油红O染色法及Masson染色法

油红O染色及Masson染色

油红O染色

1. 染色液的配制

材料：油红染料棕色可密封瓶异丙醇研钵漏斗定性滤纸

称取预先研磨粉碎的0.5g油红干粉，溶于少量异丙醇中，然后加异丙醇至100ml，棕色瓶密封（或锡箔纸包裹避光）4℃保存，为储存液，可长期保存。用时取6ml加三蒸水4ml 混匀，定性滤纸过滤，稀释后数小时内用完。 2. 10%中性甲醛的配制

材料：中性甲醛（多聚甲醛）密封瓶

称取1g中性甲醛粉末，加入10ml的三蒸水中，密封，在60度水浴中过夜才能溶解。配好的溶液1个星期内有效，最好4度保存。

3.染色对象间充质细胞脂肪诱导后不同时间段。

4.培养载体 3毫升培养瓶。如果培养载体为塑料制品，hoechst33342染核的话，塑料板自发荧光也为蓝色，必须考虑。

5.染色步骤：

5.1 先小心轻缓倒去培养夜。

5.2 用pbs轻缓漂洗（不洗没问题）。

5.3 加10%中性甲醛固定30min（实际固定时间过夜都没问题。固定液用95%酒精也可）。固定的是细胞膜。

5.4 稀释油红储存液，油红：去离子水＝3:2，滤纸过滤，室温放置10min（除去一些杂质，染色结果更清晰）。

5.5 染色10min左右，加的体积覆盖住板底即可，如6孔加1.5ml，24孔加0.5-1ml（实际染色时间1小时都可以）。

5.6 脱色，用75%酒精/60%异丙醇漂洗，除去多余的染料（实际用其他平衡液洗也没问题，背景并不会残留多少）。

5.7 复染，淡苏木染色1/5分钟，pbs漂洗（这一步不做也可，看试验需要，并且苏木素会把胞浆染红，如要显示核， hoechst33342也可以，浓度5微克/毫升染10分钟即可把核染上）。 5.8甘油明胶封片（封片后可长期保存）。 5.9 显微镜观察。注意事项：

脂肪油红染色，有的是动物/人体脂肪组织切片，或细胞爬片。各有操作差异。以下是各论坛方法小结，不全。

1.完全成熟饱满的脂肪细胞，容易破裂，脂滴泄漏，所以压片，切片都要考虑到这个问题。

2.细胞爬片细胞溶液脱落，特别是脂滴大的。操作务要轻柔。不要把细胞冲掉。

3.如果做脂肪组织冰冻切片，冰冻温度比普通要低，切片厚度加厚。

Masson三色染色

主要用途：主要用于胶原纤维和肌纤维的鉴别染色。

检验原理:

由mallory三色染色改造，利用两种或三种阴离子染料混合一起或先后作用完成染色，与阴离子染料分子大小和组织的渗透性有关。根据组织不同的渗透性能，选择分子大小不同的阴离子的染料进行染色，便可把不同组织成份显示出来。

一、实验试剂

1. Regaud 氏苏木精：苏木精1g，95%酒精10ml，甘油10ml，蒸馏水80ml。将苏木精加入蒸馏水内加温溶解，冷却后加入酒精和甘油，放数日后即可应用；

2. Masson丽春红酸性复红液：丽春红0.7g，酸性复红0.3g，蒸馏水99ml，冰醋酸1ml；

3. 0.2%冰醋酸水溶液：冰醋酸0.2 ml，蒸馏水100 ml；

4. 1%磷钼酸水溶液：磷钼酸1g，蒸馏水100 ml；

5. 苯胺蓝水溶液：苯胺蓝2g，蒸馏水98 ml，冰醋酸2 ml；

6. 1%光绿水溶液：光绿 1g，蒸馏水100 ml。

二、操作步骤

1. 石蜡切片脱蜡至水；

2. 铬化处理或去汞盐沉淀(甲醛固定的组织此步可略)；

3. 依次自来水和蒸馏水洗；

4. 用Regaud苏木精染液或Weigert苏木精液染核5-10min；

5. 充分水洗，如过染可盐酸酒精分化；

6. 蒸馏水洗；

7. 用Masson 丽春红酸性复红液5-10min；

8. 以2%冰醋酸水溶液浸洗片刻；

9. 1%磷钼酸水溶液分化3-5min；

10. 不经水洗，直接用苯胺蓝或光绿液染5min；

11. 以0.2%冰醋酸水溶液浸洗片刻；

12. 95%酒精、无水酒精、二甲苯透明、中性树胶封固。

结果：胶原纤维、粘液、软骨呈蓝色(如光绿液染色为绿色)，胞浆、肌肉、纤维素、神经胶质呈红色，胞核黑蓝色。

三、体会与说明

1. 控制好染色步骤；

2. 组织固定起着很重要的作用，根据不同的固定液可延长或缩短染色时间；

3. 0.2%冰醋酸水溶液洗，可使色调清晰鲜艳；

4. 磷钼酸水溶液对丽春红、酸性复红有分化作用，分化时镜下控制，肌纤维和纤维素呈红色，胶原纤维呈淡粉红色即可。

检验结果：

胶原纤维、粘液、软骨呈蓝色，肌纤维、纤维素和红细胞染红色、胞核染蓝黑色。

注意事项：

1.weigert铁苏木素分A、B两液，应与临用前将两液等分混合，而不宜预先混合，否则容易氧化沉淀而逐渐失去染色能力。

2.组织用bouin氏液或zenker氏液固定为佳，如已用10%甲醛液固定，切片可在脱蜡至水后，再放入bouin氏液作用一晚或置37℃温箱内1-2小时，然后流水冲洗切片至黄色消失再进行染色。

3.磷钼酸处理时，要镜下控制，见肌纤维呈红色，胶原纤维呈淡红色即可