实验三讲义 细菌的染色及形态观察
3实验三细菌革兰氏染色
实验三细菌革兰氏染色及特殊结构观察一、实验目的：1、了解革兰氏染色法的原理，并熟练掌握其操作步。
2、了解革兰氏染色法在细菌分类鉴定中的重要性。
3、通过革兰氏染色进一步理解细菌细胞壁的结构特点。
4、巩固在油镜下观察微生物的个体形态。
5、学习并掌握芽孢染色法。
6、学习并掌握微生物涂片、染色的基本技术和无菌操作技术。
二、主要仪器设备及材料：1、菌种：大肠杆菌，枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），金黄色葡萄球菌斜面2、试剂：草酸铵结晶紫染色液，路哥氏（Lugol）碘液，95%乙醇，0.5%番红染色液，香柏油，二甲苯，生理盐水，5%孔雀绿3、仪器与材料：生物显微镜，载玻片，盖玻片，酒精灯，火柴，小试管（75mm×10mm），烧杯（300mL），滴管，接种环，擦镜纸，镊子，电炉三、原理：微生物的细胞小且透明，在普通光学显微镜下不易识别，必须对它们进行染色，使经染色后的菌体与背景形成明显的色差，从而能更清楚地观察到其形态和结构。
因此，微生物染色技术是观察微生物形态结构的重要手段。
革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要性状。
它是1884年由丹麦医师Gram创立的。
革兰氏染色法（Gram stain）不仅能观察到细菌的形态，而且还可将所有细菌区分为两大类：染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G+表示；染色反应呈红色（复染颜色）的称为革兰氏阴性细菌，用G-表示。
细菌对革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。
革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由肽聚糖形成的网状结构组成的，在染色过程中，当用乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，通透性降低，使结晶紫-碘复合物被保留在细胞内而不易脱色，因此，呈现蓝紫色；革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖含量低，而脂类物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫-碘复合物易被乙醇抽出而脱色，然后又被染上了复染液（番红）的颜色，因此呈现红色。
微生物学实验：细菌的染色及形态观察
微生物学实验(本科生必修课共32学时)教学安排与学时分配每周4学时¾实验1 实验室环境和人体体表微生物的检测¾实验2 细菌形态的观察¾实验3 细菌的简单染色；革兰氏染色¾实验4 细菌荚膜和鞭毛染色；鞭毛运动观察¾实验5 放线菌、真菌形态结构的观察¾实验6 微生物测微技术和计数¾实验7 培养基的制备与灭菌¾实验8 微生物的纯种分离与培养¾实验9 细菌鉴定中生理生化反应¾实验10 噬菌体的效价测定¾实验11 水中微生物的检测（开放实验）¾实验12 产蛋白酶和淀粉酶芽孢杆菌的分离和活力检测（开放实验）¾实验13 微生物多糖——黄原胶的发酵和提取（开放实验）（一）细菌的染色及形态观察(实验3，2)¾认识细菌的基本形态，学习和掌握细菌压滴片的制作方法。
¾学习微生物涂片染色的基本技术。
¾掌握微生物革兰氏染色的基本原理和方法。
¾熟练掌握显微镜(油镜)的使用方法。
¾了解不同的微生物在斜面上、固体培养基和液体培养基中的生长特征。
目的要求实验原理¾微生物的培养特征是指微生物在固体培养基上和液体培养基中生长后所表现出的群体形态特征。
¾不同的微生物有其固有的培养特征，直线接种在固体培养基上培养时，会呈现出丝状，带刺状、小突起状、薄膜状、扩展状等菌苔特征。
¾细菌的个体微小（1～10 μm）¾光学显微镜下可以看到它们的个体形态球形、杆状、和螺旋形等¾染色后的菌体与背景形成鲜明的对比，在显微镜下更易于识别。
¾简单染色法是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法。
适用于菌体一般形状和细菌排列的观察。
¾常用碱性染料进行简单染色，这是因为：在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，而碱性染料在电离时，带正电荷，因此碱性染料很容易与细菌结合使细菌着色。
微生物学 实验3 放线菌的形态观察
3 、染色及干燥。滴加适量番红染液，染色 1 min ；水 洗至流出液为无色； 在酒精灯高处加热干燥。
4 、镜检。先用低倍镜寻找视野，然后用油镜进行观察。 注意区分气生菌丝、孢子丝和孢子的形态及排列方式。
五、观察与绘图
1.描述放线菌5406的菌落特征（大小、形 状、颜色、边缘情况等特征）。 2.绘制观察到的放线菌气生菌丝及孢子丝 形态。
3、孢子丝——有些气生菌丝分化成各种孢子丝，呈螺 旋状、波浪形或分枝状等，着生形式有丛生、互生和轮 生三种。
孢子的表面光滑或粗糙，圆或椭圆和线菌的重要依据。
分生孢子形态
三、材料
1、菌种：“5406”放线菌培养72 h的 平板培养物； 2、染料：蕃红； 3、器材：载玻片、盖玻片、酒精灯、镊 子、接种针、接种铲等。
四、方法及步骤
1、印片。取2片干净的载玻片，用解剖刀无菌挖取一块 放线菌的菌落（注：带培养基切下），放在一块载玻 片的中央（注：菌落面朝上）；用另一干净的载玻片 盖在这一菌落上轻轻按压，再小心取下这块载玻片 （注：不要使菌落移动）。 2、干燥固定。将取下的上面的载玻片在酒精灯火焰高 处烘烤干燥（注：有菌落的面朝上）；然后迅速通过 火焰2～3次，加热固定。
细黄链霉菌(Streptomyces microflavus)
显微形态：单细胞菌丝体，菌丝内一般无隔膜。
菌丝体分为三部分： 1、基内菌丝—深入培养基中的营养型一级菌丝 （较透明、颜色浅色）。一般无隔膜，直径 0.2～0.8 µ m，可产生各种色素。 2、气生菌丝—由基内菌丝从培养基向上伸展的 二级菌丝（颜色较深），直径1～1.4 µ m。
实验三 放线菌的形态观察
一、实验的目的
1、学会用”印片法” 法制作标本片。 2、观察放线菌的群体形态及个体形态 特征。
微生物学3 显微镜油镜的使用和细菌形态的观察
（6） 脱色：用滤纸吸去载玻片上面的残水，将玻片 倾斜，用95％酒精滴洗至流出酒精刚刚不出现紫色 时为止，约20—30s，立即用水冲净酒精。
注意：革兰氏染色结果是否正确，乙醇脱色是整个操 作的关键环节，脱色不足，阴性菌被误染成阳性菌， 脱色过度，阳性菌被误染成阴性菌。
倒立的虚像
图1-1-2 光学显微镜的成像原理
显微镜的放大倍数和分辨率
1.放大倍数=接物镜放大倍数× 接目镜放大倍数 2. 显微镜的分辨率 是表示显微 镜辨析物体（两端）两点之间距 离的能力，可用公式表示为：
D=0.61λ/n·Sinα/2
式中D：物镜分辨出物体两点间 的最短距离。 ：可见光的波长（平均0.55m) n: 物镜和被检标本间介质的折 射率。 ：镜口角（即入射角）。
2、用无菌的接种环挑少量大肠杆菌与右边水滴充 分混合成仅有大肠杆菌的区域，并将少量大肠杆 菌菌液延伸至玻片中央，与金黄色葡萄球菌混合 成含有两种细菌的混合区。
（四）、革兰氏染色的操作方法
涂片 干燥 固定 染色 水洗 干燥 镜检
无菌操作
葡萄球菌
大肠杆菌
（1）涂片：先在载玻片上滴一滴生理盐水，再在菌平
三.显微镜油镜观察操作方法
在高倍镜或低倍镜下找到要观察的样品区域后，然后 将油镜转到工作位置。在待观察的样品区域滴加香柏 油，从侧面注视，用粗调节器使油镜浸在镜油中并几 乎与标本相接。然后用细调节器调节，在目镜下找到 最合适的观察点。
油镜使用毕后：上升镜筒，取下载玻片，用擦镜纸拭 去镜头上的镜油，然后用擦镜纸蘸少许二甲苯（香柏 油溶于二甲苯）擦去镜头上残留的油迹，最后用干净 的擦镜纸擦去残留的二甲苯。
1.涂片为何要固定？固定加热时间过长会怎样? 2.分析影响革兰氏染色结果的因素。
实验三 细菌的简单染色与形态观察
实验三细菌的简单染色与形态观察实验三细菌的简单染色与形态观察实验三细菌的简单染色和形态学观察一、目的要求：1.了解并掌握简单细菌染色的机理和技术；2.学会用油镜观察细菌细胞的形态。
2、实验材料：1株：枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌aureus等培养好的细菌斜面；2.染料：结晶紫3.其他：显微镜、玻片、接种环、酒精灯、无菌水、雪松油、二甲苯、擦镜纸、吸水纸。
3、基本原则：染色是细菌学上一个重要而基本的操作技术。
因细菌细胞小而且透明，当把细菌悬浮于水滴内，用光学显微镜时，由于菌体和背景没有显著的明暗差，因而难以看清它们的形态，更不易识别其结构，所以，用普通光学显微镜观察细菌时，往往要先将细菌进行染色，借助于颜色的反衬作用，可以更清楚地观察到细菌的形状及其细胞结构。
用于微生物染色的染料是苯环上带有显色基团和辅助基团的有机化合物。
显色基团决定了化合物的颜色特征，助色基团决定了化合物的成盐性。
染料通常是盐，分为酸性染料和碱性染料。
在微生物染色中，碱性染料更常用，如亚甲基蓝、结晶紫、碱性红、砂黄、孔雀绿等。
简单染色是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法。
此法操作简便，适于菌体一般形状和细菌排列的观察。
常用碱性染料进行简单染色，这是因为：在中性、碱性和弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，而碱性染料电离后带有正电荷，很容易与菌体结合使细菌着色。
通过本实验，我们可以学习和掌握细菌染色技术，了解细菌细胞的形态，巩固课堂知识，增加感性知识。
四、方法与步骤：（一）制片1.涂片：在洁净无脂的载玻片中央滴一小滴蒸馏水，用接种环以无菌操作从枯草芽孢杆菌从斜面上取少量真菌苔藓，放入水滴中，搅拌均匀，涂膜，涂膜面积约1~1.5cm2。
2.干燥：室温下自然干燥3.固定：手执载玻片一端，使涂菌一面向上，通过火焰2~3次。
此操作也称热固定，其目其主要目的是使细胞质凝固，以固定细胞形状，并使其牢固地附着在载玻片上。
4.染色：将涂片放在水平位置，滴下结晶紫染色液（最好只覆盖涂片），染色1分钟左右。
实验三 鞭毛染色法及活细菌运动性的观察
一、实验目的：
1.学习细菌的鞭毛染色法,观察细菌鞭毛的 形态特征; 2.学习用悬滴法观察细菌的运动性.
二、实验原理：
细菌的鞭毛极细，直径一般为10—20nm，只有用电子 显微镜才能观察到。但是，如采用特殊的染色法，则在 普通光学显微镜下也能看到它。鞭毛染色方法很多，但 其基本原理相同，即在染色前先用媒染剂处理，让它沉 积在鞭毛上，使鞭毛直径加粗，然后再进行染色。常用 的媒染剂由丹宁酸和氯化高铁或钾明矾等配制而成。
三、实验器材
1. 菌种：培养12-16h小时的普通变形杆菌。 2. 标本片：周鞭毛（伤寒杆菌） 3. 试剂：硝酸银鞭毛染色液、生理盐水、蒸馏水、 香柏油、二甲苯。 4. 器材：凹载玻片、盖玻片、镊子、擦镜纸、吸 水纸、接种环，显微镜等。
四、实验方法
（一）鞭毛染色 硝酸银染色法：
1.清洗玻片：选择光滑无裂痕的玻片，最好选用 新的。然后将玻片置洗衣粉过滤液中 （洗衣粉煮沸后用滤纸过滤，以除去粗颗粒）， 煮沸20min。取出稍冷后用自来水冲洗、晾 干，再放入浓洗液中浸泡5—6天，使用前取出 玻片，用自来水冲去残酸，再用蒸馏水洗。将 水沥干后，放入95%乙醇中脱水。
下周实验
四大类微生物菌落及个体形态观察
本次实验课结束
请确保油镜头擦拭干净！ 请第三组同学留下值日
注意事项
①取菌要取菌落边缘的幼龄菌体。 ②取菌后的接种环在载片上的蒸馏水中轻轻沾几下即可， 不要用力太猛，更不能用接种环大幅度涂开；否则鞭毛 易脱落，造成染色失败。 ③鞭毛染色的玻片只能自然干燥，不能用热风吹干，不 能热固定，这是由于加热后菌体易变形，鞭毛易脱落， 影响观察。 ④A、 B染液染完后用蒸馏水（自来水效果差）冲洗时 一定要充分，背景很脏，鞭毛不易被观察到，影响实验 效果。 ⑤加B染液后，将玻片稍加热（但不能太热，更不能沸 腾或蒸干）使其微冒蒸汽，染色效果较不加热为好。 染色用玻片干净无油污是鞭毛染色成功的先决条件。
实验三 细菌的简单染色和革兰氏染色
实验三 细菌的简单染色和革兰氏染色一、目的与要求1、掌握细菌涂片标本的制备2、掌握革兰氏染色法的步骤和关键点3、识别细菌革兰氏染色结果二、实验原理：细菌的涂片和染色是微生物学实验中的一项基本技术。
为什么要对细菌染色？细菌的细胞小而透明，在普通光学显微镜下不易识别，必须对它们进行染色，使经染色后的菌体与背景形成明显的色差，从而能更清楚地观察到其形态和结构。
用于生物染色的染料主要有碱性染料、酸性染料和中性染料三大类。
简单染色法可用以观察微生物的形状、大小及细胞排列状态，是微生物技术中应用广泛，操作简便的染色法。
革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌(G )和革兰氏阴性菌(G-)两大类，是细菌学上最常用的鉴别性染色法。
其原理是利用细菌的细胞壁组成成分和结构的不同。
革兰氏阳性菌的细胞壁肽聚糖层厚，交联而成的肽聚糖网状结构致密，经乙醇处理发生脱水作用，使孔径缩小，通透性降低，结晶紫与碘形成的大分子复合物保留在细胞壁内使细胞呈蓝紫色，而革兰氏阴性菌肽聚糖层薄，网状结构交联少，且类脂含量较高，经乙醇处理后，类脂被溶解，细胞壁孔径变大，通透性增加，结晶紫与碘的复合物被溶出细胞壁，再经番红复染后细胞呈红色。
三、实验器材1、菌种 牛肉膏琼脂斜面28℃培养24h 的大肠杆菌(Escherichia coli)斜面菌种，牛肉膏琼脂斜面28℃培养16h 的枯草杆菌(Bacillus subtilis)斜面菌种；2、仪器 显微镜；3、材料 载玻片，香柏油，二甲苯，擦镜纸，吸水纸，染色缸等。
4、染料 草酸铵结晶紫染色液，路哥氏(Lugol)碘液，95%乙醇，0.5%番红染色液； 细菌的简单染色步骤：细菌的革兰氏染色步骤：涂 片,干 燥,固 定,结晶紫染色,水洗,碘液媒染,水 洗,乙醇脱色,水 洗,番红复染,水 洗,干 燥,镜 检.五、实验关键步骤和注意点：1、玻片要洁净无油，否则菌液涂不开。
2、挑菌量宜少，涂片宜薄，过厚则不易观察。
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[自读教材· 填要点] 一、铁路，更多的铁路 1．地位
铁路是
交通运输 建设的重点，便于国计民生，成为国民经济
发展的动脉。 2．出现 1881年，中国自建的第一条铁路——唐山 路建成通车。 1888年，宫廷专用铁路落成。 至胥各庄铁 开平
3．发展
(1)原因：
①甲午战争以后列强激烈争夺在华铁路的 ②修路成为中国人 (2)成果：1909年 权收归国有。 4．制约因素 政潮迭起，军阀混战，社会经济凋敝，铁路建设始终未入 修筑权 。
”；此后十年间，航空事业获得较快发展。
筹办航空事宜
处
三、从驿传到邮政 1．邮政
(1)初办邮政： 1896年成立“大清邮政局”，此后又设
邮传部 邮传正式脱离海关。
，
(2)进一步发展：1913年，北洋政府宣布裁撤全部驿站； 1920年，中国首次参加 万国邮联大会 。
2．电讯 (1)开端：1877年，福建巡抚在 办电报的开端。 (2)特点：进程曲折，发展缓慢，直到20世纪30年代情况才发生变 化。 3．交通通讯变化的影响
二、实验原理---革兰氏染色
当用结晶紫初染 后，像简单染色法一样，所有细菌都被染 成初染剂的蓝紫色。碘作为媒染剂，它能与结晶紫结合成 结晶紫一碘的复合物 ，从而增强了染料与细菌的结合力。 当用脱色剂处理时，两类细菌的脱色效果是不同的 。革兰 氏阳性细菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成， 壁厚、类脂质含量低，用乙醇(或丙酮)脱色时细胞壁脱水、 使肽聚糖层的网状结构孔径缩小，透性降低，从而使结晶 紫-碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内，经脱色和复染 后仍保留初染剂的蓝紫色。革兰氏阴性菌则不同，由于其 细胞壁肽聚糖层较薄、类脂含量高，所以当脱色处理时， 类脂质被乙醇(或丙酮)溶解，细胞壁透性增大，使结晶紫碘的复合物比较容易被洗脱出来 ，用复染剂复染后，细胞 被染上复染剂的红色。。
细菌的革兰氏染色法及形态观察
细菌的革兰氏染色法及形态观察一、实验目的1．了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。
2．学习掌握革兰氏染色技术，巩固学习光学显微镜油镜的使用方法。
二、基本原理革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C．Gram所创立的。
革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G-）两大类，是细菌学上最常用的鉴别性染色法。
革兰氏染色属于最重要的鉴别染色。
一般认为革兰氏染色结果的主要原因是由于这两类细菌的细胞壁的结构和化学组成不同。
革兰氏阳性菌细胞壁较厚（20-80nm)，主要成分为肽聚糖，网状结构紧密。
而革兰氏阴性菌细胞壁肽聚糖层较薄（2-3nm)，主要成分是脂蛋白和脂多糖。
细菌经过初染和媒染，在细胞内形成深紫色的结晶紫-碘复合物，当用酒精脱色时细胞壁脱水，阳性细菌细胞壁的肽聚糖层网状结构孔径收缩以至关闭，阻止不溶性复合物结晶紫-碘的逸出，这样使菌体呈蓝紫色。
阴性菌脂类物质溶解，结晶紫－碘复合物随之被洗脱出，用复染剂复染后菌体呈复染后的红色。
三、实验器材1．菌种大肠杆菌、藤黄八叠球菌约24小时营养琼脂斜面培养物。
2．仪器普通生物显微镜显微镜3．材料载玻片、香柏油、二甲苯、擦镜纸、滤纸、酒精灯、接种环等4．染料草酸钱结晶紫染色液、路哥氏（Lugol）碘液、95％乙醇、0.5 %番红染色液四、实验流程涂片→干燥→固定→初染1min→水洗→媒染1min→水洗→脱色10-30s→水洗→复染1min→水洗→滤纸吸干→镜检。
五、操作步骤1．涂片取洁净的载片一张，将其在火焰上微微加热，除去上面的油脂，冷却，在中央部位滴加一小滴生理盐水，用接种环在火焰旁从斜面上挑取少量菌体与水混合。
烧去环上多余的菌体后，再用接种环将菌体涂成直径1cm 的均匀薄层，以淡淡的乳白色为宜。
制片是染色的关键，载片要洁净，不得玷污油脂，菌体才能徐布均匀。
注意初次涂片，取菌量不应过大，以免造成菌体重叠。
2．干燥涂布后，待其自然干燥或在酒精灯上方稍微加热，切勿靠近火焰。
实验三 细菌形态观察和革兰氏染色技术
⑥ 复染：
已经脱色处理的细胞或其结构常以复染液作复染 以便于观察。 复染液与初染液的颜色不同而成鲜明对比，所以 复染也称为对比染色。 复染液不宜太强，以免掩盖初染的颜色而失去对 比作用。
用于革兰氏染色的初染液一般是结晶紫。 媒染剂的作用是增加染料和细胞之间的亲和力或附着力，
即以某种方式帮助染料固定在细胞上，使不易脱落。
不同类型的细胞脱色反应不同，有的能被脱色，有的则不
能，脱色剂常用95％的酒精。
复染液也是一种碱性染料，其颜色不同于初染液，复染 的目的是使被脱色的细胞染上不同于初染液的颜色，而未 被脱色的细胞仍然保持初染的颜色，常用的复染液是番红。
三、结果:
② 固定：
染色前必须先行固定。其目的在于凝固细胞质和 其它细胞结构成分而杀死细菌；使菌体粘附于玻 片上以及改变细菌对染料的通透性（因活菌通常 不易使染料透入细胞内）。
固定的方法一般采用火焰加热法，在特殊目的时 也可用冷冻干燥法或化学法如醇、酸、氯化高汞 、重金属盐或氧化剂等进行固定。
③ 媒染：
① 涂片制备：
随标本的种类而略有不同。
• 若为液体培养液，亦可直接涂于载玻片上；
• 若为固体培养基上的细菌，则先取一接种环生理盐水于载玻片中 央，然后从培养基上取菌少许，在盐水中研磨均匀，使呈轻度乳 浊，以接种环扩成1cm2或2份硬币大小的涂面。
在室温下自然干燥或放在火焰上方的热空气中慢 慢烘干。但切忌紧靠火焰烤干。
⑤ 脱色：
脱色：是使被染物脱去已染上的颜色。脱色的目 的是观察细菌与染料结合的稳定程度，故可作为 鉴别染色之用。
凡具有脱色作用的化学试剂称脱色剂。脱色剂或 呈溶媒作用，如醇类、丙酮等；或能影响蛋白质 的电离程度，改变其电荷性质或数量，因而影响 细菌与染料的结合程度，如酸类能减少细菌的负 电荷，故可作碱性染料的脱色剂。
实验三 微生物形态观察及格兰仕染色
七、思考题
1．简述平板上你分离得到的微生物的菌落特征，包括菌落的大小、颜色、隆起程度等，并据此初步区别出大肠杆菌和枯草芽孢杆菌两类微生物。
2.简述曲霉、青霉、根霉和毛霉的菌落颜色及特征。
3.绘制曲霉、青霉、根霉和毛霉的个体形态图，并注明各部位名称。
一般新培养酵母的死亡率应在1%以下，生产上使用的酵母死亡率在3%以下。
2.显微形态检查
载玻片上放一小滴蒸馏水，挑酵母培养物少许，盖上盖玻片，在高倍镜下观察。优良健壮的酵母菌，应形态整齐均匀，表面平滑，细胞质透明均一。年幼健壮的酵母细胞内部充满细胞质；老熟的细胞出现液泡，呈灰色，折光性较强；衰老的细胞中液泡多，颗粒性贮藏物多，折光性强。
3. 死亡率检查
方法同上，可用水浸片法，也可用血球计数板法。酵母细胞用0.025%美兰水溶液染色后，由于活细胞具有脱氢酶活力，可将兰色的美兰还原成无色的美白，因此染不上颜色，而死细胞则被染上兰色。
(1) 菌丝有隔或无隔；
(2) 无性繁殖的方式；
(3) 有性繁殖的方式。
8.你主要根据哪些形态特征来区分上述四种霉菌?
9.你认为哪些环节会影响革兰氏染色结果的正确性？其中最关键的环节是什么？
10.进行革兰氏染色时，为什么特别强调菌龄不能太老，用老龄细菌染色会出现什么问题？
参考文献
1.周德庆. 微生物学实验教程-(第2版).北京：高等教育出版社，2006
2.张玲. 微生物学实验指导. 北京：清华大学出版社，2007
3.夏立梨. 微生物学实验指导. 北京：高等教育出版社，1999
一、实验目的
三、实验材料
酵母培养物。
四、仪器设备及用具
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3.2.3 媒染。先用卢戈氏碘液冲去载片上残留水迹，再用碘液 覆盖1 min，水洗。
3.2.4 脱色。滴加95%乙醇脱色20－30s ,立即水洗。
3.2.5 复染。用吸水纸吸去载片上残留水，用番红复染液染色 2 min，水洗，吸干水迹。
3.2 方法 C. 细菌形态观察
低倍镜观察 4×，10 ×
高倍镜观察 （40×，找到合适观察目标，移至视野中心）
油镜观察（100×） 将高倍镜转离工作位置，在要观察的涂菌部位滴加一滴 镜油，将油镜转至工作位置，聚光器升至最高，调节照明 度，调节细调节器，使物像清晰。
绘图 在所观察的图像中选取典型部位绘图，要求左眼观察图像， 右眼观察绘图；球菌应注意长度与直径之比，球菌应注意排 列状况；有芽胞的细菌应标记芽胞和营养体的位置；图下方 应标明图的名称、放大倍数、染色结果。
3 材料与方法
3.1 实验器材
3.1.1 药品：革兰氏染色液：草酸铵结晶紫染液、革兰氏碘液、 95%乙醇、番红染液，无菌生理盐水。 芽胞染色液：孔雀绿染色液，番红染色液
3.1.2 菌种： Escherichia coli（大肠杆菌）、 Staphylococcus aureus（金黄色葡萄球菌）培养18-24 h菌落平板， Bacillus thuringiensis（苏云金芽孢杆菌）培养24 h菌落平板。
3.2 方法 B. 芽胞染色法
3.2.1 制片：按革兰氏染色方法操作。 （取菌落中央和边缘的菌体）
3.2.2 染色。用试管夹夹住载片，滴加孔雀绿染液3－5滴于涂菌 部位，置酒精灯火焰上加热5－8 min ，加热过程要随时滴加染色 液，防止煮沸或干涸。 3.2.3 水洗：载片冷却后水洗。
3.2.4 复染。用番红染色液染色1 min 。水洗，干燥。
Thanks！
3.1.3 仪器：显微镜（MODEL E100） 3.1.4 其它物品：载玻片，镜油，二甲苯，擦镜纸，接种环，
酒精灯等。
3.2 方法 A. 革兰氏染色法
3.2.1 制片。涂片:取一洁净载片，用记号笔从中分成两个区域， 在两区中央各滴一小滴生理盐水，按无菌操作要求用接种环取平 板菌落边缘的菌体少许，置于生理盐水中涂抹成约1.5 cm均匀薄 膜；干燥:自然干燥(或电吹风干燥)；固定：将涂面朝上，通过 火焰2－3次。（教师示范）
实验三 细菌的染色及形态观察
精品jin
2 实验原理(通过了解下列问题来掌握实验原理)
2.1 观察微生物细胞时，为什么要对微生物进行染色?革兰氏染 色与细菌细胞壁的结构与成分有什么关系？芽胞染色的机理是 什么？ 2.2 显微镜油镜为什么能增加照明亮度?，为什么能增加分辨率？
革兰氏染色法 芽胞染色法