化钠（NaOH）或1mol/L盐酸（HCl）调节。
●磷酸盐缓冲液稀释液的配制与灭菌贮存液：称取34.0g分析纯磷酸二氢钾溶于500mL蒸馏水中，用大约175mL的1mol/LNaOH 调节pH至7.2，用蒸馏水稀释至1000mL后贮藏于4℃。
AOAC 官方方法 997.02 食品中酵母菌和霉菌的计数 再水化干膜法(英文版)
17.2.09AOAC Official Method997.02Yeast and Mold Counts in FoodsDry Rehydratable Film Method(Petrifilm™Method)First Action1997Final Action2000(Applicable to enumeration of total yeasts and molds in foods.) See Tables997.02A and B for the results of the interlaboratory study supporting the acceptance of the method.A.PrincipleMethod uses culture plates of dry medium supplemented with an-tibiotics,dye to enhance visualization of growth,and cold H2O-soluble gelling agent.Undiluted or diluted suspensions are added to plates at a rate of1mL/plate.Suspension is spread over ca 30cm2growth area.Gelling agent is allowed to solidify,plates are incubated,and yeasts and molds are counted.B.Apparatus and Reagent(a)Yeast and mold count plates.—Contain nutrients supple-mented with chlortetracycline,chloramphenicol,cold H2O-soluble gelling agent,and dye sensitive to presence of phosphatase (5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate)that enhances visualiza-tion of yeast and mold growth.Circular growth area of single plate contains thirty1×1cm squares outlined on film base.(Available as 3M™Petrifilm™Yeast and Mold Count plates from3M Microbiol-ogy Products,3M Center,Bldg.275-5W-05,St.Paul, MN55144-1000,USA.)(b)Plastic spreader.—Provided with Petrifilm plates,designed to spread suspension evenly over plate growth area.(c)Pipets.—Serological pipet or pipetting syringe accurately de-livering1.0mL.(d)Colony counter.—Standard apparatus,Quebec model preferred, or one providing equivalent magnification(1.5×)and visibility. (e)Blender.—High speed mechanical blender rotating at 10000–12000rpm,or stomacher.(f)Dilution water.—Butterfield’s phosphate-buffered dilution water.Place34g KH2PO4into1L volumetric flask and dissolve in 500mL H2O.Adjust pH to7.2with1M NaOH(40g/L)and dilute to volume with H2O.Autoclave15min at121°C.Store stock solution in refrigerator.Prepare dilution blanks by pipetting1.25mL stock solution into1L volumetric flask and dilute to volume with H2O. Dispense90or99±1mL into bottles.Autoclave15min at121°C. C.General InstructionsStore unopened yeast and mold count plate foil pouches at≤8°C. After opening,return unused plates to foil pouch.Seal pouch by folding and taping the open end.Store resealed foil pouch at≤8°C in a dry e plates within1month after opening.Exposure of yeast and mold count plates to temperatures>25°C and/or humidities>50%RH can affect performance of plates.After use,plates contain viable yeast and/or mold cultures.Auto-clave used plates15min at121°C prior to discarding.D.Preparation of Test SuspensionAseptically prepare1:10or greater dilution of food product with dilution H2O.Blend or stomach2min and plate.Prepare additional dilutions as required.E.AnalysisPlace yeast and mold count plate on flat surface.Lift top film,hold pipet perpendicular to plate,and carefully inoculate1mL test sus-pension onto center of film base.Place top film down onto inoculum. Lift plastic spreader using circular handle.Align center of spreader with approximate center of plate.Distribute suspension evenly using gentle downward pressure on center of spreader.Do not slide spreader across film.Remove spreader and leave plate un-disturbed1min to let gel solidify.Place plates in incubator in horizontal position,clear side up,in stacks not exceeding20units.Incubate plates5days at20–25°C. Count plates promptly after incubation period.Yeasts appear as blue-green or off-white in color and form small defined colonies. Mold colonies are usually blue but may also assume their natural pigmentation(e.g.,black,yellow,green).They tend to be larger and more diffuse than yeast colonies.To calculate yeast and mold count,multiply total number of yeast and mold colonies/plate(or average number of colonies/plate,if counting duplicate plates of same dilution)by appropriate dilution factor.When counting colonies on duplicate plates of consecutive dilutions,calculate mean number of colonies for each dilution be-fore determining average yeast and mold count.Estimated counts can be made on plates with>150colonies and should be reported as estimated counts.In making such counts,de-termine average count/1cm2and multiply by30(circular growth area is ca30cm2).High numbers of yeast colonies may cause the entire growth area to turn blue.High numbers of mold colonies may cause growth area to turn blue,black,yellow,etc.When this occurs,do not make estimated counts, but further dilute and plate test suspension to obtain more accurate count. Reference:J.AOAC Int.80,806(1997).Revised:March2002©2002AOAC INTERNATIONAL。
MPetrifilm酵母菌与霉菌快检片判读手册
Estimated Yeast Count ~TNTC (actual count >104) 圖 4 顯示 Petrifilm YM (TNTC 數量太多 而無法計算)，可以發現在培養區邊緣 有許多小的藍色菌落(上方方框)，
Estimated Mold Count~64 圖 5 測試片上的菌落彼此推擠覆蓋，可由 菌落的邊緣或中心焦點計數。亦可將測試 片分成幾個區域計算，本例分成 4 個小區 域，計算右下角區塊可得 16 個黴菌菌落 數。
3M
Petrifilm Yeast and Mold Count Plate
酵母菌及黴菌快速檢驗測試片 判讀手冊 3M Petrifilm Yeast and Mold Count Plate (YM)，內含培養基、水溶膠、和方便判讀的呈色 劑。
Total Count =20 Yeast Count =16 Mold Count =4 Petrifilm YM 可以同時培養酵母菌及黴菌
。大形菌落 。菌落有擴散的邊緣 。各種顏色(棕色、米黃色、橙色、藍綠色) 。菌落為平面狀 。菌落中心顏色較深(亦可能不同顏色)
圖 11.揭起上層膜並從培養基 中挑起菌落，進一步鑑定。
圖 12.將菌落移到滴上無菌水 的載片上，蓋上蓋玻片並以 顯微鏡觀察。
圖 13.酵母菌為卵圓形或有出 芽生殖現象。
圖 14.黴菌為有分枝或成串的 菌絲。
3M Petrifilm Yeast and Mold Count Plate
Yeast and Mold Count =0 圖 2 顯示 Petrifilm YM 測試片上沒有酵母 菌及黴菌生長。
Estimated Total Count~500 Estimated Yeast Count~480 Mold Count =21 微生物培養圓形區域面積為 30cm²，若菌落數超 過 150 可使用估計方法，先計算數個 1cm²菌落 求其平均數，然後乘以 30。 酵母菌顏色為粉棕 色至藍綠色。
霉菌与酵母菌计数方法(2015版药典)
霉菌与酵母菌计数方法1试验菌液的制备和使用（以白色念珠菌为示例）白色念珠菌（0）代↓传代培养↓实验菌液的制备：沙氏葡萄糖琼脂培养基或沙氏葡萄糖液体培养基，培养温度20～25℃，培养时间2～3天↓计数培养基适用性检查：胰酪大豆胨琼脂培养基，培养温度30～35℃，培养时间不超过5天，接种量不大于100cfu↓计数方法适用性试验：胰酪大豆胨琼脂培养基（MPN法不适用），培养温度30～35℃，培养时间不超过5天，接种量不大于100cfu 注：当需用玫瑰红钠琼脂培养基测定霉菌和酵母菌总数时，应进行培养基适用性检查，检查方法同沙氏葡萄糖琼脂培养基1.1菌种试验用菌株的传代次数不得超过5代（从菌种保藏中心获得的干燥菌种为第0代），并采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。
1.2菌液制备（按表1规定程序培养各试验菌株）取白色念珠菌的新鲜培养物↓用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的菌悬液取黑曲霉的新鲜培养物↓加入3～5ml含0.05％聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱↓采用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管内↓用含0.05％聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的黑曲霉孢子悬液菌液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用；若保存在2～8℃，可在24小时内使用。
稳定的黑曲霉孢子悬液可保存在2～8℃，在验证过的贮存期内使用。
1.3阴性对照为确认试验条件是否符合要求，应进行阴性对照试验，阴性对照试验应无菌生长。
如阴性对照有菌生长，应进行偏差调查。
2.培养基适用性检查按表1规定，接种不大于100cfu的菌液至沙氏葡萄糖琼脂培养基平板↓置表1规定条件下培养↓每一试验菌株平行制备2管或2个平皿↓同时，用相应的对照培养基替代被检培养基进行上述试验↓被检固体培养基上的菌落平均数与对照培养基上的菌落平均数的比值应在0.5-2范围内，且菌落形态大小应与对照培养基上的菌落一致；被检液体培养基管与对照培养基管比较，试验菌应生长良好3计数方法适用性试验供试液制备：水不溶性非油脂类供试品↓取供试品，用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，或pH7.2磷酸盐缓冲液，或胰酪大豆胨液体培养基↓制备成1:10供试液。
AOAC 官方方法 997.02 食品中酵母菌和霉菌的计数 再水化干膜法
17.2.09AOAC官方方法 997.02食品中酵母菌和霉菌的计数再水化干膜法（Petrifilm TM法）首次发布 1997最终发布 2000（适用于食品中酵母菌和霉菌总数的计数）表格997.02A和B为验证并采纳此方法的多个实验室的研究结果。
A. 原理本方法使用的测试片含有抗生素和指示剂以增强对菌落生长的指示作用，还含有冷水可溶性凝胶。
在每张测试片上添加1ml的未经稀释或稀释过的样品均液。
将样品均液分布在大约为30cm2的生长区域中。
将胶凝剂固化，将测试片进行培养，并计算酵母菌和霉菌的数量。
B. 仪器和试剂（a）酵母菌和霉菌测试片—培养基中添加了：氯四环素、氯霉素、冷水可溶性凝胶和对磷酸盐（5-溴-4-氯-3吲哚基-磷酸盐）敏感的指示剂，该指示剂用于增强对酵母菌和霉菌的生长的指示作用。
一个测试片的圆形生长区域中包含了30个在测试片上的1cm×1cm的方格（可以使用3M TM Petrifilm TM酵母菌和霉菌测试片，3M Microbiology Products，3M Center, bldg. 275-5W-05, St. Paul, MN 55144-1000, USA）。
(b) 塑料压板－与Petrifilm测试片一起提供，用于将样品均液均匀地扩散在测试片上的生长区域。
(c) 移液管－能精确移取1.0ml的移液管或者注射器。
(d) 菌落计数器－标准设备，最好是Quebec型，或者是能够提供同等放大率（×1.5）和可见度的设备。
(e) 搅拌器－转速为10000－12000rpm的机械搅拌器或者stomacher拍击式均质器。
(f) 稀释液－Butterfield磷酸盐缓冲稀释用水。
将34g KH2PO4加入1L容量瓶中，并用500ml水稀释。
用1M 的NaOH溶液(40g/L)调整pH值至7.2，并用水稀释至1L。
在121℃下高压灭菌处理15分钟。
将原液储存于冰箱之中。
菌落总数、霉菌和酵母菌测试
菌落总数、霉菌和酵母菌测试1目的规范对菌落总数、霉菌和酵母菌测试的操作。
2适用范围本制度适用于产品、半成品、原料、车间空气等。
3职责对产品内容物，原料，生产设备表面，生产车间空气，包材内壁或其他部门需要协助测试的产品进行菌落总数的测定。
4实验内容4.1仪器设备和试剂:4.1.1 手提式蒸汽灭菌锅。
4.1.2 50ml三角瓶。
250ml三角瓶4.1.3 试管15*150mm。
4.1.4 2ml玻璃移液管。
4.1.5 直径9cm培养平皿。
4.1.6 酒精灯。
4.1.7 恒温培养箱36?1?。
4.1.8 恒温培养箱28?2?。
4.1.8 TTC试剂分析纯试剂。
4.1.8 虎红琼脂。
4.1.9 卵磷脂吐温80琼脂。
4.1.10氯化钠分析纯试剂。
4.1.11蒸馏水。
4.2准备过程4.2.1 于50ml三角瓶配置质量分数为0.5%TTC溶液10ml，加上透气橡胶塞，利用医用纱布包裹三角瓶口，并用棉绳绑紧，灭菌后无菌操作台上存放备用，存放时间不超过3天。
4.2.2 于250ml三角瓶配置质量分数5.1%的卵磷脂吐温80琼脂溶液若干，加上透气橡胶塞密封，利用医用纱布包裹三角瓶口，并用棉绳绑。
4.2.3于250ml的三角瓶配置质量分数3.16%的虎红琼脂溶液若干，加上透气橡胶塞密封，利用医用纱布包裹三角瓶口，并用棉绳绑紧。
4.2.4于50ml三角瓶配置质量分数为8.5%的氯化钠溶液，配置成45ml的生理盐水，加上透气橡胶塞，利用医用纱布包裹三角瓶口，并用棉绳绑紧。
4.2.5利用牛皮纸或报纸密封包扎培养平板，10个为一卷。
4.2.6利用牛皮纸或报纸密封包扎2ml和10ml玻璃移液管，用棉绳捆绑结实。
4.2.7利用牛皮纸或报纸密封包扎若干不锈钢勺子，用棉绳捆绑结实。
4.2.8 所有需要的试液和器具(即4.2.1-4.2.7)放进手提式灭菌锅，插上电源并打开排气阀，待排气阀有明显响声后将其关闭，然后等待压力表到达103.43kpa开始计时，20min后断开电源，打开排气阀至压力恢复常压，然后打开灭菌锅，双手戴上橡胶手套，用体积分数为75%的酒精对手套灭菌，取出一篮筐，同样方法灭菌，然后利用表面灭菌的篮筐把所有器具放进微检室的无菌操作台，打开紫光灯(最少1小时以后才能关闭),打开无菌送风直至检验人员进入操作，营养琼脂和虎红琼脂溶液放置于微检室内的超级恒温水浴锅中，设置恒温温度为48?1?。
菌落总数、霉菌和酵母菌总数等微生物检验方法
菌落总数、霉菌和酵母菌总数等微生物检验方法下载提示：该文档是本店铺精心编制而成的，希望大家下载后，能够帮助大家解决实际问题。
文档下载后可定制修改，请根据实际需要进行调整和使用，谢谢!本店铺为大家提供各种类型的实用资料，如教育随笔、日记赏析、句子摘抄、古诗大全、经典美文、话题作文、工作总结、词语解析、文案摘录、其他资料等等，想了解不同资料格式和写法，敬请关注!Download tips: This document is carefully compiled by this editor. I hope that after you download it, it can help you solve practical problems. The document can be customized and modified after downloading, please adjust and use it according to actual needs, thank you! In addition, this shop provides you with various types of practical materials, such as educational essays, diary appreciation, sentence excerpts, ancient poems, classic articles, topic composition, work summary, word parsing, copy excerpts, other materials and so on, want to know different data formats and writing methods, please pay attention!一、引言微生物检验是食品行业中非常重要的环节，能够确保食品产品的质量和安全性。
霉菌和酵母计数 GB
2、球菌：平皿底为粉红色，菌落较小，圆形，红色， 边缘整齐，可有淡淡的晕
培养后，所得1ml(g)检样中所含乳酸 菌菌落的总数。
乳酸菌菌落总数的测定
检验操作步骤
1、 以无菌操作将经过充分摇匀的检样25mL(或25g)放入含有225mL灭菌生理盐水的灭菌广口瓶内作成 1∶10的均匀稀释液。
2、 用1mL灭菌吸管吸取1∶10稀释液1mL，沿管壁徐徐注入含有9mL灭菌生理盐水的试管内(注意吸管尖端 不要触及管内稀释液)。
5．菌落计数及报告：选取菌落数10~150之间的平板 进行计数。一个稀释度使用两个平板，取两个平板菌 落数的平均值，乘以稀释倍数报告。固体检样以g为单 位报告，液体检样以mL 单位报告。关于稀释倍数的选 择可参考细菌菌落总数测定。
霉菌和酵母菌及其检验
6．霉菌直接镜检计数法：对霉菌计数，可以采用直接镜检的方 法进行计数。
定的微生物检验方法，在所检食品中无活的微 生物检出，或者只能检出极少数的非病原微生 物，但他们在食品的保藏过程中不可能生长繁 殖，这种从商品角度对某些食品提出的灭菌要 求，称为商业无菌
霉菌与酵母菌计数方法(2015版药典)
霉菌与酵母菌计数方法1试验菌液得制备与使用(以白色念珠菌为示例)白色念珠菌(0)代↓传代培养↓实验菌液得制备:沙氏葡萄糖琼脂培养基或沙氏葡萄糖液体培养基,培养温度20～２5℃,培养时间2~3天↓计数培养基适用性检查:胰酪大豆胨琼脂培养基,培养温度３0～3５℃,培养时间不超过5天,接种量不大于10０cｆu↓计数方法适用性试验:胰酪大豆胨琼脂培养基(ＭPＮ法不适用),培养温度３０～３5℃,培养时间不超过５天,接种量不大于10０cfu 注:当需用玫瑰红钠琼脂培养基测定霉菌与酵母菌总数时,应进行培养基适用性检查,检查方法同沙氏葡萄糖琼脂培养基1.１菌种试验用菌株得传代次数不得超过５代(从菌种保藏中心获得得干燥菌种为第0代),并采用适宜得菌种保藏技术进行保存,以保证试验菌株得生物学特性。
1。
2菌液制备(按表1规定程序培养各试验菌株)取白色念珠菌得新鲜培养物↓用pH7、0无菌氯化钠—蛋白胨缓冲液或0、9％无菌氯化钠溶液制成适宜浓度得菌悬液取黑曲霉得新鲜培养物↓加入3～５ｍｌ含0.０５%聚山梨酯80得pH7.0无菌氯化钠—蛋白胨缓冲液或0、9％无菌氯化钠溶液,将孢子洗脱↓采用适宜得方法吸出孢子悬液至无菌试管内↓用含0。
05％聚山梨酯80得pＨ7.０无菌氯化钠—蛋白胨缓冲液或0。
９%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度得黑曲霉孢子悬液菌液制备后若在室温下放置,应在2小时内使用;若保存在２~8℃,可在24小时内使用、稳定得黑曲霉孢子悬液可保存在2~８℃,在验证过得贮存期内使用、1。
３阴性对照为确认试验条件就是否符合要求,应进行阴性对照试验,阴性对照试验应无菌生长。
如阴性对照有菌生长,应进行偏差调查、2、培养基适用性检查按表1规定,接种不大于100cｆu得菌液至沙氏葡萄糖琼脂培养基平板↓置表１规定条件下培养↓每一试验菌株平行制备2管或2个平皿↓同时,用相应得对照培养基替代被检培养基进行上述试验↓被检固体培养基上得菌落平均数与对照培养基上得菌落平均数得比值应在0。
AOAC 官方方法 997.02 食品中酵母菌和霉菌的计数 再水化干膜法
17.2.09AOAC官方方法 997.02食品中酵母菌和霉菌的计数再水化干膜法（Petrifilm TM法）首次发布 1997最终发布 2000（适用于食品中酵母菌和霉菌总数的计数）表格997.02A和B为验证并采纳此方法的多个实验室的研究结果。
A. 原理本方法使用的测试片含有抗生素和指示剂以增强对菌落生长的指示作用，还含有冷水可溶性凝胶。
在每张测试片上添加1ml的未经稀释或稀释过的样品均液。
将样品均液分布在大约为30cm2的生长区域中。
将胶凝剂固化，将测试片进行培养，并计算酵母菌和霉菌的数量。
B. 仪器和试剂（a）酵母菌和霉菌测试片—培养基中添加了：氯四环素、氯霉素、冷水可溶性凝胶和对磷酸盐（5-溴-4-氯-3吲哚基-磷酸盐）敏感的指示剂，该指示剂用于增强对酵母菌和霉菌的生长的指示作用。
一个测试片的圆形生长区域中包含了30个在测试片上的1cm×1cm的方格（可以使用3M TM Petrifilm TM酵母菌和霉菌测试片，3M Microbiology Products，3M Center, bldg. 275-5W-05, St. Paul, MN 55144-1000, USA）。
(b) 塑料压板－与Petrifilm测试片一起提供，用于将样品均液均匀地扩散在测试片上的生长区域。
(c) 移液管－能精确移取1.0ml的移液管或者注射器。
(d) 菌落计数器－标准设备，最好是Quebec型，或者是能够提供同等放大率（×1.5）和可见度的设备。
(e) 搅拌器－转速为10000－12000rpm的机械搅拌器或者stomacher拍击式均质器。
(f) 稀释液－Butterfield磷酸盐缓冲稀释用水。
将34g KH2PO4加入1L容量瓶中，并用500ml水稀释。
用1M 的NaOH溶液(40g/L)调整pH值至7.2，并用水稀释至1L。
在121℃下高压灭菌处理15分钟。
将原液储存于冰箱之中。
微生物测试片操作使用方法步骤(详细图解)
微生物检测片由轻便防水纸质材料做支撑，其上覆盖干燥培养基层（营养物质、凝固剂、选择抑制剂、显色剂）和透明隔水膜，经辐照灭菌；培养基层可吸收1mL 样液形成凝胶层，微生物生长代谢产生酶水解显色剂从而使菌落显色。
微生物检测片一般包含卫生指示菌和致病菌检测片，可广泛用于食品、饮料等微生物检测，涵盖生产原料、终产品和生产环境中卫生指示菌（菌落总数、霉菌酵母、大肠菌群计数）和致病菌（沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、李斯特氏菌等）检测。
1. 掀开透明薄膜，加入 1mL 样液接种在接种区中央，盖上薄膜。
2. 培养（根据相应条件行培养）3. 判读（肉眼直接计算典型特征菌落，也可借助放大镜或菌落计数器等）【定性划线法】与【定量计数法】操作图解（以金黄色葡萄球菌测试片为例）：定性划线法定量计数法1；用剪刀沿虚线剪开，取出测试片盒。
1；用剪刀沿虚线剪开，取出测试片盒。
2；将测试片放在水平台面上，揭开覆膜，用 1μl 接种环取增菌液在纸片上划线分离。
2；将测试片放在水平台面上，揭开覆膜，将 1mL 样品液滴加在纸片中心。
3；加入 1mL 无菌水或无菌生理盐水。
3；缓慢盖上覆膜，静置 3-5 分钟。
4；盖上上膜，静置3-5min。
4；将测试片正面朝上，放置于恒温培养箱中，36±1℃培养 18～24h。
测试片堆叠不应超过 20 张。
5；将测试片正面朝上，放置于恒温培养箱中，36±1℃培养 18～24h，测试片堆叠不得超过 20 张。
5；根据判读手册判读测试片上是否有目标菌生长，或对菌落进行计数。
6；培养后的判读，根据判读手册判读测试片上是否有目标菌的生长。
霉菌和酵母计数的操作流程
霉菌和酵母计数的操作流程英文回答：Counting mold and yeast involves a specific procedure to ensure accurate results. Here is the step-by-step process:1. Sample collection: First, I need to collect a sample of the substance or material that I want to test for mold and yeast. This could be anything from food products to environmental samples like air or surfaces.2. Preparation of the sample: Next, I need to prepare the sample for analysis. This typically involves homogenizing or grinding the sample to ensure an even distribution of mold and yeast throughout the sample.3. Dilution: Depending on the expected concentration of mold and yeast in the sample, I may need to dilute it to obtain a countable number of colonies. This step is crucialto avoid overcrowding on the agar plates.4. Plating: Once the sample is prepared, I can now plate it onto appropriate agar plates. For mold, I would use Sabouraud dextrose agar (SDA) or malt extract agar (MEA), while for yeast, I would use yeast extract peptone dextrose agar (YPD). I would streak the sample onto the agar plates using a sterile loop or spreader.5. Incubation: After plating, the agar plates need to be incubated at the optimal temperature for mold and yeast growth. Mold typically grows best at room temperature (around 25-30°C), while yeast prefers slightly warmer temperatures (around 30-37°C). I would incubate the plates for a specific period, usually 3-5 days.6. Colony counting: Once the incubation period is over,I can start counting the colonies. Mold colonies appear as fuzzy, filamentous structures, while yeast colonies are smooth and creamy in appearance. I would use a colony counter or a magnifying glass to aid in counting.7. Data analysis: Finally, I would record the number of mold and yeast colonies on each plate and calculate the average count. This data can be used to determine the level of contamination or assess the effectiveness of control measures.中文回答：计数霉菌和酵母需要遵循特定的操作流程，以确保结果准确无误。
图解GB 4789.15霉菌和酵母计数
GB 4789.15－2016霉菌和酵母计数野兽食品伙伴网应用概况1标准修订2标准详解3质控要求4CONTENTSPART 1霉菌和酵母概况Overview of mould and yeastNational Food Safety Standard Food Microbiological Examination病毒原核生物原生生物真菌植物动物生物六界分类法真菌（菌物）已发现七万多种大型真菌是各类蕈类，小型真菌包括霉菌和酵母。
与动物、植物主要的区别是，真菌有细胞壁，主要成分为甲壳素（几丁质）。
相对于低等的细菌来说，霉菌和酵母生长缓慢，竞争力较弱，故只能在不利于细菌的环境中形成优势。
霉菌和酵母基本特性少数对人类有益，绝大多数不造成直接危害，但可导致食品的腐败变质，极少数能够致病或产生真菌毒素，危害极大。
细胞较大，代谢能力比细菌强100倍以上，故标准限量更严格。
危害生长水活度细菌0.90酵母0.87霉菌0.70卫生学意义霉菌和酵母计数主要用于判定样品被真菌污染程度，也可用于监测样品中真菌的性质和繁殖动态，进行样品的卫生学综合评价。
Mould and YeastPART 2检验方法标准修订Revision of Inspection Method Standard National Food Safety Standard Food Microbiological ExaminationGB 4789.15－84卫生部食品卫生监督检验所归口并负责起草。
主要起草人：罗雪云GB/T 4789.15－2003起草单位：中国疾病预防控制中心营养与食品安全所。
主要起草人：罗雪云、李风琴、李玉伟GB 4789.15－94卫生部食品卫生监督检验所归口并负责起草。
主要起草人：罗雪云GB 4789.15－2010未公布检验方法标准制修订GB 4789.15－2016起草单位：国家食品安全风险评估中心。
主要起草人：李凤琴、韩小敏、江涛、赵熙等参考国内外标准情况GB 4789.15－2010主要的技术性变化，就是培养温度从25℃～27℃修改为28℃。
霉菌、酵母菌及空气检测资料
（3）肉膏蛋白胨平板于37℃，倒置培养1天；查氏琼脂平板 和高氏一号琼脂平板倒置于28℃培养分别培养24~48h各自计 算其菌落数，观察菌落形态、颜色。
X X
X
X X
测m3空气中微生物的数量。
面积为100cm2的平板培养基，暴露在空气中 5分钟相当于10升空气中的细菌数。
过滤层流通风 过滤器中的过滤介质多为醋酸纤维，空气 穿过滤过层，能除去小到0.3μm的粒子，过滤后的空气沿平 行线以均匀速度流动，根据需要可设计成垂直式或水平式层 流，可用于微生物操作的超净工作台、洁净病房和手术室。
除菌效果： 自然对流通风为17.4 % ，
湍流通风为 46.9 % ， 过滤层流通风为96.7 % 。
三、检验程序
检样 →处理 →稀释 →平板分离培养 →菌落计数 →报告 四、操作步骤 1、 样品的采集 用灭菌工具采集可疑霉变食品 250 g，装入灭菌容器内送检。
粮食（包括粮库贮粮，粮店或家庭小量存粮）样品的采集， 可根据粮囤或粮垛的大小和类型，分层定点取样，一般可分 三层五点，或分层随机采取不同点的样品，充分混合后，取 500 g 左右送检。小量存粮可使用金属小勺采取上、中、下 各部位的混合样品。
（3） 称重取样以 CFU/g 为单位报告，体积取样以 CFU/mL 为单位报告，报告或分别报告霉菌和/或酵母数。
方法二、霉菌直接镜检计数法
食品冷链品控专业《81. 霉菌和酵母的测试片检测方法》
霉菌和酵母的测试片检测方法1 适用范围：本品可用于各类食品及饮用水中霉菌和酵母菌的计数。
2 方法原理：将霉菌营养培养基、吸水凝胶和酶显色剂加载在纸片上，通过培养，在酶显色剂的放大作用下，使霉菌和酵母菌在纸片上显现出出来，通过计数报告结果。
3 方法特点：与传统方法相比，省去了配制培养基、消毒和培养器皿的清洗处理等大量辅助性工作，即开即用，操作简便。
培养时间由一周缩短为48h～72h。
4操作方法样品处理：无菌称取样品25g〔或 25mL〕放入含有225mL无菌生理盐水的采样瓶或均质杯内，经充分振摇做成1:10的稀释液，用1mL灭菌吸管吸取1:10稀释液1mL，注入含有9mL灭菌水的试管内，用1mL 灭菌吸管反复吸吹50次做成1:100的稀释液，以此类推，每个稀释度更换一支灭菌吸管。
接种：一般食品选2～3个稀释度进行检测，含菌量少的液体样品〔如食用纯水和矿泉水等〕可直接用原液检测。
将检验纸片水平放台面上，揭开上面的透明薄膜，用灭菌吸管吸取样品原液或稀释液1mL，均匀加到中央的滤纸片上，然后轻轻将上盖膜放下，静置5min，每个稀释度接种两片。
用手指先沿方格区边缘刮一下，防止水外流，然后再在中间轻轻推刮，使水分在纸片方格区内均匀分布，并将气泡赶走。
培养：将加了样的检验纸片每12片叠放在一起，放入自封袋中，平放在28℃培养箱内培养48h开始观察计数。
结果判断与计数：霉菌和酵母菌在纸片上生长后会显示蓝色斑点，霉菌菌落显示的斑点略大或有点扩散，酵母菌落那么较小而圆滑，许多霉菌在培养后期全呈现其本身特有的颜色。
选择菌落数适中〔10～50个〕的纸片进行计数，乘以稀释倍数后即为每克〔或毫升〕样品中霉菌和酵母菌的数目。
5 计数原那么及报告方式：通常选择菌落在10～50 个之间的纸片进行计数，乘以稀释倍数报告之。
具体计数原那么可参照细菌〔菌落〕总数的测定方法进行。
6 附加说明：由于霉菌常以孢子的形式于空气中到处传播，而多种样品是要求霉菌酵母菌不得捡出，因此检测霉菌时需特别小心操作，取样用品、稀释用水和吸管吸头等都需仔细消毒，接种时尽量防止空气流动，动作要干净利落，每次最好用灭菌生理盐水接一片空白对照，以免出现假阳性结果。
霉菌酵母测试片使用说明书
1霉菌酵母测试片使用说明书【产品名称】通用名称：霉菌酵母测试片英文名称：Handy plate ®Mold&Yeast Count Plate 【产品编号】HP 003【包装规格】20片/包【产品简介】Handy plate ®霉菌酵母测试片为预制备的即用型培养基产品，含有标准的培养基、冷水凝胶和显色指示剂。
本产品可用于食品和饮料中霉菌酵母的测定。
【使用说明】1.样品制备取样品25g(mL)放入含有225mL 磷酸缓冲液（或生理盐水）的无菌均质杯或均质袋内，均质器混匀1min ～2min 制成1:10的样品匀液，必要时用无菌1mol/L NaOH 或1mol/L HCl 溶液调节样品匀液pH 至6.8～7.2。
用1mL 无菌吸管或移液器吸取1:10均液1mL ，注入含有9mL 稀释液的试管内，振摇后成为1:100的样品匀液，以此类推制备10倍系列稀释的样品匀液，每次换一支吸管。
2.接种根据对样品污染状况的估计，选择2～3个稀释度进行检测。
将霉菌酵母检测片置于平坦实验台面，揭开上层膜，用无菌吸管吸取1mL 样品匀液滴加到检测片中央，缓缓盖上上层膜，避免产生气泡。
静置3～5min 使样液扩散并重新形成凝胶。
3.培养将检测片正面向上水平放置28℃±1℃，培养48h ～72h 。
4.判读计数所有蓝绿色菌落不论大小和清晰度。
合适的计数范围在15CFU ～1502CFU 。
淡蓝绿色凸起小菌落为酵母，蓝绿色扁平较大菌落为霉菌。
若整个培养区域呈淡蓝绿色，可能是菌浓度过高，需对样品进一步稀释以获得确切的计数。
如需分离菌落进行进一步分析，揭开上层膜用接种针将菌落挑出使用即可。
【操作图解】1.用剪刀沿虚线剪开，2.将测试片放在水平台面上，3.缓慢盖上覆膜，取出测试片盒揭开覆膜，将1mL 样品液静置3-5分钟。
滴加在纸片中心。
4.将测试片正面朝上，放置于5.根据判读手册判读测试片恒温培养箱中，36±1℃培上是否有目标菌生长，或养24±2h。
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心
菌落扁平
通常菌落中心颜色深暗
3
PDF 文件使用 "pdfFactory" 试用版本创建
Years and mold count=0
Yeast count=12
图 3 所示在 PYM 测试片上没有霉菌和 Mold count=4
酵母菌菌落.
图 4 所示在 PYM 测试片上有少数量的
图 7 所示,在测试片上霉菌菌落出现 图 8a 和图 8b 为同一样品的测试结果.
堆挤和彼此覆盖,为了方便计数,可将 图 8a 为 1:10 样品稀释液,菌落小、虚
测试片分成几个区域,计算每个有明 弱暗淡、数量多、计数困难。图 8b
显暗色中心的菌落.所划的方形区内 为 1：100 样品稀释液，生长菌落数
霉菌和酵母菌检验测试片 一、操作方法
Petrifilm and Mold count MoldTM 测试片为预先制备好的培养基系统,它含有 一种冷水可溶性的凝胶剂，营养基和一种指示染剂，可提供对比，利于菌落 计数。
[贮藏]
1、未开封时，冷藏于≤8 2、已开封的，将封口以 3、保存再封的袋于≤25
℃（≤46℉），并在保存期 胶带封紧。
积上，切勿扭转压板。
[培养]
[解释]
13、测试片的透明面朝上，14、可目视及用标准菌落
可堆叠至 20 片，于
计数器或其它的照明放大
21-25℃（70-77℉）培养 镜计数，并可参考判读卡
3-5 天。
计算菌落数。
大的或快速生长的霉菌在
培养 5 天后会呈现含混模
糊的菌落，应在培养 3 天
2
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霉菌和酵母菌菌落.
Estimated yeast count=480
Yeast count=TNTC (实际菌数>104)
Mold count=21
图 6 所示在 PYM 测试片边缘框里光
圆形的生长区大约为 30cm2,当菌落 亮区的的小型.兰色菌落同样也分布
数超过 150 个为估计菌落数,可选择 在整个测试片中(尽管有较小的可见
减少样品本身的磷酸酶所造成的颜色反应可采用下列技术：
1. 静置沉淀—混合样品，静置 3-5 分钟，吸取样品容器内上层部分，可避免测 试中有大的颗粒。
2. 检查和注意—磷酸酶的颜色反应在培养 24 小时内发生，所以要在 24 小时前 记下和标注看到的任何颜色变化，有助于最后结果的判读。
3. 稀释样品—可能的话，需进一步稀释样品，可消除兰色背景底色或可减少针 尖状兰点数目。
5
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[接种]
不可使用含有枸橼酸 盐、酸性亚硫酸盐或硫 代硫酸盐的缓冲液，因 为它们能抑止菌生长。
7、将测试片置于平坦表面 8、使用吸管将 1ml 样液垂 9、允许使上层膜直接落
处，揭开上层膜。
直滴加在测试片的中央 下,切勿向下滚动上层膜.
处。
10、手拿压板横膜,将压板 11、平稳的压下，使样液 12、拿起压板，静置至少 1 放置在上层膜中央处. 均匀覆盖于圆形的培养面 分钟以使培养基凝固。
其中一个或几个有代表性菌落的小 度),这是胶木菌菌落太多无法计数
方格(1cm2 ),计算平均菌落数在乘以 (TNTC)现象.
30,可得到整个测试片上的估计菌落
数.
4
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Mold count=59
Mold count=TNTC
质袋、稀释瓶、WhirlPak KH2PO4 调 PH7.2) 、
bag 或者其他灭 菌容器 0.1%的旦白胶水(ISO 方
内。
法 6887) 、缓冲旦白胶水
(ISO 方法 6579) 、盐溶
液 (0.85-0.90%) 、
bisulfite-free letheen broth
或蒸馏水。
1
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Yeasr count=44
Mold count=27
图 1 为酵母菌菌落特征：
图 2 为酶菌菌落特征：
小型菌落
小型菌落
菌落有明显的边缘
大型菌落
菌落为灰白色到兰绿色,也可呈
菌落有扩散的边缘
粉色
菌落有不同的颜色(以霉菌产生
菌落有隆起
不同色素而定)如棕色.米色.橙色.和
菌落颜色均匀一致,没有暗色中 兰绿色等.
℃ （ ≤77 ℉ ） 和 温 度 <50
内用完，高温度时，凝固
％，不要冷藏已开启的包
水可以排除，包装物最好
装袋，并于一个月内使用
于室温启开。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
完。
[样品制备]
4、制备 1：10 和更大稀 5、加入适量的无菌稀释 6、搅拌或均质样品.
释的食物样品稀释液，称 液,包括 Buffered peptone 样品不需要调 PH，但已 取或吸取食物样品，置入 Buffer(IDF phopsphate 调解 PH 的样品也能够 适宜的无菌容器内，如均 buffer , 用 0.0425g/L 的 使用。
有 15 个霉菌菌落。
在适宜范围（15-150 个）内，很容易
计数。
磷酸酶反应
Yesat and Mold Count=0
yesat and Mold Count=0
PYM 测试片中的磷酸酶指示剂，可与含有磷酸酶的一些生鲜类和加工食品 发生颜色反应，有时能见到两种类型的颜色反应：一种为很均匀兰色背景 底色见图或很强烈的（明显的），针尖状兰点（见图 10 的圆圈），通常见於 含有香料或颗粒状产品。
后记录高数量计数结果。 如果培养 5 天后，测试片 上菌落丛生过快的生长， 则以 3 天计数结果作为估 计菌落数。 培养时间和温度因方法 而有不同，最通用的认可 方法是： AOAC 官方方法 997.02 （食品类） 21-25℃培养 5 天。
二、判读手册 Petrifilm and Mold count MoldTM 测试片为预先制备好的培养基系统,它含 有一种冷水可溶性的凝胶剂，营养基和一种指示染剂，可提供对比，利于菌 落计数。