实验二细菌单染与复染
实验二显微镜的使用酵母菌的观察细菌的单染色及简单染色
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➢ 染色剂 草酸铵结晶紫染液 卢戈氏碘液 95%乙醇 番红染色液
➢ 仪器或其他用具 显微镜、酒精灯、载玻片、接种环、无菌水等。
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操
作
步
采用三区涂片法制片
骤
大肠杆菌
大肠杆菌与枯草芽孢杆菌 混合涂片
枯草芽孢杆菌
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操 作 步 骤
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实验器材
➢ 菌种
Ø土壤样品分离纯化后得到的细菌
➢ 染色剂
Ø草酸铵结晶紫染液
Ø番红染液
➢ 仪器或其他用具 Ø显微镜、酒精灯、载玻片、接种环、无菌水等。
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涂片
干燥
操
固定
作 步
染色
骤
水洗
干燥
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镜检
实验结果
➢ 根据观察结果，绘出细菌形态图。
思考题（P76五、2. （１）（2）（3））
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萌发芽孢的枯草 芽孢杆菌
大肠杆菌
大肠杆菌与枯草芽孢杆菌混合涂片油镜下 形态（革兰氏染色）
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实验结果
➢ 列表说明你所观察到的细菌形状、颜色和革兰氏 染色反应。
菌种
形态
颜色
结果（Ｇ＋、Ｇ－）
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思考题
➢ 你认为哪些环节会影响革兰氏染色结果的正确性？其 中最关键的环节是什么？
➢ 在革兰氏染色时，为什么特别强调菌龄不能太老，用 老龄细菌染色会出现什么问题？
➢ 你认为革兰氏染色中，哪一个步骤可以省去而不影 响最终结果？在什么情况下可以采用？
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细菌染色技术
细菌染色技术（单染技术与革兰氏染色）细菌个体微小，普通光学显微镜下不易直接观察，故常用染色技术使细菌细胞着色。
包括细菌单染技术、细菌的革兰氏染色技术、细菌的芽孢染色技术、细菌的荚膜染色技术和细菌的鞭毛染色技术Ⅰ、细菌的单染技术简单染色通常只用一种染色剂，使细菌整个细胞染上颜色。
但看不清结构。
所以只便于检查细菌的形态、大小和排列方式等。
【实验目的】1、掌握单染色的操作技术2、观察细菌的基本形态【实验原理】单染色即用单纯的种染料进行染色，多数采用美蓝、结晶紫或石碳酸复红等碱性染料。
此法仅能显示细胞的外部形态，而不能辨别其内部结构。
染色前必须将细胞固定，其目的是杀死细菌，并使它粘附在载玻片上。
此外，还可以增加菌体对染料的亲和力。
常用的有加热和化学固定两种方法。
无论用哪种方法都应尽量使细菌维持原有的形态，防止细胞膨胀或收缩。
【实验材料、药品及器具】1、菌种大肠杆菌（Escherichia coli）枯草芽孢杆菌（Bacillus Subtilis）2、染色液石炭酸品红染色或结晶紫染色液（Stining Solutions）3、无菌水4、洗瓶装蒸馏水5、洗净的载玻片（Slicle）5片6、显微镜、香柏油、接种环、酒精灯、擦镜纸、吸水纸、二甲苯1、涂片：取一片干净无油载玻片，在其中央滴一滴无菌水，然后用接种环以无菌操作方法取少许培养好的大肠杆菌，放在载玻片的水滴中涂匀，注意菌量不宜过多，否则，不易看清单个菌体。
2、固定：将涂好的玻片在空气中风干或火焰上通过3～4 次，使水份蒸发，此时细菌菌体紧贴在玻片上。
3、染色：用石炭酸品红或结晶紫染色剂30~60S，然后用洗瓶轻轻冲洗染色剂（注意不要直接冲洗染色部位），直至无多余的染液，晾干或用吸水纸从旁吸干或用微火烘干。
4、用同样方法将枯草芽孢杆菌制作一张涂片。
5、镜检：首先在低倍镜下找到物像，然后在涂膜中央滴一滴香柏油，换成油浸镜观察两个菌种的形态和排列。
6、去除油镜上的香柏油：先用干净的擦镜纸擦2-3 次，再换另一张擦镜纸蘸取少许二甲苯以除去残留的香柏油，最后用擦镜纸擦干。
实验二细菌的革兰氏染色
实验二细菌的革兰氏染色一.实验目的1.了解革兰氏染色原理并掌握其操作。
2.巩固无菌操作技术及显微镜使用方法。
二.实验原理革兰氏染色法能将细菌分成两大类，即革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。
在用乙醇进行脱色时，两种菌的细胞壁结构不同，阳性菌细胞壁为网状结构，比较厚，结晶紫-碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内，而阴性菌细胞壁比较薄，颜色更容易洗脱出来，所以最终革兰氏阴性菌为红色，阳性菌为紫色。
三.仪器、试剂与材料1.菌种：枯草芽孢杆菌和大肠埃希氏菌属25922。
2.染色液和试剂：结晶紫、碘液、番红、95%的乙醇、沙黄、香柏油、二甲苯、蒸馏水。
3.器材：显微镜、载玻片、接种环、酒精灯、擦镜纸、滴管、吸水纸四.实验步骤1.染色步骤：（1）制片：接种环蘸取细菌液置于载玻片，酒精灯外焰加热玻片进行细菌固定。
（2）初染：添加结晶紫染色，1min后倾去染色液，蒸馏水冲洗至无色。
（3）媒染：吸干残留蒸馏水后，加入一滴碘液，作用1min，水洗。
（4）脱色：吸干残液后，加入95%酒精进行脱色，30s后水洗。
（5）复染：吸干残液后，用番红液复染，1min后，水洗。
（6）镜检：吸干残液后，低倍镜寻找目标物体，再用高倍镜放大目标物，目标视野添加香柏油进行观察。
2.平板划线（1）左手中指、无名指和小拇指托住无菌平皿。
（2）盖子用食指和拇指掰开，右手持接种环进行第一区划线。
（3）酒精灯灼烧接种环至通红，晾凉后进行第二区划线（4）重复（3）进行第三、四区划线（5）将平皿置于适宜温度的培养箱培养过夜。
五.结果与讨论1.革兰氏染色结果图1为显微镜下的染色结果，从结果可以看出，这是革兰氏阳性菌，也就是我们所用的实验材料之一枯草芽孢杆菌，不过红色比较零星，这可能是因为我们在清洗载玻片的时候不小心清洗过度，将一部分细菌冲洗掉了，所以效果并不是很好。
图1 枯草芽孢杆菌而我们所用的另外一个实验材料大肠埃希氏菌属25922理论上说应该是革兰氏阴性菌，这也就意味着最终显微镜下看到的颜色应该是紫色，但是试验最后我们只观察到一片白色，回过头来思考原因，这可能是因为我们在吸干载玻片的过程中用力过猛用纸巾把细菌给擦去了，所以最后细菌都没了，也就没有染上相应的颜色。
细菌单染色法实验报告
细菌单染色法实验报告实验报告：细菌单染色法实验目的：本实验旨在了解细菌的基本特征、分离方法和单染色法的操作步骤，达到掌握基本的细菌学实验操作技能的目的。
实验材料和设备：培养基：nutrient agar medium菌液：大肠杆菌（Escherichia coli）理化反应器材：培养皿、酒精灯、移液管、镊子、显微镜、染色剂实验步骤：1.取培养皿，将20ml的nutrient agar medium倒入培养皿中，均匀摇匀，培养皿放置到无菌座上。
2.用均质的大肠杆菌籽数微量滴在培养皿表面，倾斜培养皿让菌液均匀涂布在培养基表面上，避免空气震荡。
3.将培养皿加盖，并在37℃温度下孵育18-24小时，待菌落形成。
4.取无菌的玻片片上，用滴管吸取适量静态培养的大肠杆菌稀释，滴至玻片表面，然后用搅拌杆均匀地把菌液涂布于玻片表面,让其均匀分布，晾干。
5.将干燥后的玻片放置于酒精灯上烘烤3-5秒钟，在显微镜下观察。
6.将玻片在蒸馏水中烫一下，滴一滴甲基紫液，加热过程中淋涂蒸馏水，颜色变浅停止加热，静置1分钟。
7.再将玻片漂洗干净，用酒精洗一下，用酒精背面烘烤干,在显微镜下进行观察。
实验成果：1.孵育完毕后经观察，nutrient agar medium表面菌落的数量和大小均匀分布，无杂菌污染。
2.染色处理后，在显微镜下观察到玻片表面有清晰明亮的该种细菌，细胞大小及数量均匀。
结果分析：本次实验成功地将大肠杆菌进行分离，通过单染色法技术，观察到大肠杆菌在玻片表面生长的细胞形态。
注意事项：1.实验前，先做好安全和无菌操作。
2.氧气、灰尘、霉菌、游离病原微生物都会影响结果，要多加注意。
3.培养皿倒入时要快速并均匀，以免培养基固化。
4.染色加热时间过长或过短都会影响颜色和分辨率，要注意加热过程。
结论：细菌单染色法是一种基本的细菌学实验，成功地将大肠杆菌进行了分离和染色处理。
它是对细菌结构形态、分布情况的观察研究，为后续细菌学研究打下基础。
实验二细菌的形态观察（简单染色法和革兰氏染色法）
实验二细菌的形态观察（简单染色法和革兰氏染色法）实验二细菌的形态观察（简单染色法和革兰氏染色法）一目的要求1．了解简单染色法和革兰氏染色法的基本原理，熟练掌握细菌的涂片与革兰氏染色技术。
2．初步学习细菌细胞特殊结构的染色方法，并观察细菌的特殊结构。
3．观察细菌的菌落平板，学会识别大肠杆菌、枯草杆菌和金黄色葡萄球菌的菌落特征，学会初步鉴别微生物的种类的方法。
二实验内容与原理1．简单染色法原理简单染色法是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法，一般用于观察个体形态与细菌排列。
由于细菌在中性、碱性或弱酸性环境中带负电荷，所以通常采用一种碱性染料如美蓝、碱性复红、结晶紫对细菌进行染色。
美蓝是美蓝的盐酸盐，可解离为带正电荷的美蓝，很容易与细菌结合使菌体着色。
染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下更易于识别。
简单染色过程：涂片→固定→染色→水洗→干燥→镜检涂片→ 固定→ 干燥→ 水洗、吸干→镜检→染色 1mim2．革兰氏染色法原理革兰氏染色法是由丹麦医生 Hans Christian Gram于 1884 年创立。
它是细菌学中很重要的鉴别染色法，因为通过此法染色，可将细菌鉴别为革兰氏阳性菌（G + ）和革兰氏阴性菌（G －）两大类。
革兰氏染色过程：涂片→固定→结晶紫初染（1min）→碘液媒染（1min）→乙醇脱色（95% 酒精,30s）→番红复染（30 秒）→干燥→镜检阳性菌：紫色阴性菌：红色革兰氏染色要点：（1）初染：用结晶紫，染色 1 分钟，水洗。
（2）媒染：加碘液覆盖 1 分钟后水洗。
（3）脱色：连续滴加 95％乙醇，约 30 秒，直到滴下的乙醇无色为止，水洗。
（4）复染：加番红染色 1 分钟，水洗。
（5）干燥。
（6）镜检：先低倍镜，后油镜观察。
注意：涂片要薄而均匀，脱色程度要控制得当。
学生做大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，枯草杆菌的革兰氏染色。
观察细菌个体形态与排列，绘图。
3．芽孢染色原理细菌的芽孢壁比营养细胞壁厚，致密，透性差，着色和脱色都比营养细胞困难，故一般采用一种碱性染料并在微火上加热，或延长染色时间，使菌体和芽孢都染上颜色以后水洗或稀酸冲去菌体的染料，芽孢仍保留颜色，再用另一种对比鲜明的染料使菌体着色，如此可明显区分芽孢和营养体结构。
实验二细菌的单染色及革兰氏染色
掌握染色步骤
选择适当的染料，对细菌进行固定、 染色、脱色、复染等步骤，确保染色 效果良好。
掌握革兰氏染色技术
了解革兰氏染色的原理
革兰氏染色是一种用于区分革兰氏阳 性菌和革兰氏阴性菌的染色技术。
掌握染色步骤
在涂片上涂抹细菌，然后使用结晶紫 、碘液和酒精等染料进行染色和脱色
，最后用番红和石炭酸复染。
识别染色结果
革兰氏染色结果分析
染色反应
革兰氏染色可以将细菌分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌两大类 ，通过染色反应可以初步判断细菌的致病性。
颜色变化
革兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌呈红色，通过颜色变化可以判 断细菌类型。
染色准确性
革兰氏染色准确性较高，对于初步鉴别细菌种类具有重要意义。
实验结果在细菌鉴别中的应用
初步鉴别
通过单染色和革兰氏染色实验结果，可以对细菌进行初步鉴别，确 定可能的致病菌种类。
辅助诊断
在临床诊断中，细菌鉴别对于确定感染源、选择合适的治疗方案具 有重要意义。
科研应用
在科研领域，细菌鉴别可以为研究不同类型细菌的生物学特性、致病 机制等提供基础数据。
06
CATALOGUE
注意事项与实验改进
实验注意事项
实验前需确保实验室环境清洁 ，避免污染。
使用显微镜时，应确保镜头清 洁，以免影响观察效果。
在操作过程中，应避免细菌污 染，尤其是避免交叉污染。
实验结束后，应按照实验室规 定正确处理废弃物。
实验操作技巧与难点解析
01 涂片时，应保证涂片均匀，避免产生气泡 。
02 染色时，应控制染色时间，避免染色过度 或不足。
情况。
02
CATALOGUE
实验原理
实验二细菌单染色及革兰氏染色法
该方法通常使用结晶紫、姬姆萨 染料或瑞氏染料等染料进行染色。
染色过程中，染料能够进入细菌 细胞内，与细胞成分结合，使细
菌着色。
革兰氏染色法原理
革兰氏染色法是一种用于区分革 兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的染
色方法。
该方法通过使用结晶紫、碘液和 酒精等染料和试剂，对细菌进行 初染、媒染、脱色和复染等步骤。
将涂片放入复染液中， 使细菌重新染色。
水洗
用流水冲洗涂片，去 除染色液。
干燥
将涂片自然干燥或用 吸水纸吸干。
结果观察与记录
在显微镜下观察染色后的细菌涂片，记录观察到的细菌形态、染色深浅等特征。 根据观察结果，判断细菌的革兰氏染色反应，即阳性或阴性。
记录实验数据和结果，并进行分析和解释。
05
实验结果与分析
细菌单染色结果分析
01
02
03
染色效果
通过细菌单染色，可以清 晰地观察到细菌的形态、 大小和排列情况，为后续 分析提供基础。
染色方法
本实验采用了结晶紫染色 法，该方法操作简便，染 色效果稳定。
注意事项
在染色过程中，需严格控 制染色时间，避免染色过 度或不足，影响观察效果。
革兰氏染色结果分析
染色效果
熟悉染色法的操作流程
细菌单染色法的操作流程
制备细菌涂片→加温固定→加染料染色→水洗→干燥→观察。
革兰氏染色法的操作流程
制备细菌涂片→加结晶紫染色→水洗→碘液媒染→水洗→酒精脱色→水洗→沙 黄复染→水洗→干燥→观察。
了解染色结果与细菌特性的关系
细菌单染色法的染色结果
通过观察染色后的细菌，可以初步判断细菌的形态和大小，有助于鉴别细菌种类 。
革兰氏染色法的染色结果
实验二细菌革兰氏染色
（一）革兰氏染色 涂片—风干—固定—初染—水洗—媒染—水洗—
脱色—水洗—复染—水洗—干燥—镜检
菌悬液
涂片
干燥
滴加无 菌水
取菌苔
涂片
固定
Smear preparation
Heat fixing
Staining
crystal violet stain
wash with water
Counterstain with Safranin
3、用乙醇或丙酮冲洗进行脱色。在经历脱色后 仍将结晶紫保留在细胞内的为革兰氏阳性细 菌，而革兰氏阴性细菌的结晶紫被洗掉，细 胞呈无色。
4、用一种与结晶紫具有不同颜色的碱性染料对 涂片进行复染。例如沙黄，它使原来无色的 革兰氏阴性细菌最后呈现桃红到红色，而革 兰氏阳性细菌继续保持深紫色
成分
肽聚糖 磷壁酸 类脂质 蛋白质源自占细胞壁干重的%革兰氏阳性细菌
革兰氏阴性细菌
含量很高（50~90）
含量很低（~10）
含量较高（＜50）
无
一般无（＜2）
含量较高（~20）
无
含量较高
三、实验材料
1、菌种：大肠杆菌（E.C）、枯草杆菌（B.S） 2、染料：结晶紫、复红、碘液等 3、材料：95%酒精等 4、标本片：芽孢、荚膜、孢子丝
四、实验方法
注意事项：
（1）在涂片时不可过厚，否则在染色脱色时，都不易均匀， 固定时，不可过热，以载玻片不烫手为宜。
（2）严格掌握脱色程度，是革兰氏染色的关键步骤。如脱色 时间太长，阳性菌会误为革兰氏阴性菌，时间不足，革 兰氏阴性菌会误为革兰氏阳性菌。
（3）在镜检时，以分散开的菌体的革兰氏染色反应为准。 （4）设定阴性和阳性对照，确保实验的可靠性。
成信工环境工程微生物学实验指导02微生物的染色技术
实验二微生物的染色技术一、实验目的（一）了解微生物的染色原理。
（二）学习微生物涂片染色操作技术。
（三）掌握微生物的一般染色法和革兰氏染色法。
二、染色原理微生物（尤其是细菌）的机体是无色透明的，在显微镜下，由于光源是自然光，使微生物体与其背景反差小，不易看清微生物的形态和结构，若增加其反差，微生物的形态就可看得清楚。
通常用染料将菌体染上颜色以增加反差，便于观察。
革兰氏染色法（复染色法或鉴别染色法）用两种或多种染料染细菌，目的是为了鉴别不同性质的细菌，所以又叫鉴别染色法。
主要的复染色法有革兰氏染色法和抗酸性染色法。
抗酸性染色法多在医学上采用。
此处介绍革兰氏染色法。
革兰氏染色法是细菌学中很重要的一种鉴别染色法，它可将细菌区别为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌两大类。
革兰染色结果是由细菌的细胞壁决定的。
革兰阳性细菌的细胞壁肽聚糖含量高且呈网状结构，细胞壁较厚，类脂质含量低；革兰阴性细菌的细胞壁肽聚糖含量低，细胞壁薄，类脂质含量高。
前者用酒精脱色时，细胞壁因脱水肽聚糖层网孔变小，其通透性降低，使结晶紫-碘的复合物不易被抽取而继续留在细胞内，经脱色和复染后仍保留着初染剂结晶紫的颜色（紫色）；后者用酒精脱色时，类脂质被酒精溶解，细胞壁通透性增大，使结晶紫-碘的复合物易被抽取出来，紫色褪去，用复染剂复染后，细胞的颜色即呈复剂的颜色（红色）。
革兰染色最关键的步骤是酒精脱色。
事实上，用结晶紫进行初染时所有的细菌都被染成紫色。
碘是一种媒染剂，能与结晶紫结合成结晶紫-碘的复合物，以增强染料与细菌的结合力。
只有经过酒精处理，再经复染，不同的细菌才会显现出不同的染色结果。
三、实验仪器、材料（一）显微镜、香柏油（或液体石蜡）、二甲苯、擦镜纸、吸水纸、接种环、载玻片、酒精灯（或煤气灯）。
（二）石炭酸复红（品红）染液、草酸铵结晶紫染液、革氏碘液、95％乙醇、蕃红染液1（三）菌种：枯草杆菌、大肠杆菌、活性污泥等四、实验内容和步骤革兰氏染色步骤（图4）1．取大肠杆菌和枯草杆菌（均以无菌操作）分别做涂片、干燥、固定。
实验二、细菌染色法
球菌
肺炎链球菌
杆菌
炭疽杆菌
破伤风杆菌
肉毒芽孢杆菌
杆菌
变形杆菌
大肠杆菌
绿脓杆菌
螺菌
幽门螺杆菌
霍乱弧菌
钩端螺旋体
涂片
菌液涂片时不需滴加生理盐水； 注意练习无菌操作； 取菌不要贪多，接种环上肉眼可见菌苔 痕迹即可； 菌苔在生理盐水中涂片要均匀，局部不 宜过厚,以免脱色不完全造成假阳性。
• ⑴初染 将涂片臵于桌面上，滴加结晶紫 染色液于细菌涂抹处，使其布满菌膜，染 色1min。倾去染色液，用自来水小心地冲 洗去多余染液，甩净积水。 • ⑵媒染 滴加(Lugol)碘液覆盖菌膜，染 1min，水洗。 • ⑶脱色 滴加95%乙醇于载玻片上，直至流 下的乙醇无色，然后水洗（终止脱色）， 甩净。 • ⑷复染 滴加稀释复红染液于菌膜上，覆 盖住菌膜，染色1min，水洗，甩净，最后 用吸水纸轻轻吸干。
微生物分类鉴定的特征
形态学和生理生化特征 血清学实验和噬菌体分型 氨基酸序列和蛋白质分析 核酸碱基组成和序列分析
形态学特征
培养特征、菌落的形状、大小、颜色、表 面特征、光泽等 细胞形态：形状、大小、排列方式 特殊结构：鞭毛、芽孢、孢子、荚膜等 细胞内涵物 染色反应：革兰氏染色、抗菌细胞壁成分比较
成分 占细胞壁干重的%
革蓝氏阳性菌 革蓝氏阴性菌
肽聚糖 含量很高（50-90） 含量很低（~10）
磷壁酸 含量较高（<50） 无 类脂质 一般无（ < 2） 蛋白质 无 含量较高（~20） 含量较高
革兰氏染色的意义
• 细菌分类鉴定 • 指导临床用药
三、实验器材
2、干燥
将涂好菌膜的载玻片平放在桌面上，
室温下自然干燥。
细菌单染色法实验报告
细菌单染色法实验报告
实验目的，通过细菌单染色法，观察和分析细菌形态结构，为细菌的鉴定和分
类提供基础数据。
实验材料和方法：
1. 实验材料，大肠杆菌培养液、甲醇、青霉素、蒸馏水、无菌玻璃片、炉头、
染色盒、显微镜等。
2. 实验方法：
a. 取一滴细菌培养液放在玻璃片上，用火炉加热烘干。
b. 用甲醇固定，将甲醇滴在细菌上，使其固定在玻璃片上。
c. 用青霉素染色，将青霉素滴在细菌上，静置1分钟。
d. 用蒸馏水冲洗，将蒸馏水滴在细菌上，冲洗去除多余的染色剂。
e. 用滤纸吸干，用火炉加热干燥。
f. 将玻璃片放在显微镜下观察。
实验结果：
经过细菌单染色法处理后，观察到细菌呈现出明显的形态特征，包括大小、形状、排列方式等。
通过显微镜观察，可以清晰地看到细菌的细胞壁、细胞质等结构。
实验分析：
细菌单染色法是一种简单、快速的染色方法，可以使细菌在显微镜下呈现出明
显的形态特征，为后续的鉴定和分类提供了重要的参考。
通过本次实验，我们成功地观察到了大肠杆菌的形态特征，为我们进一步了解和研究细菌提供了重要的数据支持。
实验总结：
细菌单染色法是一种常用的细菌染色方法，通过简单的步骤，可以使细菌在显微镜下呈现出清晰的形态特征。
本次实验取得了良好的实验效果，为我们进一步研究细菌提供了重要的基础数据。
在今后的实验中，我们将进一步应用这一方法，深入了解和研究不同类型的细菌，为微生物学研究提供更多的支持和数据。
实验二++细菌的形态学检查(1)
实验二细菌的形态学检查【目的和要求】1．熟悉细菌染色的常用染料和一般程序。
2．掌握革兰染色的方法、原理、结果观察及意义。
3．熟悉不染色标本检查法（压滴法和悬滴法）的方法与结果观察。
4．熟悉细菌的特殊染色法。
【试剂与器材】1．菌种：葡萄球菌、大肠埃希菌。
2．试剂：革兰染色液、细胞壁染色液、芽胞染色液、鞭毛染色液、生理盐水等。
3．其他：载玻片、接种环、酒精灯、显微镜、香柏油、蜡笔、擦镜纸、脱油剂等。
【实验内容】一、细菌染色的一般程序细菌染色法分单染法和复染法。
单染法是用一种染料去染，所有细菌都染成一种颜色；复染法是用多种染料对细菌进行染色，不同细菌可染成不同的颜色。
大部分细菌染色的基本程序相同，即：涂片→干燥→固定→染色，根据实验目的选择不同的染色方法，在实际工作中，应用最广泛的是革兰染色法。
二、革兰染色1．染色原理（1）等电点学说：革兰阳性菌的等电点（pI2～3）比革兰阴性菌（pI4～5）低，在同一pH条件下革兰阳性菌带负电荷比革兰阴性菌要多，与带正电荷的碱性染料（结晶紫）结合性牢固，不易脱色。
（2）化学学说：革兰阳性菌含有大量的核糖核酸镁盐，与进入胞浆内的结晶紫和碘牢固结合成大分子复合物，不易被95%酒精脱色；而革兰阴性菌含此种物质少，故易被乙醇脱色。
（3）通透性学说：革兰阳性菌细胞壁结构较致密，肽聚糖层较厚，含脂质少，脱色时，乙醇不易进入，而且95％乙醇可使细胞壁脱水，细胞壁间隙缩小，通透性降低，阻碍结晶紫和碘复合物渗出。
而革兰阴性菌细胞壁结构疏松，肽聚糖层较薄，含脂质多，易被乙醇溶解，致使细胞壁通透性增高，细胞内的结晶紫与碘复合物易被溶出而脱色。
2．方法（1）涂片：取清洁无油迹的载玻片1张，用蜡笔划线将其分成左右两格。
用接种环先挑取生理盐水1~2环于载玻片每格中央，再分别挑取大肠杆菌和葡萄球菌少许菌落与生理盐水研匀，涂成直径约1.5cm的菌膜。
（2）干燥：让涂片自然干燥，也可在酒精灯火焰较远处微微加热烘干，但切勿靠近火焰。
实验二细菌的单染色
实验二细菌的单染色、革兰氏染色及芽孢染色实验二细菌的单染色、革兰氏染色及芽孢染色一、实验目的1. 掌握细菌的涂片技术。
2. 掌握细菌单染色、革兰氏染色和芽孢染色技术。
3. 初步学习无菌操作技术。
二、实验内容1. 学习细菌单染色革兰氏染色和芽孢染色的操作技术。
2. 初步学习无菌操作技术。
三、实验材料和用具大肠杆菌(E.coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylocosccus aureus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subitilis)的斜面菌种。
吕氏美蓝染色液、革兰氏染色液(结晶紫染液、卢戈氏碘液、95%乙醇、石炭酸复红液等)、5%孔雀绿水溶液、0.5%沙黄水溶液、香柏油、擦镜液、无菌水；显微镜、擦镜纸、接种环、酒精灯、载玻片、吸水纸等。
四、操作步骤（一）细菌的单染色1．涂片在洁净无脂的载玻片中央滴一小滴无菌水，用无菌操作方法从菌种斜面挑取少量菌体与水滴充分混匀，涂成薄膜，涂布面积约1～1.5cm2。
2．干燥将涂片于室温中自然干燥。
3．固定手扶载片一端，使涂菌的一面向上，将载片通过微火2～3次。
在火上固定时，用手摸涂片反面，以不烫手为宜。
不能将载片在火上烤，否则细菌形态毁坏。
4．染色将涂片置于水平位置，滴加染色液覆盖于涂菌处，染色约2min。
5．水洗倾去染色液，斜置载片，用自来水的细水流由载片上端流下，不得直接冲在涂菌处直洗至从载片上流下的水中无染色液的颜色为止。
6．干燥自然晾干或用吸水纸轻轻地吸干，注意不要擦掉菌体7．待标本完全干燥后，先用低倍镜和高倍镜观察，将典型部位移至视野中央，再用油镜观察（二）细菌的革兰氏染色1．涂菌用无菌操作方法从试管中沾取菌液一环，用接种环在洁净无脂的载玻片上做一薄而均匀、直径约lcm的菌膜。
涂菌后将接种环火焰灭菌。
2．干燥于空气中自然干燥。
亦可把玻片置于火焰上部略加温加速干燥(温度不宜过高)。
3．固定目的是杀死细菌并使细菌粘附在玻片上，便于染料着色，常用加热法，即将细菌涂片膜向上，通过火焰3次，以热而不烫为宜，防止菌体烧焦、变形。
实验二：细菌涂片的制备和染色镜检1
革兰氏染色法过程示意图 革兰氏染 色法动画
细菌的单染色
涂片
干燥
固定
镜检
水洗、吸干
染色1~2min
细菌形态与结构检查法
显微镜放大法——细菌形体微小，肉眼不能
直接看到，必须借助显微镜（普通光学显微镜、 电子显微镜）放大后才能观察。
染色法——细菌体小半透明，经染色后才能
观察较清楚。
显微镜放大法
芽胞染色原理：细菌的芽孢壁比营养 体的细胞壁结构复杂而且致密，透性 低，着色和脱色都比营养体细胞困难。
方法：采用碱性染料微加热着染或延长染 色时间，使营养体（菌体）和芽胞都着色 后，再脱去营养体细胞的颜色而保留芽胞 的颜色，再用其他颜色的染液着染营养体 方法，并可在显微镜下区别。
孔雀石绿—沙黄法染色步骤
1、要用幼龄培养物作革兰染色； 2、涂片不宜太厚，以免脱色不完全造成假阳性
革兰阳性菌：细胞壁肽聚糖层厚，交联而成的肽聚糖网状结构致
密，经乙醇处理发生脱水作用，使孔径缩小，通透性降低，结晶紫与 碘形成的大分子复合物保留在细胞内而不被脱色，结果使细胞呈现紫 色。
革兰阴性菌：细胞壁肽聚糖层薄，网状结构交联少，类脂含量较
普通光学显微镜(light microscope)
普通光学显微镜的分辨率为0.25um。一般细菌都大于 0.25um，故可用普通光学显微镜观察。
显微镜放大法
电子显微镜(electron microscope)
电子显微镜的分辨率为1nm。不仅能看清细菌的外形， 内部超微结构可一览无余。
荚膜
肺炎链球菌荚膜
透射电镜
扫描电镜
细菌的大小与形态
观察细菌常用光学显微镜，其大小用测 微尺在显微镜下进行测量，以微米(μm) 为单位。不同种类的细菌大小不一，同 一种细菌也因菌龄和环境因素的影响而 有差异。 球菌
实验二细菌单染与复染
三、实验材料
变形杆菌、表皮葡萄球菌 载玻片、接种环、酒精灯、香柏油、二甲
苯、擦镜纸、吸水纸等。 革兰氏染色液一套
四、实验步骤
1．简单染色 载玻片——中心加半滴水——无菌操作取菌——涂布于 水中使均匀并成薄膜状——干燥——火焰固定——染色 （1~2min）——水洗——干燥——镜检
Right: 混合菌染色结果 (G+和 G-)
五、实验结果
文字记录所观察到的革兰氏染色 结果的差别，判断是G－/ G＋。
绘图描述各菌形态（可在一个视ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ野中）。
六、问题与讨论
1革兰氏染色涂片为何不宜太浓厚？ 实验关键步骤？
2对一株未知菌进行革兰氏染色时，
怎样才能确证你的结论正确？
实验二 细菌简单染色法 革兰氏染色法
一、目的要求
1．巩固油镜的使用方法； 2．学习微生物涂片、染色基本技术，掌握细
菌的简单染色法； 3．学习、掌握细菌的革兰氏染色法； 4．建立“无菌操作”的概念，学习其技术。
二、实验原理
简单染色法：是利用单一染料对细菌进行 染色的方法，常用碱性染料。只能观察微 生物的大小、形状、和细胞排列状况，但 不能鉴别微生物以及它的特殊构造等。
复染色法：用两种或两种以上染色液进行 染色，有协助鉴别微生物的作用，故也称 鉴别染色法。常用的有： 革兰氏染色法、抗酸染色法、芽孢染色法、 鞭毛染色法等。
革兰氏染色
丹麦C.Gram创立，用于细菌分类学研究 细菌细胞壁的结构
G－肽聚糖层较薄，交联度低，含较多脂质， 故用乙醇等有机溶剂脱色时融解了类脂质， 增加了细胞的通透性，使初染的结晶紫和 碘的复合物易于渗出，经沙黄复染呈红色。
实验二细菌的染色及形态观察
实验二细菌的染色及形态观察一、目的要求1、了解细菌染色的基本原理。
2、掌握细菌的简单染、革兰氏染色及其他染色方法。
3、观察和识别细菌的形态及细菌细胞的特殊结构。
二、实验说明细菌菌体微小、而且折光率低，在显微镜下特别是在油浸物镜下几乎与背景无反差，很难看清楚，如将其染色，使折光率增大，便容易观察。
由于菌体的性质及各部分对某些染料的着色性不同，因此可以利用不同的染色方法来区别不同的细菌及其结构。
用于细菌染色的染色剂是苯环上含有发色基团和助色基团的化合物。
发色基团使化合物本身具有染色之能力，助色基团有电离特性，可以于被染物结合，使被染物着色。
染色剂有三种：酸性染色剂（电离后分子带负电荷）；碱性染色剂（电离后分子带电荷）；复合染色剂（在电离后分子不带电荷，故也称为中性染色剂）。
酸性染色剂主要用于染细胞质；碱性染色剂主要用于染核和异染颗粒等细胞结构；复合染色剂主要用来染螺旋体和立克次氏体。
三、实验材料1、显微镜、香柏油、二甲苯、擦镜纸。
2、酒精灯、接种环、载玻片。
3、石炭酸复红染色液、革兰氏染色液、荚膜染色液、鞭毛染色液（配方见附录）。
四、方法步骤（一）简单染色法步骤：涂片干燥固定染色水洗干燥镜检。
1、涂片在干净的载玻片中央加一滴蒸馏水，以无菌操作法，从斜面上挑取少量菌种，在载玻片上和水混合后，涂成一均匀薄层。
2、干燥固定涂片让其在空气中自然干燥，有时为使其干燥得快点，也可在酒精灯上加温，但勿贤紧靠火焰。
3、固定待涂片干燥徨，手持载玻片一端，有菌膜的一面向上，在酒精灯火焰上通过几次（用手背触载玻片背面，以不烫手为宜），待冷却后，再加染料。
4、染色玻片置于水平位置。
加石炭酸复红液于菌膜部位。
染1-2min。
5、水洗倾去染液，斜置玻片，用很细水流的自来水冲洗（切勿使水流直接冲刷在菌膜处），直至洗下水呈无色为止。
6、干燥自然干燥或用吸水纸吸干。
7、镜检。
（二）革兰氏染色法步骤：涂片干燥固定结晶紫染色水洗吸干 95%酒精脱色水洗吸干蕃红复染水洗干燥镜检。
细菌特殊的染色方法
细菌特殊的染色方法摘要：一、细菌染色的基本原理二、常规细菌染色方法1.单染色法2.复染色法三、特殊细菌染色方法1.荧光染色法2.免疫染色法3.金属离子染色法四、染色过程中的注意事项五、染色结果的判定与分析正文：细菌特殊的染色方法细菌染色是微生物学实验中的一项基本技术，通过染色可以清晰地观察到细菌的形态、结构和数量，为细菌的分类、鉴定和研究提供重要依据。
本文将对细菌特殊的染色方法进行介绍，以期为大家在实际工作中提供参考。
一、细菌染色的基本原理细菌染色是基于细胞成分的化学性质和物理性质差异，使染料选择性地吸附于细菌细胞表面，从而使细菌着色。
染色过程中，染料与细菌的结合力强弱决定了染色效果。
染料可分为碱性、中性、酸性染料，可根据实验需求选择合适染料。
二、常规细菌染色方法1.单染色法：使用一种染料对细菌进行染色，如革兰氏染色、奈瑟染色等。
染色过程中，染料与细菌结合，使细菌呈现出特定的颜色。
2.复染色法：使用两种或多种染料对细菌进行染色，如瑞氏染色、姬姆萨染色等。
复染色法可以使细菌呈现出多种颜色，有利于观察细菌的形态和结构。
三、特殊细菌染色方法1.荧光染色法：利用荧光染料对细菌进行染色，通过荧光显微镜观察细菌的形态和分布。
荧光染色法具有高灵敏度、高分辨率、无损性等优点，适用于活细胞染色。
2.免疫染色法：利用特异性抗体与细菌表面抗原结合，再通过荧光标记的二抗或金属离子标记的抗体进行染色。
免疫染色法可用于细菌的分类和鉴定，具有高度的特异性和准确性。
3.金属离子染色法：利用金属离子与细菌细胞内特定成分的结合，使细菌呈现出特定的颜色。
金属离子染色法适用于研究细菌的生理功能和代谢活性。
四、染色过程中的注意事项1.严格遵循染色操作规程，避免实验误差。
2.选择合适的染料和染色时间，根据实验需求进行调整。
3.染色过程中避免剧烈振荡和长时间暴露于高温环境，以免影响染色效果。
4.保持实验器材和试剂的干净，防止污染。
五、染色结果的判定与分析1.观察细菌的形态和颜色，判断染色效果。