第五章原生质体培养

伊凡蓝法：伊凡蓝不能穿过质膜，只有质膜受到严重损
坏使，细胞才能被染色，因而可以通过细胞被染色与否确 定活性。
5、影响原生质体活力的因素 分离材料的生理状态 酶解条件：酶质量、浓度、酶解温度、酶解时间、酶
溶液的渗透压
分离条件：离心次数、离心速度、纯化方法、分离持 续时间 环境条件：操作环境的温度、分离用具的影响
Recovery of plantlets through somatic embryogenesis
g
h
i
g: Transfer of microcalli onto B5H medium and induction of somatic embryos. h: Transfer of globular embryos onto Boi2y medium for maturation of somatic embryos. i: Transfer of cotyledonary stage embryos onto MS medium for conversion of embryo into plantlets.
Purified protoplasts
4、原生质体活力检测
目测法：在显微镜下观察，根据细胞形态、流动性确定
原生质体活力。
FDA法：FDA（二乙酸荧光素）是一种非极性物质，能
自由地穿越细胞质膜，在活细胞内，FDA被酯酶裂解即发 荧光（荧光素），由于荧光素不能自由通过质膜，因而可 以在荧光显微镜下通过具荧光的细胞的观察确定细胞活性 。
来源
绿色木霉 绿色木霉 Irpex lutens
生产厂家
Yakult Honsha Co. Ltd., Tokyo, Japan Calbiochem., San Diego, CA 92037, USA Kayowa Hakko Kogyo Co., Tokyo, Japan
果胶酶类
Macerozyme R-10 根霉 Pectinase 黑曲霉
体的分裂和细胞团的形成。
3、原生质体发育和植株再生
细胞壁再生 细胞分裂与生长 愈伤组织形成 植株再生
细胞壁的再生
原生质体培养数小时后开始再生新的细胞壁， 一至数天内便可形成完整的细胞壁。 电镜观察发现，原生质体培养数小时后新壁开 始形成，先是质膜合成形成细胞壁主要成分的微 纤维，然后转移到质膜表面进行聚合作用产生多 片层的结构，以后在质膜与片层之间或在膜上产 生小纤维丝，逐渐形成不定向的纤维团，最后形 成完整的细胞壁。
液体－固体双层培养
在培养皿的底部铺一层琼脂糖固体培养基，
再将原生质体悬浮液滴于固体培养基表面。
优点：
固体培养基中的营养物质可缓慢释放到液体
培养基中，如果在下层固体培养基中加一定量
的活性炭，则还可以吸附培养物产生的一些有
害物质，促进原生质体的分裂和细胞团的形成。
缺点：不易观察细胞的发育过程。
固体平板培养
建立细胞悬浮系
叶肉原生质体分离纯化
Leaves were cut in thin stripes and digested in an enzyme solution with mannitol
Purification of protoplasts from leaf debris on sucrose gradient.
琼脂糖珠培养
将含有原生质体的液态琼脂糖培养基用吸
管以大约50ul一滴的量滴于直径6cm的培养皿，
待其固化后向其中添加3ml液体培养基并于摇床
上低速旋转培养。培养过程中，通过调整液体
培养基的渗透压来调节培养物的渗透压以利于
其进一步的生长和发育。这种方法由于改善了
培养物的通气和营养环境，从而促进了原生质
a
b
c
d
e
f
a: first division, 10 days after protoplast isolation b,c: 2 and 3 wo microcolonies.
d,e: 4 and 6 wo microcalli
f: 8 wo microcalli just before being transferred onto B5h medium
二、原生质体培养 1、原生质体培养基
无机盐：大量元素浓度；NO3－和NH4+的比例；Ca2+浓度
有机成分：维生素、氨基酸、糖及糖醇等，酵母提取物、水解酪蛋白。 激素：常用的激素：NAA、IAA、BA与2,4-D 渗透压：常用的渗透压调节剂：甘露醇、山梨醇、蔗糖和葡萄糖等。
原生质体的渗透压原则：培养基渗透压与细胞渗透压等渗
Sigma Chemical Co.,St. Louis, MO 63178,USA
酶溶剂及其渗透压 酶溶剂：原生质体培养基或特殊配制。
渗透压调节剂：葡萄糖、甘露醇、山梨醇等
酶处理： 酶浓度 酶解时间 酶解温度
3、原生质体的收集和纯化 飘浮法：常用的飘浮剂：蔗糖、Percoll、Ficoll。 沉淀法：常用甘露醇作为渗透压调节剂，先将 酶液洗出干净，再用Percoll飘浮一次。
Yakylt Honsha Co. Ltd.,Tokyo, Japan Sigma Chemical Co., St. Louit, MO 63178,USA
Pectolyase Y-23
半纤维素酶
黑曲霉
Seishin Pharm. Co. Ltd., Tokyo, Japan
Rhozyme HP-150 黑曲酶Rohm and Hass Co., Philadelphia, PA 19105, USA Hemicellulase 黑曲霉
但越来越多的试验证明，两步成苗法更适 合大多数植物原生质体再生植株。即：首先 将愈伤组织培养于含低浓度生长素培养基上， 让其增殖和调整状态，再将其转移到分化培 养基上分化成苗。
a Friable embryogenic calli, b suspension cell aggregates, c freshly isolated protoplasts from suspension culture, d protoplasts stained with FDA, e division of cell derived from protoplasts, f cell colonies derived from protoplast, g proto-calli developed from protoplasts embedded in agarose, h green shoot formation, i fertile green plant Protoplast culture and fertile green plant regeneration of rye.
愈伤组织形成
通常原生质体培养2周后，形成多细胞的细胞团，Βιβλιοθήκη 周后形成肉眼可见的小细胞团，约6周
后形成直径1mm的小愈伤组织。 原生质体培养7～10d后需及时添加新鲜培养 基，否则形成的细胞团不继续生长。待小愈伤 组织长至约1mm时应及时转移到固体培养基上使 其进一步生长。
植株再生
原生质体形成的愈伤组织直接转移到分化 培养基上可一步成苗。
即琼脂糖包埋培养。低融点的琼脂糖可在约 30℃融化与原生质体混合而不影响原生质体的生 命活动。混合后含有原生质体的培养基铺于培养 皿底部，封口后进行培养。
优点：
可以跟踪观察单个原生质体的发育情况，易于 统计原生质体分裂频率。 缺点：
操作要求严格，尤其是混合时的温度掌握必需 合适，温度偏高则影响原生质体的活力，温度偏 低则琼脂糖凝固太快原生质体不易混合均匀。
2、原生质体培养方法
液体浅层培养
将含有原生质体的培养液在培养皿底部铺一 薄层，封口后进行培养。 优点： 操作简单，对原生质体的损伤小，且易于添 加新鲜培养基转移培养物。 缺点： 原生质体分布不均匀，常常发生原生质体之 间的粘连现象而影响其进一步的生长和发育。 此外，难以跟踪观察某一个细胞的发育情况。
第五章 原生质体培养
一、原生质体的制备 基础材料准备 预处理与酶解 原生质体收集与纯化
原生质体活力测定
1、用于分离原生质体材料的准备
无菌试管苗叶片
培养细胞
2、预处理与酶解 材料预处理：子叶、下胚轴;叶片;愈伤组织或 胚性悬浮细胞
叶肉原生质体
原生质体分离常用的商品酶
酶
纤维素酶类 onozuka R–10 Cellulysin Driselase
细胞分裂和生长
一般原生质体培养2～7d后开始第一次分裂，
但开始第一次分裂的时间随植物的种类、分离
原生质体的材料、原生质体的质量、培养基的 成分和培养条件而异。 一般用幼苗的下胚轴、子叶、幼根、悬浮
培养细胞、未成熟种子子叶等为材料分离的原
生质体，比用叶分离的原生质体容易诱导分裂，
第一次分裂出现的时间较快。