第3单元免疫凝集类实验

❖ 凝集反应只有在抗原抗体比例适当时，才能出现肉眼可见的凝 集现象。
❖ 临床上开展的外斐反应是利用与立克次体有共同耐热性多糖抗 原的变形杆菌OX19、OX2、OXk菌株代替立克次体作为已知抗原 ，与患者血清进行凝集试验，以辅助诊断斑疹伤寒、恙虫病等 立克次体疾病。
❖ 现有OX19、OX2、OXk三种诊断菌液和待测血清，请写出利用 试管凝集法进行的外斐试验的操作步骤。
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第3单元免疫凝集类实验
结果分析
❖ 将载玻片置黑色背景上观察。 ❖ 在诊断血清中，混悬液由混浊变澄清并出凝集物，则
为阳性结果；混悬液仍为匀混浊的乳状液，则为阴性 结果。 ❖ 肉眼观察不够清晰者，可在低倍镜下观察。
第3单元免疫凝集类实验
实验讨论
❖ 肥大试验是一种经典的半定量试管凝集试验。在临床上主要用 已知的伤寒沙门菌O或H抗原检测血清中有无相应的特异性抗体 及其效价，以协助诊断伤寒病或供流行病学调查。
第3单元免疫凝集类实验
实验方法（Widal test）
1. 取试管7支，依次编号并做好标记。 2. 每支试管中加生理盐水0.5ml。 3. 倍比稀释血清：
取1∶20稀释的待测血清0.5ml加入到第1管，混匀后 吸取0.5ml加入到第2管，如此连续稀释至第6管，混匀后 吸取0.5ml弃去；第7管不加血清作为阴性对照。 4. 加诊断菌液：
每管加伤寒沙门菌H或O诊断菌液0.5ml，此时各管 血清最终稀释度依次为1∶80、1∶160、1∶320、 1∶640、1∶1280、1∶2560 5. 摇匀后置37℃水浴2～4h，取出观察结果或放室温过夜， 次日观察结果。
第3单元免疫凝集类实验
试管凝集法操作程序
试管号
1
生理盐水（ml) 0.5 待测血清（ml) 0.5 伤寒O菌液(ml) 0.5 血清稀释度 1:80
第三单元
免疫凝集类实验
第3单元免疫凝集类实验
验证实验一 直接凝集实验
第3单元免疫凝集类实验
❖颗粒性抗原与相应抗体直接反应，在适当电解 质参与下出现的肉眼可见的凝集现象。
❖ 常用的试验方法有玻片凝集法和试管凝集法。 ❖本 实 验 以 试 管 法 凝 集 试 验 —— 肥 大 试 验
（Widal test）验证凝集反应及其特点。
第3单元免疫凝集类实验
Widal test原理
将已知的颗粒性抗原（伤寒沙门菌）定量 加入到系列倍比稀释的待测血清中，根据各血清 稀释度凝集情况，测定血清中有无相应抗体及其 相对含量。
第3单元免疫凝集类实验
实验器材和材料
❖ 器械
试管、吸管、恒温水浴箱等
❖ 试剂
抗体 待测伤寒沙门菌免疫血清、抗原 伤寒沙门菌诊 断菌液（7×108/ml)、生理盐水
第3单元免疫凝集类实验
思考题
为什么临床上不直接利用立克次体作为已知抗 原进行血清学诊断呢？
第3单元免疫凝集类实验
验证实验二 间接凝集实验
第3单元免疫凝集类实验
❖间接凝集实验（indirect Agglutination Test)
将可溶性抗原（或抗体）先吸附于一种与免疫无关、大小 均匀的惰性载体颗粒表面，使其成为致敏载体，然后再与 相应抗体（或抗原）结合，在适当电解质存在的条件下， 载体颗粒被动地发生凝集，出现肉眼可见的凝集现象。
1 生理盐水
+ 伤寒杆菌
1:40 伤寒杆菌诊断学清 +
伤寒杆菌
2 生理盐水
+ 大肠杆菌
1:40 伤寒杆菌诊断学清 +
大肠杆菌
玻片凝集试验鉴定伤寒沙门菌
第3单元免疫凝集类实验
玻片凝集试验 (slide agglutination test)
在玻片上
颗粒性抗原与相应 抗体直接结合
出现肉眼可见的凝 集现象
2
0.5 0.5
0.5 1:160
3
0.5 0.5
0.5 1:320
4
5
6
7
0.5 0.5
0.5 1:640
0.5 0.5
0.5 1:1280
0.5
0.5
0.5
0.5 0.5
1:2560
第3单元免疫凝集类实验
0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 弃掉0.5
菌液
试
1 2 3 45 6 7
管
凝
集
试
验
实验方法
❖ 待测血清、阳性血清、阴性血清分别用生理盐水作1∶20 稀释。
❖ 在黑色方格反应板上取3个格，用毛细滴管分别滴加稀释 待测血清、阳性血清、阴性血清各1滴，然后每格加入人 IgG致敏胶乳试剂1滴。
❖ 以胶乳凝集试验检测类风湿因子（rheumatoid
factor,RF）为例验证间接凝集实验的原理和特点
第3单元免疫凝集类实验
实验原理
类风湿因子（RF）是一种抗变性IgG的自身抗体， 具有与人或动物变性IgG结合的特点。将处理过的人IgG 与聚苯乙烯胶乳颗粒结合成致敏颗粒，当待测血清中含 有RF时，则与致敏颗粒上变性的IgG发生反应，出现凝 集现象。
第3单元免疫凝集类实验
胶乳颗粒 人IgG
致敏
待测RF
乳致 敏 胶
NS
粒凝 集 颗
第3单元免疫凝集类实验
实验器材
❖ 器械 黑色方格反应板、毛细滴管、试管、试管架、吸
耳球、恒温水浴箱等 ❖ 试剂
人IgG致敏胶乳试剂（市售类风湿因子检测试剂） 类风湿因子阳性血清和阴性血清：临床标本筛选获得 待测血清
第3单元免疫凝集类实验
第3单元免疫凝集类实验
注意事项
❖ 凝集反应只有在抗原抗体比例适当时，才能出现肉眼可见的反应 一般情况下，随着血清浓度的逐渐稀释，凝集反应越来越弱，但在抗 体浓度过高时，反而无凝集现象出现，此为前带现象，出现该情况时， 须加大抗体稀释倍数重新试验。
❖ 直接凝集试验也可以用玻片法 以鉴定伤寒沙门菌为例：取洁净载玻片2张，在玻片的左上角分别标明 “1”、“2”； 加入已知抗体（伤寒沙门菌诊断血清）和待测菌液 （伤寒沙门菌或其他细菌）。
结
原
果
理
第3单元免疫凝集类实验
结果判断
❖ 实验结果
将试管置于有良好光源和黑色背景下，观察管底凝集物的范围和上清 液的浊度，记录凝集程度，判断凝集效价用++++、+++、++、+、 -等符号记录凝集效价。
❖ 对照管：应无凝集现象 ❖ 试验管：“++++”：上清液澄清，细菌全部凝集，凝集块全部沉于管底
“+++”：上清液稍混浊，细菌大部分凝集并沉于管底 “++”：上清液较混浊，约50%的细菌凝集并沉于管底 “+”：上清液混浊，仅少量细菌凝集 “-”：不凝集，液体浊度与对照管相同
❖ 血清抗体效价：试验管出现“++”以上的凝集现象即可判断为阳
性；以出现“++”凝集的最高血清稀释度为该待测血清的抗体效价。