转基因动物制备的方法的
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转基因动物的制备方法
主讲人：李金财 小组成员：李道琪 李浩云 李 会娟 李佳宁
•
1 转基因动物的概念
转基因动物就是指用试验的方法将人 们所需要的外源基因导入到动物体内 ,使 这种外源基因与动物本身的染色体整合在 一起 ,这样外源基因就能随着细胞的分裂 而增殖 ,在动物体内得到表达 ,并且能够稳 定遗传给后代的动物。
核移植技术
该技术源于用微细玻璃管对阿米巴原虫进行的核注射 • 1938年，Spemann提出了细胞核的全能性和将分化的细胞核 移植到卵母细胞的设想； • 1952年，Briggs和King将蛙胚胎细胞核注射导卵内，构建的 重组胚胎发育成蝌蚪和蛙； • 1962年，Gurdon证实已分化的细胞核可恢复其全能性； • 1969年，开始哺乳动物的核移植研究；
2. 3 胚胎干细胞介导法
• 干细胞（stem cells）：是细胞谱系分化中最 原始的细胞，能终身自我更新，并具有多分化潜能， 能增殖分化为特定的组织细胞。 • 胚胎干细胞（embryonic stem cells, ES）： 从着床前的哺乳类胚胎中分离的多能干细胞，具有 在体外不分化的增殖能力，经体外长期培养后仍具 有分化成3种胚层的发育潜能。
优点：
保证大片段ＤＮＡ的完整性 。 保证较长外源片段在转基因动物研究中的 整合率提高 。 保证了目的基因上下游的侧翼序列的完整 性，因而可以消除或减弱基因整合后的位 置效应。
ＹＡＣ介导法制备转基因动物具有广阔 的应用前景。
除上述几种常用的转基因方法外，人 们为了适应于一些特殊需要也探索了一些 其他的方法。例如诱变技术(P265)等，这 些方法都不太成熟，其应用也正被人们验 证。
参考文献
[4] 陈锡文 ,管敏强 ,吴步猛.转基因动物技术 的基本方法和应用. 2004:119~123.
优点：
对体细胞进行基因改造后，用于核移植 可以提高转基因的效率，不仅具有“ES细胞 途径”的全部优点，且物种适用面广，无需 经过嵌合体育种就可获得纯合个体，周期短， 效率高。
缺点：
技术上难度大， 成功率极低， 胚胎死亡率高， 非一般实验室可以开展。
2. 6 人工酵母染色体( YAC)法
• 近年来发展起来的新型载体 ,具有克隆 百万碱基对的大片段外源 DNA 的能力 ,可 以保证巨大基因的完整性。 • 主要途径有: ①胚胎干细胞转入 YAC 后体外筛选 ,阳性胚胎干细胞囊胚腔注射; ②YAC原核注射。
2 转基因动物的制备方法
2. 1 显微注射法
• 也称原核显微注射法 ，是发展最早、使用最ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ 广泛的转基因方法之一。 • 利用显微操作技术将外源基因直接注射到试验动 物的受精卵中，注射的外源基因与胚胎基因组融 合，再通过胚胎移植技术将整合有外源基因的受 精卵移植到受体子宫内发育，这样分娩的动物体 内的每一个细胞都含有外源 DNA 片段。
ES细胞技术发展历史
1956年，Whitten培养成功小鼠的受精卵，在体外发育成囊胚； 1958年，McLaren经胚胎移植，体外培养的胚胎产生小鼠个体； 1965年，Brinster建立了胚胎的微滴培养技术； 1968年，Gardner将分离的细胞注入囊胚，获得嵌合鼠; 1970年，Steven分离成功小鼠的胚胎瘤细胞； 1981年， Martin Evans 从正常的小鼠囊胚中分离成功ES细胞；
缺点：
容纳大小有限； 重组逆转录病毒的长末端容易甲基化，影响 外源基因的表达。
2. 5 体细胞核移植转基因法
• 近年来新出现的一种转基因技术。克隆绵羊 “多 莉(Dolly)” 的诞生是转基因动物史上的一个里程 碑。 • 先把外源基因与供体细胞在培养基中培养 ,使外源 基因整合到供体细胞上 ,然后将供体细胞的细胞核 转移到去核的卵母细胞组成重构胚胎 ,再把其移植 到假孕母体 ,待其妊娠、 分娩后便可得到转基因 的克隆动物。
与显微注射法的比较
方式 显微注射法 逆转录病毒法
DNA长度
与时相 移卵部位 整合方式 表达
＜50kb,
单细胞卵 输卵管 随机，多拷贝 受宿主旁侧的DNA影响
＜10-15kb,
4-6细胞卵 子宫 随机，单拷贝 受LTR影响易缺失 有时不可以子代嵌合 体机率高
传代
可以
优点：
受精卵携带外源基因的阳性率高 外源基因多单拷贝整合 操作简单，避免注射法对卵子的损害 宿主范围广 可同时感染大量胚胎，感染率及胚胎存 活率高。
•
转基因动物自产生以来 ,随着研究的不 断深入 ,近些年来得到了迅速的发展。由于 它打破了自然繁殖中的种间隔离 ,使基因能 在种系关系很远的机体间流动 ,实现了动物 种间遗传物质的交换与重组 ,这不仅为遗传 物质的研究提供了新的手段 ,丰富了物种的 基因库 ,而且扩大了生命科学的视野。
•
转基因动物是动物基因工程在医学生物 学研究中的突出成果。 • 近十年来，为分子遗传学、发育生物学、 医学遗传学、肿瘤研究及优良经济动物的 开发研究等多方面做出了很大的贡献。
•
通过一定的方法将外源基因导入到 ES ,外源 基因通过随机插入或者同源重组的方式整合到 ES 基因组中 ,再以显微注射法把这种转基因胚胎干细 胞植入正常发育的囊胚中 ,然后将囊胚移植到受体 动物的子宫内 ,由于胚胎干细胞参与了胚胎生殖系 的发育 ,所以所产生的嵌合体其生殖细胞中一部分 细胞含有目的基因 ,将嵌合体连续与正常动物进行 交配 ,就会得到转基因动物。
参考文献
[1] 耿彩霞,狄冉,储明星.转基因动物的制备方 法及应用评述.中国畜牧兽医,2010,37(6). [2] 韩堃,刘东军.细胞核移植技术的发展及其应 用.中国生物制品学志,2007,20(6):467~470. [3] 王凌云,成功,周欢敏.动物转基因研究中的 技术方法.生物技术通报 2010,12:73~77. .
•
1981年，Illmenser 和Hoppe将小鼠胚胎内细胞团的细胞核 植入去核的受精卵中，克隆出3只小鼠；
•
• •
1986年，Willadsen等用未分化的胚胎细胞克隆出一只核移 植绵羊；
1987年，Robl用胚胎细胞克隆出核移植羊； 1997年，Wilmut用成年绵羊的乳腺上皮细胞为核供体，克 隆出绵羊Dolly。
优点：
外源基因整合情况的可控性高。 可预先在细胞水平检测外源基因的拷贝数、 定位、表达的水平及插入的稳定性。 外源基因导入ES细胞的方法多样，细胞鉴 定及筛选方便。
缺点：
ES细胞系建立及培养困难 维持ES细胞的未分化及多向分化潜能不易 所得个体为嵌合体
2. 4 逆转录病毒感染法
• 逆转录病毒是第一个用于基因转移的病毒载 体。 • 将目的基因整合到逆转录病毒的 RNA 载体 上 ,制成高滴度的病毒颗粒 ,人为感染着床前或着 床后的胚胎 ,RNA 病毒感染宿主细胞后反转录成 相应的DNA ,并在整合酶和其末端特殊核酸序列 的作用下整合到宿主细胞的基因组中进行表达和 遗传得到转基因动物。
2. 2 精子载体介导法
• 将精子反复冷冻或经过化学物质处理后 与外源 DNA 共同孵育 ,从而使外源DNA 与 精子结合 ,然后通过人工授精得到转基因个 体 • 目前国际上极少成功模型，国内也很少 有相关报道，精子载体法很少被应用。
体外受精法 & 胞质内显微注射法
• 体外受精法是一种直接用精子作为外源 DNA 载体的转基因方法 ,其过程是将成熟的 精子与外源 DNA 进行预培养 ,因为在一定 条件下 ,精子核后帽区有自发结合 DNA 的 能力 ,因此 ,精子能够携带外源 DNA进入受 精卵 ,并使之受精 ,从而使外源 DNA 整合到 受体染色体中而得到转基因动物。
Gordon 等人首次成功地将含有HSV 和 SV40DNA 片段的重组质粒DNA 以显微注射法导 入小鼠受精卵的雄原核内，得到了带有这种外源 DNA 顺序的TGM 。 1982 年Palmiter 等运用此法得到的所谓“超 级巨鼠”,曾引起整个生物学界的轰动。
到目前为止，人类已获得转基因鱼、 鼠、羊、猪、兔、牛等大小动物。 从转基因动物所获得的资料几乎涉及医 学遗传学、肿瘤学、免疫学等的基因研 究，还涉及生物药物的研究，基因治疗的 开发研究等。
1984年，Bradley证实注射入囊胚的小鼠ES细胞可分化为 成体的各种组织，并整合入生殖系。 意义：里程碑，与同源重组技术的结合使得在整体水平 定向改变和修饰哺乳动物的遗传特性成为可能。 1995年，Thomson从恒河猴中分离了猴的ES细胞； 1998年，Thomson从人的囊胚中分离成功人的ES细胞； 2000年，Bongso等建立了人的ES细胞株 ……
以使用较多的小鼠为例，这一方法的实 验程序如下：
• ⑴ 准备假孕母鼠（养母）
• ⑵ 受精卵的准备 • ⑶ 基因导入 • ⑷ 胚胎移植 • ⑸ 对幼鼠的鉴定
优点：
外源DNA大小基本不受限制(1-50kb)
导入过程直观
整合率高
缺点：
设备昂贵、环节较多 对操作人员有较高的技术要求 低效率（尤其是大家畜） 对卵子伤害大，胚胎存活率低 基因整合随机性 转基因沉默
主讲人：李金财 小组成员：李道琪 李浩云 李 会娟 李佳宁
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1 转基因动物的概念
转基因动物就是指用试验的方法将人 们所需要的外源基因导入到动物体内 ,使 这种外源基因与动物本身的染色体整合在 一起 ,这样外源基因就能随着细胞的分裂 而增殖 ,在动物体内得到表达 ,并且能够稳 定遗传给后代的动物。
核移植技术
该技术源于用微细玻璃管对阿米巴原虫进行的核注射 • 1938年，Spemann提出了细胞核的全能性和将分化的细胞核 移植到卵母细胞的设想； • 1952年，Briggs和King将蛙胚胎细胞核注射导卵内，构建的 重组胚胎发育成蝌蚪和蛙； • 1962年，Gurdon证实已分化的细胞核可恢复其全能性； • 1969年，开始哺乳动物的核移植研究；
2. 3 胚胎干细胞介导法
• 干细胞（stem cells）：是细胞谱系分化中最 原始的细胞，能终身自我更新，并具有多分化潜能， 能增殖分化为特定的组织细胞。 • 胚胎干细胞（embryonic stem cells, ES）： 从着床前的哺乳类胚胎中分离的多能干细胞，具有 在体外不分化的增殖能力，经体外长期培养后仍具 有分化成3种胚层的发育潜能。
优点：
保证大片段ＤＮＡ的完整性 。 保证较长外源片段在转基因动物研究中的 整合率提高 。 保证了目的基因上下游的侧翼序列的完整 性，因而可以消除或减弱基因整合后的位 置效应。
ＹＡＣ介导法制备转基因动物具有广阔 的应用前景。
除上述几种常用的转基因方法外，人 们为了适应于一些特殊需要也探索了一些 其他的方法。例如诱变技术(P265)等，这 些方法都不太成熟，其应用也正被人们验 证。
参考文献
[4] 陈锡文 ,管敏强 ,吴步猛.转基因动物技术 的基本方法和应用. 2004:119~123.
优点：
对体细胞进行基因改造后，用于核移植 可以提高转基因的效率，不仅具有“ES细胞 途径”的全部优点，且物种适用面广，无需 经过嵌合体育种就可获得纯合个体，周期短， 效率高。
缺点：
技术上难度大， 成功率极低， 胚胎死亡率高， 非一般实验室可以开展。
2. 6 人工酵母染色体( YAC)法
• 近年来发展起来的新型载体 ,具有克隆 百万碱基对的大片段外源 DNA 的能力 ,可 以保证巨大基因的完整性。 • 主要途径有: ①胚胎干细胞转入 YAC 后体外筛选 ,阳性胚胎干细胞囊胚腔注射; ②YAC原核注射。
2 转基因动物的制备方法
2. 1 显微注射法
• 也称原核显微注射法 ，是发展最早、使用最ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ 广泛的转基因方法之一。 • 利用显微操作技术将外源基因直接注射到试验动 物的受精卵中，注射的外源基因与胚胎基因组融 合，再通过胚胎移植技术将整合有外源基因的受 精卵移植到受体子宫内发育，这样分娩的动物体 内的每一个细胞都含有外源 DNA 片段。
ES细胞技术发展历史
1956年，Whitten培养成功小鼠的受精卵，在体外发育成囊胚； 1958年，McLaren经胚胎移植，体外培养的胚胎产生小鼠个体； 1965年，Brinster建立了胚胎的微滴培养技术； 1968年，Gardner将分离的细胞注入囊胚，获得嵌合鼠; 1970年，Steven分离成功小鼠的胚胎瘤细胞； 1981年， Martin Evans 从正常的小鼠囊胚中分离成功ES细胞；
缺点：
容纳大小有限； 重组逆转录病毒的长末端容易甲基化，影响 外源基因的表达。
2. 5 体细胞核移植转基因法
• 近年来新出现的一种转基因技术。克隆绵羊 “多 莉(Dolly)” 的诞生是转基因动物史上的一个里程 碑。 • 先把外源基因与供体细胞在培养基中培养 ,使外源 基因整合到供体细胞上 ,然后将供体细胞的细胞核 转移到去核的卵母细胞组成重构胚胎 ,再把其移植 到假孕母体 ,待其妊娠、 分娩后便可得到转基因 的克隆动物。
与显微注射法的比较
方式 显微注射法 逆转录病毒法
DNA长度
与时相 移卵部位 整合方式 表达
＜50kb,
单细胞卵 输卵管 随机，多拷贝 受宿主旁侧的DNA影响
＜10-15kb,
4-6细胞卵 子宫 随机，单拷贝 受LTR影响易缺失 有时不可以子代嵌合 体机率高
传代
可以
优点：
受精卵携带外源基因的阳性率高 外源基因多单拷贝整合 操作简单，避免注射法对卵子的损害 宿主范围广 可同时感染大量胚胎，感染率及胚胎存 活率高。
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转基因动物自产生以来 ,随着研究的不 断深入 ,近些年来得到了迅速的发展。由于 它打破了自然繁殖中的种间隔离 ,使基因能 在种系关系很远的机体间流动 ,实现了动物 种间遗传物质的交换与重组 ,这不仅为遗传 物质的研究提供了新的手段 ,丰富了物种的 基因库 ,而且扩大了生命科学的视野。
•
转基因动物是动物基因工程在医学生物 学研究中的突出成果。 • 近十年来，为分子遗传学、发育生物学、 医学遗传学、肿瘤研究及优良经济动物的 开发研究等多方面做出了很大的贡献。
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通过一定的方法将外源基因导入到 ES ,外源 基因通过随机插入或者同源重组的方式整合到 ES 基因组中 ,再以显微注射法把这种转基因胚胎干细 胞植入正常发育的囊胚中 ,然后将囊胚移植到受体 动物的子宫内 ,由于胚胎干细胞参与了胚胎生殖系 的发育 ,所以所产生的嵌合体其生殖细胞中一部分 细胞含有目的基因 ,将嵌合体连续与正常动物进行 交配 ,就会得到转基因动物。
参考文献
[1] 耿彩霞,狄冉,储明星.转基因动物的制备方 法及应用评述.中国畜牧兽医,2010,37(6). [2] 韩堃,刘东军.细胞核移植技术的发展及其应 用.中国生物制品学志,2007,20(6):467~470. [3] 王凌云,成功,周欢敏.动物转基因研究中的 技术方法.生物技术通报 2010,12:73~77. .
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1981年，Illmenser 和Hoppe将小鼠胚胎内细胞团的细胞核 植入去核的受精卵中，克隆出3只小鼠；
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1986年，Willadsen等用未分化的胚胎细胞克隆出一只核移 植绵羊；
1987年，Robl用胚胎细胞克隆出核移植羊； 1997年，Wilmut用成年绵羊的乳腺上皮细胞为核供体，克 隆出绵羊Dolly。
优点：
外源基因整合情况的可控性高。 可预先在细胞水平检测外源基因的拷贝数、 定位、表达的水平及插入的稳定性。 外源基因导入ES细胞的方法多样，细胞鉴 定及筛选方便。
缺点：
ES细胞系建立及培养困难 维持ES细胞的未分化及多向分化潜能不易 所得个体为嵌合体
2. 4 逆转录病毒感染法
• 逆转录病毒是第一个用于基因转移的病毒载 体。 • 将目的基因整合到逆转录病毒的 RNA 载体 上 ,制成高滴度的病毒颗粒 ,人为感染着床前或着 床后的胚胎 ,RNA 病毒感染宿主细胞后反转录成 相应的DNA ,并在整合酶和其末端特殊核酸序列 的作用下整合到宿主细胞的基因组中进行表达和 遗传得到转基因动物。
2. 2 精子载体介导法
• 将精子反复冷冻或经过化学物质处理后 与外源 DNA 共同孵育 ,从而使外源DNA 与 精子结合 ,然后通过人工授精得到转基因个 体 • 目前国际上极少成功模型，国内也很少 有相关报道，精子载体法很少被应用。
体外受精法 & 胞质内显微注射法
• 体外受精法是一种直接用精子作为外源 DNA 载体的转基因方法 ,其过程是将成熟的 精子与外源 DNA 进行预培养 ,因为在一定 条件下 ,精子核后帽区有自发结合 DNA 的 能力 ,因此 ,精子能够携带外源 DNA进入受 精卵 ,并使之受精 ,从而使外源 DNA 整合到 受体染色体中而得到转基因动物。
Gordon 等人首次成功地将含有HSV 和 SV40DNA 片段的重组质粒DNA 以显微注射法导 入小鼠受精卵的雄原核内，得到了带有这种外源 DNA 顺序的TGM 。 1982 年Palmiter 等运用此法得到的所谓“超 级巨鼠”,曾引起整个生物学界的轰动。
到目前为止，人类已获得转基因鱼、 鼠、羊、猪、兔、牛等大小动物。 从转基因动物所获得的资料几乎涉及医 学遗传学、肿瘤学、免疫学等的基因研 究，还涉及生物药物的研究，基因治疗的 开发研究等。
1984年，Bradley证实注射入囊胚的小鼠ES细胞可分化为 成体的各种组织，并整合入生殖系。 意义：里程碑，与同源重组技术的结合使得在整体水平 定向改变和修饰哺乳动物的遗传特性成为可能。 1995年，Thomson从恒河猴中分离了猴的ES细胞； 1998年，Thomson从人的囊胚中分离成功人的ES细胞； 2000年，Bongso等建立了人的ES细胞株 ……
以使用较多的小鼠为例，这一方法的实 验程序如下：
• ⑴ 准备假孕母鼠（养母）
• ⑵ 受精卵的准备 • ⑶ 基因导入 • ⑷ 胚胎移植 • ⑸ 对幼鼠的鉴定
优点：
外源DNA大小基本不受限制(1-50kb)
导入过程直观
整合率高
缺点：
设备昂贵、环节较多 对操作人员有较高的技术要求 低效率（尤其是大家畜） 对卵子伤害大，胚胎存活率低 基因整合随机性 转基因沉默