第六章热原的去除及验证

热原的去除及验证

热原(Pyrogens)是微生的代谢产物。大多数细菌都能产生，致热能力最强的是革兰氏阴性杆菌所产生的热原。霉菌甚至病毒也能产生热原。

含有热原的输液注入人体，大约半小时以后，就使人体发冷、寒战、体温升高、身痛、出汗、恶心呕吐等不良反应，有时体温可升至40℃，严重者出现昏迷、虚脱，甚至有生命危险。

热原反应的温度变化曲线，因热原种类不同而有差异。一般先经过一个短的潜伏期后，温度略微上升，然后又略微下降，接着又很快上升，并出现一个高峰，根据这种现象而导致一个假设：即细菌性热原本身不引起发热反应。但热原使多型核白细胞(polymorphonucler leucocyte)及其他细胞释放一种内源性热原(endogenous pyrogen)，虽然有人提出内源性热原可能是蛋白质或脂蛋白(lipoprotein)组成，但其确切组成尚未肯完，它作用于视丘下部体温调节中枢，可能引起5-羟色胺的升高而导致发热[1]，热原的致热量因菌种而异，由于注射途径不同，引起发热反应的程度也有差异。

1.热原的组成

热原是微生物的一种内毒素，它存在于细菌的细胞膜和固体膜之间。内毒素是由磷脂、脂多糖和蛋白质所组成的复合物，其中脂多糖(lipopolysaccharide)是内毒素的主要成分，具有特别强的热原活性，因而大致可以认为内毒素=热原=脂多糖。脂多糖的化学组成因菌种不同而异，从大肠杆菌分出来的脂多糖中有68%～69%的糖(葡萄糖、半乳糖、庚糖、氨基葡萄糖、鼠李糖等)，12～13%的类脂化合物，7%的有机磷和其它一些成分。热原的分子量一般为10 105 左右。

热原的结构

2.热原的性质(1)耐热性

一般说来，热原在60℃加热1小时不受影响，100℃也不会发生热解，在180℃3～4小时，250℃30～45分钟或650℃1分钟可使热原彻底破坏。虽然已经发现某些热原具有热不稳定性，但在通常注射剂灭菌的条件下，往往不足以使热原破坏，这点必须引起注意；

(2)滤过性

热原体积小，约在1～5nm之间，故一般滤器均可通过。即使微孔滤膜，也不能截留。但活性炭可以吸附热原；

(3)水溶性

热原能溶于水；

(4)不挥发性

热原本身不挥发，但在蒸馏时，往往可随水蒸汽雾滴带入蒸馏水，故应设法防止；

(5)吸附性

热原对许多分子有亲和性，优其是蛋白质类，因此较难去除。

(5)其它

热原能耐受酸碱和化学试剂的处理，但热原能被强酸、强碱破坏，也能被强氧化剂如高锰酸钾或过氧化氢所钝化，超声波也能破坏热原。热原对干涸的耐受性较强。

3.污染热原的途径(1)从溶剂中带入

这是注射剂出现热原的主要原因。蒸馏器结构不合理，操作不当，注射用水贮藏时间过长都会污染热原。故应使用新鲜注射用水，最好随蒸随用；

(2)从原料中带入

容易滋长微生物的药物，如葡萄糖因贮存年久包装损坏常致污染热原。用生物方法制造的药品如右旋糖酐、水解蛋白或抗生素等常因致热物质未除尽而引起发热反应；

(3)从容器、用具、管道和装置等带入

因此在生产中对这些容器用具等物要认真处理，合格后方能使用；

(4) 制备过程中的污染

制备过程中，由于室内卫生条件差，操作时间长，装置不密闭，均增加污染细菌的机会，而可能产生热原；

(5)从输液器带入

有时输液本身不含热原，但仍发现热原反应。这往往是由于输液器具(如输液吊瓶、胶皮管等)污染所致。

4. 热原的除去方法

除热原的定义是除去所有使病人体温升高的物质。制药生产中指除去内毒素。除热原的方法主要有物理去除，钝化。

物理去除法包括反渗透法、蒸馏法、超滤法、活性炭吸附法、疏水性吸附法、静电修饰过滤法、吸附色谱法、用粘合剂或色谱柱提取、漂洗。

（1）蒸馏法

水系统中使用的最古老的方法。机理简单，包括水的双相转变，沸点使液体变为蒸气，蒸气挥发，分子量大的热原被留下，设计良好的隔析使气体凝固，重力使其下降，使热原的分子量加大。通常需要 >80oC再循环温度。

（2）超滤法

超滤的原理通常认为是分子筛，其有效性与筛的大小有关。LPS 的分子量约为 10,000 -20,000道尔顿，因此可以被10,000道尔顿的超滤膜除去。实际上热原聚合物的分了量约100,000道尔顿,所以0.1 um的滤膜通常能有效的除去热原。（3）活性炭吸附法

古老的方法之一，很早就有文献记载。活性炭对热原有较强的吸附作用，同时有助滤脱色作用，所以在注射剂中使用较广。常用量为0.1%～0.5%。此外还可用活性炭与白陶土合用除去热原。活性炭适用的pH范围较宽，不受电解质浓度影响。这种方法在制剂应用较广，如生理盐水，葡萄糖和抗生素等的除热原。缺点是对某些活性成份有吸附。

（4）疏水吸附法

很多的脂肪族聚合物对热原有吸附性，聚丙烯，聚乙烯，聚偏二乙烯，聚四氟乙烯。这些聚合物的非极性基团使滤膜有疏水性。膜和脂多糖A之间的疏水吸附是溶液中的热原被吸附的原因。

（5）静电修饰过滤

这种滤膜利用两种作用方式：pH >2.0时原热带负电其行为像阴离子，因此滤膜中使用阳离子吸附热原。也利用滤膜中纤维分支与热原的碰撞、沉积、筛分来捕获热原。这些滤膜通常较厚，也有一些仅带正电的滤膜。

（6）吸附色谱法

这是一个应有较广的方法，吸附剂包括Polymixin B，Substrate AnalogueSepharose，LAL Sepharose，DEAE Sepharose。Sepharose色谱柱可以在很长的时间内保留吸附能力。并能用1% sodium deoxycholate再生。

（7）粘合剂提取法

有很多化学物的特性可用以实验，优其是热原的检查，最近Profos AG使用相技术提取热原。但大多数的这些粘合系统不适合于大规模的应用而只能用于实