MMFSCNG饲料中维生素D的测定
饲料中维生素检测方法概述
维生素作为饲料中的重要组成部分，是一组化学结构不同、生理作用和营养功能各异的化学物质。
因此，在饲料中是否加入维生素、维生素量是否达标、对动物的生长发育会产生很大影响。
本文从饲料中常用维生素的检测方法入手，提出不同维生素的不同检测方式，旨在进一步精确维生素的用量标准，提高养殖企业的经济效益，促进动物的生长发育。
1不同维生素检测措施简述首先选取试样2～3g，添加氯仿10mL并进行充分研磨，随后过滤或静置，取少许绿叶或上清液于小试管，向小试管内滴加乙酸肝6滴，进行充分摇匀，沿管壁两滴硫酸。
完成后仔细观察液面的变化，若含有V D3，则在硫酸与液面接触时试液应立即显蓝色，随着时间的流逝逐渐转为紫红色。
在操作过程中，注意硫酸与样品接触时立即显现蓝色，通常情况下不会看到有黄变红的变化。
同时必须要将样品充分研磨，大多数商品V D3都是包膜微粒，必须进行充分研磨才能促使V D3释放出来。
在添加硫酸时最好不要摇匀，而是选择让其沿着试管壁缓缓接触液面，并观察硫酸与液面接触时那一刹那的颜色变化，若添加硫酸时对其进行晃动则很可能错过反应现象。
高效液相色谱法可以检测V K3，并辨别V K3的真伪，这一方法主要是用于配合饲料、复合预混合饲料和维生素预混合饲料。
用高效液相色谱测定V K3，V K3经反相C18柱得到分离，检测器在一定波长下进行检测，外标法计算。
在测量时要尤其强调在维生素预混合饲料、复合预混合饲料、浓缩饲料、配合饲料中V K3所含有的量都不相同，样品的取样量、三氯甲烷体积、提取液稀释倍数都不相同，要特别注意换算。
V B2微溶于水，溶于水中呈现出强烈的黄绿色荧光，在稀释液中其荧光强度与核黄素浓度呈正比。
而待测样品大多为非单一成分，多数较为复杂，其中存在许多干扰物质，且难以消除，会对实验结果的准确性造成影响，为切实解决这一问题，需要引入新型且高效的处理操作方法以及仪器检测措施，例如改变检测技术，促使同步荧光固定波长差法的应用，准确测定功能性食品中的V B2含量，这一方法简便快捷，散射光影响小，适合于测定混合物。
维生素D测定方法
维生素D测定方法维生素D的测定方法，目前只有“婴幼儿配方食品和乳粉通用检验方法”介绍的GB/T 5413.9-1997所列的先正相收集，后反相分离的H PLC测定方法。
该法可同时测定 A.D.E，但操作比较烦琐，对于维生素的营养素补充剂，样品中杂质干扰小，在测定A.E的同时可控制采样量和色谱的分离条件，并参照GB/T 5413.9-1997与G B/T 5009.82-2003（食品中维生素A和维生素E的测定）的方法检测营养补充剂维生素D也可同时测定A.E。
一、原理样品中维生素D经热皂化处理后。
用HPLC紫外检测，内标法定量。
二、仪器1、HPLC：water公司，510泵，486紫外检测器，三锐色谱工作站。
2、超声波振荡器3、水浴箱4、0.45μ滤膜三、试剂1、维生素D3标准对照品：精确称取维生素D3标准对照品（sigma公司）5.0mg 左右加已脱醛处理的无水乙醇至50ml刻度，配成100μg/ml的标准D3贮备液。
2、维生素D贮存一般较稳定，贮备液也可在264μn下按常规的标定方法用比吸光系数计算出维生素D3的标准浓度。
维生素D3比吸光系数E1%cm=493。
3、其他试剂：无水乙醚，无水乙醇，无水硫酸钠，甲醇，抗坏血酸，氢氧化钾，内标苯并e芘……等同GB/T 5009.82-2003或G B/T 5413.9-1997四、方法1、准确称取经研碎成粉状的均匀样品2.0g于皂化瓶中，加内标苯并e芘溶液2.0ml，加10%抗坏血酸5m l，样品先混成均匀的糊状，再加无水乙醇30ml同1：1氢氧化钾溶液10ml在沸水上皂化10分钟，使皂化完全，皂化后立即放入冰中冷却。
2、提取、洗涤、浓缩等步骤同GB/T 5009.82-2003，最后用无水乙醇定容至2ml。
测定饲料添加剂中维生素A、D3、E含量的新方法
１２标 准 溶 液 的 配 制 ．
醇 ． 摇 １ｍ ｎ使 样 品分 散 后 ． 入 ３ 氢 氧 化 旋 ｉ 加 ０ｍｌ
钾 溶 液 （０ ／）通 入 氮气 ３ ｉ 瓶 内空气 赶 尽 ， ５ ０ｇ 。 １ ａ ｒ ｎ把
Hale Waihona Puke 迅 速盖 好 瓶塞 ．并 用保 鲜膜 和 橡皮 筋 把瓶 塞扎 实 。 在 室 温 （ ０ ３ ℃） ２ ～ ０ 条件 下 避 光 放置 ２ ～ ５ ， 间旋 ３ ２ ｈ其
【 摘要１ 出用 充 入 氮 气和 放 置 皂 化 过 夜 的 方 法 同时 测 定 提
Ｅ 酸酯 的含 量 分 别 为 １ ／ 、， ｍ ／ ｌ １ 乙 ， ｍｇ ０１ ｇｍ 和 ． ０ ｍｌ ２
ｍｇ ｍｌ ／ 。
饲 料 添 加 剂 中维 生 素 Ａ、 Ｅ的 含 量 。 试 样 中加 入 抗 氧 化 Ｄ、 在
第 二 次 相 同 。收集 三 次 萃 取液 于 ５０ｍ１ 液 漏斗 ０ 分
中， 依次 用 ｌ 、 ０ｍｌ８ｍ 氯化 钠 溶 液 （ ０ｇ１ ２ｍｌｌ 、 ｌ ５ ／）
摇 ３ ５次 。 —
１ ． 取 ： 品皂 化完毕后 ， 次用 ６ ｌ ． ２萃 ４ 样 依 ０ｍ 、 ５ ｌ４ 乙醚 萃 取 。第 一 次 加入 ６ ｌ 醚加 ０ｍ 、０ｍｌ ０ｍ 乙
塞 充 分 振 荡 ． 置 分 层 后 收集 上 层 有 机层 ： 二次 放 第
维 生 素 Ａ 乙 酸酯 、 生 素 Ｄ 和维 生 素 Ｅ乙酸 维 酯 标 准储 备 液 ： 确称 取 ５ 维 生 素 Ａ 乙酸 酯 、 准 ０ｍｇ ５０ｍ ． ｇ维生 素 Ｄ 和 ６ ｇ维 生 素 Ｅ乙酸 酯标 准 品 ３ ０ｍ
于 ５ ｌ 量 瓶 中 ， 甲醇 定容 到 ５ １摇 匀 ． Ｏｍ 容 用 ０ｍ ． 此
MM FS CNG 婴幼儿配方食品和乳粉维生素A D E的测定
MMFSCNG0216 婴幼儿食品乳粉维生素A 维生素D 维生素E 液相色谱法MM_FS_CNG_0216婴幼儿配方食品和乳粉维生素A、D、E的测定1.适用范围本方法适用于各种婴幼儿配方食品和乳粉中维生素A、D、E的测定。
2.原理概要样品中脂溶性维生素在皂化过程中与脂肪分离，经(用)石油醚萃取后，用高压液相色谱，紫外检测器定量测定。
3.主要试剂和仪器3.1.主要试剂高峰氏淀粉酶(Taka-Diastase)。
焦性没食子酸的乙醇溶液：15g/L。
氢氧化钾溶液：质量比为100∶50。
石油醚：沸程30～60℃。
甲醇、正己烷、异丙醇、环己烷：色谱纯。
维生素A、E标准溶液：维生素A标准贮备液（含维生素A100μg/mL的甲醇溶液）：称取10mg的维生素A，用甲醇定容于100mL容量瓶中。
维生素E标准贮备液，含维生素E400μg/mL的甲醇溶液：称取40mg的维生素E，用甲醇定容于100mL容量瓶中。
维生素A、E标准工作液，其中维生素A的浓度为2μg/mL，维生素E的浓度为20μg/mL：取1mL维生素A标准贮备液和2.5mL维生素E标准贮备液于50mL容量瓶中，用甲醇溶解。
维生素D标准溶液：维生素D2标准贮备液，含维生素D2100μg/mL的甲醇溶液：称取10mg的维生素D2，用甲醇定容于100mL容量瓶中。
维生素D3标准贮备液，含维生素D3100μg/mL的甲醇溶液：称取10mg的维生素D3，用甲醇定容于100mL容量瓶中。
维生素D标准工作液，其中维生素D2、维生素D3的质量浓度均为1μg/mL：取维生素D2标准贮备液1mL，维生素D3标准贮备液1mL于100mL容量瓶中，用甲醇定容。
3.2.仪器250mL平底烧瓶、500mL分液漏斗、旋转蒸发器。
高压液相色谱仪：具有可变波长的紫外检测器、数据处理系统或记录仪。
4.过程简述4.1.样品处理含淀粉的样品：准确称取10g样品放入250mL平底烧瓶中，加入1gTaka淀粉酶，再加入30mL45～50℃的蒸馏水，混合均匀后，用氮气排除瓶中空气，盖上瓶塞，置45℃烘箱内30min。
MMFSCNG婴幼儿配方食品和乳粉肌醇的测定
MMFSCNG0207 婴幼儿食品乳粉肌醇微生物法气相色谱法MM_FS_CNG_0207婴幼儿配方食品和乳粉肌醇的测定1.适用范围方法一适用于婴幼儿配方食品和乳粉中肌醇的测定,方法二适于乳粉中肌醇的测定.方法一：微生物法2.原理概要：通过Saccharomyces uvarum的生长情况来评价肌醇的含量。
3.主要试剂和仪器3.1.主要试剂、菌种和培养基盐酸（体积比为1∶1）、氢氧化钠(1mol/L)、肌醇标样（无水晶体）。
菌种：Saccharomyces uvarum。
培养基：链孢霉菌琼脂培养基:3号蛋白胨5g,酵母浸膏5g，麦芽糖40g，琼脂15g。
肌醇测定用培养基：葡萄糖100g，柠檬酸钾10g，柠檬酸2g，磷酸二氢钾1.1g，氯化钾0.85g，硫酸镁0.25g，氯化钙0.25g，硫酸锰50mg，氯化亚铁50mg，DL-色氨酸80mg，L-胱氨酸0.1g，L-异亮氨酸0.5g，L-赖氨酸0.5g，L-蛋氨酸0.2g，DL-苯基丙氨酸0.2g，L-酪氨酸0.2g，L-天门冬酰胺0.8g，DL-天门冬氨酸0.2g，DL-丝氨酸0.1g,甘氨酸0.2g,DL-苏氨酸0.4g,L-缬氨酸0.5g,L-组氨酸0.124g，L-脯氨酸0.2g,DL-丙氨酸0.4g,L-谷氨酸0.6g,L-精氨酸0.48g,盐酸硫胺素500μg,生物素16μg,泛酸钙5mg,盐酸吡哆醇1mg,加蒸馏水至1000mL,pH5.2±0.2(25℃)。
3.2.仪器pH计；比色仪；250mL圆底烧瓶，与冷凝器连接的锥形玻璃接头。
4.样品制备4.1.贮备菌种的制备从纯菌种S.uvarum中转接2个以上已制备好的麦芽浸出汁琼脂斜面。
30℃培养16～24h。
贮于冰箱中，保存期不要超过2周，然后再转接到新的琼脂斜面上。
接种的准备：最好在使用的当天从贮备菌种中转接到新配制的麦芽浸出汁琼脂斜面上，30℃培养16～24h。
用接种环无菌地转接该菌种到一个灭菌生理盐水中，直到得到一定浓度菌体细胞的悬浮液。
饲料添加剂维生素A／D3微粒
4.6.3.2.1.测试条件
高压液相色谱仪；
紫外检测器：波长254nm；
分析柱：硅胶柱Lichrosorb Sibo 5 µm；
流动相：正已烷:正戊醇=1000:3；
流速：2.0mL/min；
灵敏度：0.05AUFS。
4.6.3.2.2.测试方法：用微量注射器，准确吸取上述试液500µL注进分析柱，记录所得色谱峰。
6.1.2.标签内容
生产厂名、产品名称、注册商标、批准文号、批号、净重、规格。
6.2.包装
内衬二层聚乙烯袋，密封，盛于外包装容器内。
6.3.运输
运输必须有遮盖物，避免日晒，雨淋，受热及撞击，搬运装卸小心轻放，不得倒置，不得与有毒物质混装、混运。
6.4.贮存.
应保存于阴凉干燥的仓库中，避免受潮进水和受热，本品不得与有毒、有害或有酸味物质一起堆放。原包装负责期为一年。
Vin──内标物稀释倍数；
Ws──供试品称量，g。
A2 FD(校正因子)的测定与计算
分别准确吸取VD3标准贮备液5mL和内标贮备液5mL，放入50mL棕色量瓶中，加正已烷稀释至刻度，混匀，过滤，取100µL过滤液注入分析柱。
计算：
式中：pin──内标峰响应值；
Wr──VD3标准品称量，g；
Vin──内标稀释倍数；
4.3.2.称取本品100mg，加氯仿10mL研磨数分钟过滤，取滤液5mL，加乙酸酐0.3mL，硫酸0.1mL，振摇，初显黄色，渐变红色，迅即变为紫色，最后呈绿色，(VD3)。
4.4.颗粒度检查
取本品适量倾入筛网中，适当振摇，应100%通过。
4.5.干燥失重
4.5.1.测试方法
称取本品1g，(称准至0.0002g)置于已干燥至恒重的称量瓶中，置电热恒温箱中，保持105℃干燥至恒重，减失重量，不得超过5.0%。
MMFSCNG谷物不溶性膳食纤维测定法
MM_FS_CNG_0271谷物不溶性膳食纤维称量法MM_FS_CNG_0271谷物不溶性膳食纤维测定法1.适用范围本方法适用于谷物不溶性膳食纤维的测定。
2.原理概要谷物样品经中性洗涤剂溶液浸煮，残渣用热水充分洗涤后，加入α-淀粉酶溶液以分解残留的结合态淀粉，再用水、丙酮洗涤，烘干，即为不溶性膳食纤维。
3主要试剂和仪器3.1.主要试剂提取装置：由瓶口装有冷凝器的300mL锥形瓶和可将100mL水在5～10min 内由室温升至沸腾的可调电热板组成；-2玻璃过滤坩埚（2号滤片，30mL容积）；F3电热烘箱；电热培养箱：温度保持在37±2℃；干燥器：装有有效干燥剂；过滤装置：由玻璃过滤坩埚和吸滤瓶组成，用水泵或真空泵抽滤；粉碎机。
3.2.仪器十二烷基硫酸钠：化学纯；乙二胺四乙酸二钠（EDTA）；四硼酸钠；磷酸氢二钠；乙二醇一乙醚：化学纯；十氢萘：化学纯；无水亚硫酸钠；石油醚：沸程范围30～60℃；磷酸二氢钠；丙酮；α-淀粉酶1)（酶活性不低于每毫克800A）；注：1）可采用上海生物化学研究所试剂厂生产的α-淀粉酶结晶冻干粉或类似产品。
酶活测定方法见GB 9826《小麦粉破损淀粉测定法α-淀粉酶法》附录A（补充件）α-淀粉酶活性的测定。
甲苯：化学纯；中性洗涤溶液的制备：将18.61g乙二胺四乙酸二钠和 6.81g四硼酸钠用150mL水加热溶解，另将30g十二烷基硫酸钠和10mL乙二醇一乙醚溶于700mL 热水中，然后加入到第一种溶液中。
4.56g磷酸氢二钠溶于150mL热水中，加入到第一种溶液中。
如果需要，用磷酸调节pH到6.7～7.1，使用时若有沉淀形成，可加热到60℃使沉淀溶解；α-淀粉酶溶液的配制：用0.1mol／L磷酸氢二钠和0.1mol／L磷酸二氢钠溶液各500mL，混匀，配成0.1mol／L磷酸缓冲液；称取12.5mg α-淀粉酶，用0.1mol／L磷酸缓冲液溶解，定容至250mL。
MM_FS_CNG_0220 婴幼儿配方食品和乳粉维生素B6的测定
婴幼儿配方食品和乳粉维生素地测定.适用范围本方法适用于婴幼儿配方食品和乳粉中维生素地测定..原理概要样品经热水萃取等前处理后，经色谱柱分离，荧光检测器检测，外标法定量维生素(吡哆醇、吡哆醛、吡哆胺)地含量..主要试剂和仪器.主要试剂高峰氏淀粉酶、冰乙酸(优级纯)、无水甲醇(色谱纯)、辛烷磺酸钠(优级纯). 盐酸溶液：.氢氧化钠溶液：、.三乙胺：体积分数≥％.吡哆醇、吡哆醛、吡哆胺标准贮备溶液(μ)：准确称取吡哆醇、吡哆醛、吡哆胺标准品各，用水溶解并定容至容量瓶中.吡哆醇、吡哆醛、吡哆胺标准工作溶液(μ)：取标准贮备溶液，用水定容至. .仪器超声波振荡器、酸度计.高压液相色谱仪：带荧光检测器.色谱柱：μ×，或具有同等性能地色谱柱..过程简述.样品预处理含淀粉地样品：精确称取样品，放入锥形瓶中，加入淀粉酶，再加入～℃地蒸馏水，混合均匀后，用氮气排除瓶内空气，盖上瓶塞，置℃烘箱内，取出冷却至室温.不含淀粉地样品：精确称取样品，放入锥形瓶中，加入℃地蒸馏水，振摇，静置～，使样品充分溶解并降至室温..测定液地制备用盐酸溶液慢慢调节样品溶液地值至，放置约，再用氢氧化钠溶液调节样品溶液地值至.将样品溶液转移到容量瓶中，用蒸馏水反复冲洗锥形瓶，洗液合并于容量瓶中，并用水定容至.把上述容量瓶放入超声波水浴中，振荡.另取容量瓶，上面放入三角漏斗和滤纸，把样品溶液倒入其中，自然过滤.滤液再经μ微孔滤膜加压过滤，用试管收集，即为样品待测液..色谱条件检测灵敏度为.检测器条件为荧光激发波长：，发射波长为.柱温为℃.流速为流动相：体积分数为％地甲醇、辛烷磺酸钠、体积分数为％地三乙胺水溶液，用乙酸调＝..定量分析(外标法)注射一定量地标准工作液进入色谱仪，得到组分地峰高(或峰面积)；注射等体积地样品待测液进入色谱仪，得到组分地峰高(或峰面积)..结果计算样品中维生素地含量()＝醇十醛十胺………………()注：样品中维生素含量是各组分地含量之和.样品中各组分含量()＝×××………………………() ××式中：——样品组分地峰高或面积；——标准工作液中组分地峰高或面积；——标准工作液中组分地质量浓度，μ；——样品地质量，；——样品溶液体积，..允许差同一样品两次测定值之差不得超过两次测定平均值地％. .来源：中国国家标准：—。
某某公司MMFSCNG 动植物油脂中不溶性杂质含量的测定(一)
某某公司MMFSCNG 动植物油脂中不溶性杂质含量的测定(一)某某公司MMFSCNG 动植物油脂中不溶性杂质含量的测定动植物油脂中的不溶性杂质是指无法在油脂中溶解的杂质，如沙子、碎屑等。
这些杂质的含量会影响油脂的品质和稳定性，因此准确测定不溶性杂质含量对油脂行业非常重要。
某某公司MMFSCNG通过了解市场对不溶性杂质含量的要求，对动植物油脂中的不溶性杂质含量进行了测定。
下面对该公司的测定方法和技术实现进行介绍。
1. 测定方法该公司采用了国家标准《食用植物油、动物油脂和其制品中不溶性杂质的测定》（GB/T 5512-2008）中的方法进行测定。
该方法采用玻璃滤器和石棉滤器两种滤器进行过滤，测定过程中加入了石油醚提取和氢氧化钠溶液清洗的步骤，能够准确测定动植物油脂中的不溶性杂质含量。
2. 技术实现在测定过程中，该公司比较关注的是滤器的选择和操作，以保证测定结果的准确性。
首先，玻璃滤器和石棉滤器在测定过程中的筛选要求非常严格，必须符合国家标准要求的质量标准。
其次，操作人员要按照标准要求进行滤器的使用和清洗，避免污染和误差发生。
最后，在实际测定中，该公司还采用了一些辅助手段，如加入适量的石油醚、掌握测定温度和滤液回收等，以提高测定准确性和效率。
3. 结果呈现经过该公司的测定，该公司的动植物油脂中不溶性杂质含量达到了国家标准要求，且准确度较高。
公司可以通过该测定方法准确掌握油脂的品质和稳定性，有助于提高产品的质量和市场竞争力。
综上所述，对动植物油脂中不溶性杂质含量的测定对油脂行业至关重要，某某公司MMFSCNG能够准确地测定不溶性杂质含量，为提高产品质量和市场竞争力提供了保障。
混合饲料,预混合物和爱畜食品中的维生素D化学分析方法
混合饲料，预混合物和爱畜食品中的维生素D维生素和其它营养物液相色谱法〔适用于含维生素D<200IU和>2IU的制品。
对于每克含维生素D大于等于200IU的制品，采用24-18方法〕A原理样品经皂化提取，不皂化物连续在氧化铝柱上进行色谱分离，以除去可能存在的生育酚和胡萝卜素类，并在LC净化柱上分离干扰物质。
第二根LC柱充填硅胶，将维生素D同杂质分离开。
在皂化过程中生成一定量的维生素D前身，所以维生素D需校正。
维生素D是维生素D与维生素D前身之总和。
B试剂B.a溶剂CH3OH、乙醇、CH3CN、甲苯、不含过氧化物和酸的乙醚、正已烷〔色谱纯〕。
正已烷通过60×8cm〔直径〕内充填有500g经150℃干燥4h，粒度为50－250μm硅胶的柱子，干燥。
B.b抗坏血酸钠溶液将3.5g抗坏血酸溶解于20ml1NNaOH中。
B.c抗氧剂溶液1mg丁基羟甲基〔BHT〕/ml已烷。
B.d石油醚于粒状KOH上回流，收集40℃至60℃馏分。
B.e醚石油醚洗脱液。
(8+92)和(40+60)。
B.f氧化铝中性。
B.g流动相〔用于净化柱〕CH3CH-CH3OH-H2O(50+50+5)B.h流动相〔分析柱用〕正已烷含0.35%(v/v)正戊醇溶液。
B.i维生素D标准溶液麦角钙化醇参比标准。
〔如样品标明含维生素D2〕或胆钙化醇〔如标明含维生素D或D3〕。
精确称取维生素D标准约12.5mg(W')置于100ml棕色容量瓶中，不加热溶于甲苯中，用甲苯稀释并定容〔125μg/ml，溶液A〕，将10ml溶液A用流动相(h)稀释至100ml，将此液10ml用甲苯-流动相(h)(5+95)稀释至100ml作为维生素D标准〔溶液B〕〔1.25μg/ml，50IU/ml〕；又将A液10ml用流动相(g)稀释至100ml，稀释此液20ml用流动相(g)至100ml〔2.5μg/ml，溶液C〕。
B.j系统适应性标准溶液采用维生素D测定系统适应性参比标准，或制备每克植物油含2mg 维生素D3及0.2mg反式维生素D3的溶液。
MMFSCNG饲料中维生素D的测定
MM_FS_CNG_0229 饲料维生素D3高效液相色谱法MM_FS_CNG_0229饲料中维生素D3的测定1.适用范围本方法适用于配合饲料、浓缩饲料、复合预混料和维生素预混料中维生素D 3的测定。
测量范围为每千克样品中含维生素D3(胆钙化醇)的量在500IU以上。
2.原理概要用碱溶液皂化试验样品，乙醚提取未皂化的化合物，蒸发乙醚，残渣溶解于甲醇并将部分溶液注入高效液相色谱净化柱中除去干扰物，收集含维生素D3淋洗液馏分，蒸发至干，溶解于正已烷中，注入高效液相色谱分析柱，用紫外检测器在264nm处测定，通过外标法计算维生素D3的含量。
当样品中维生素D3标示量超过每千克10000IU时，可省去高效液相色谱净化柱，试验溶液直接注入色谱分析柱分析。
3.主要试剂和仪器3.1主要试剂无水乙醚：无过氧化物过氧化物检查方法：用5mL乙醚加1mL10%碘化钾溶液，振摇1min，如有过氧化物则放出游离碘，水层呈黄色。
若加0.5%淀粉指示液，水层呈蓝色。
该乙醚需处理后使用。
去除过氧化物的方法：乙醚用5%硫代硫酸钠溶液振摇，静置，分取乙醚层，再用蒸馏水振摇洗涤两次，重蒸，弃去首尾5%部分，收集馏出的乙醚，再检查过氧化物，应符合规定。
乙醇；正己烷：重蒸馏(或光谱纯)；1,4-二氧六环；甲醇：优级纯；2,6-二叔丁基对甲酚(BHT)；无水硫酸钠；氢氧化钾溶液（500g/L）；抗坏血酸乙醇溶液（5g/L）：取0.5g抗坏血酸结晶纯品溶解于4mL温热的蒸馏水中，用乙醇稀释至100mL，临用前配制。
氯化钠溶液（100g/L）。
维生素D3标准溶液：维生素D3标准贮备液：准确称取50.0mg维生素D3(胆钙化醇)USP结晶纯品，于50mL棕色容量瓶中，用正已烷溶解并稀释至刻度，4℃保存。
该贮备液的浓度为每毫升含1 mg维生素D3；维生素D3标准工作液：准确吸取维生素D3标准贮备液，用正已烷按1∶100比例稀释，该标准溶液浓度为每毫升含10μg(400IU)维生素D3；酚酞指示剂乙醇溶液（10g/L）；氮气（99.9%）。
维生素D的测定
• 冷却后转移到分液漏斗中，用石油醚反复萃取，萃取 液浓缩，最后用1mL正乙烷溶解备用。
• 2.正向硅胶柱富集
• 推荐HPLC条件： • 色谱柱：4mm x 30cm，硅胶柱； • 流动相：正乙烷与环乙烷按体积比1:1混合，并按体积 分数0.8%加入异丙醇； • 流速：1mL/min； • 柱温：20℃； • 检测波长：265nm • 注射50μL维生素D标样（1μg/mL）和200μL样品溶液， 很据维生素D标样保留时间收集样品于试管中，将试 管用氮气吹干，准确加入0.2mL甲醇溶解，供检测用。
• 3.反相C18柱检测
• • • • • • • 推荐HPLC条件： 色谱柱：4.6mm x 25cmC18或同等性能色谱柱； 流动相：甲醇； 流速：1mL/min； 柱温:20℃ 检测波长:265nm. 注射50μL维生素D标准溶液和50μL样品溶液，得到 标样和样品溶液中维生素D峰面积或峰高。很据峰 面积（或峰高）的比值求出样品中维生素D的含量。
•
维生素D缺乏时具体表现为
其突出的表现是小儿的佝偻病和成人的骨 软化症并同存骨质疏松症，同时影响神经、 肌肉、造血、免疫等组织器官的功能，严重 影响儿童的生长发育。
维生素D的主要来源
• 维生素D主要来源于动物性食物，植物性食物 几乎不含有维生素D。 • 主要存在于海鱼、动物肝脏、蛋黄和瘦肉中。 • 脱脂牛奶、鱼肝油、乳酸、坚果和海产品、添 加维他命D的营养强化食品，也含有丰富的维 生素D。 • 维生素D的来源与其他营养素略有不同，除了 食物来源之外，还可来源于自身的合成制造， 但这需要多晒太阳，接受更多的紫外线照射。 • 经常晒太阳，以保证足够的紫外线照射，预防 维生素D的缺乏。
• （三）讨论
• （1）本法摘自GB/T5413.9—1997，婴幼儿配方食 品和乳粉通用检测方法中维生素D的测定，适用于 食品或强化食品及饲料中维生素D含量的测定。本 法对维生素D2和维生素D3不加区别，两者混合存 在时，以总维生素D定量之。 • （2）维生素D含量的表示可用质量含量mg/100g, 也可用国际单位，1国际单位（1IU）相当于0.025 μg 维生素D。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
MM_FS_CNG_0229 饲料维生素D
3
高效液相色谱法
MM_FS_CNG_0229
饲料中维生素D
3
的测定
1.适用范围
本方法适用于配合饲料、浓缩饲料、复合预混料和维生素预混料中维生素
D 3的测定。
测量范围为每千克样品中含维生素D
3
(胆钙化醇)的量在500IU以上。
2.原理概要
用碱溶液皂化试验样品，乙醚提取未皂化的化合物，蒸发乙醚，残渣溶解于甲醇并将部分溶液注入高效液相色谱净化柱中除去干扰物，收集含维生素D
3
淋洗液馏分，蒸发至干，溶解于正已烷中，注入高效液相色谱分析柱，用紫外检测
器在264nm处测定，通过外标法计算维生素D
3
的含量。
当样品中维生素D
3
标示量超过每千克10000IU时，可省去高效液相色谱净化柱，试验溶液直接注入色谱分析柱分析。
3.主要试剂和仪器
主要试剂
无水乙醚：无过氧化物
过氧化物检查方法：用5mL乙醚加1mL10%碘化钾溶液，振摇1min，如有过氧化物则放出游离碘，水层呈黄色。
若加%淀粉指示液，水层呈蓝色。
该乙醚需处理后使用。
去除过氧化物的方法：乙醚用5%硫代硫酸钠溶液振摇，静置，分取乙醚层，再用蒸馏水振摇洗涤两次，重蒸，弃去首尾5%部分，收集馏出的乙醚，再检查过氧化物，应符合规定。
乙醇；正己烷：重蒸馏(或光谱纯)；1,4-二氧六环；甲醇：优级纯；2,6-二叔丁基对甲酚(BHT)；无水硫酸钠；氢氧化钾溶液（500g/L）；
抗坏血酸乙醇溶液（5g/L）：取抗坏血酸结晶纯品溶解于4mL温热的蒸馏水中，用乙醇稀释至100mL，临用前配制。
氯化钠溶液（100g/L）。
维生素D
3
标准溶液：
维生素D
3标准贮备液：准确称取维生素D
3
(胆钙化醇)USP结晶纯品，于50mL
棕色容量瓶中，用正已烷溶解并稀释至刻度，4℃保存。
该贮备液的浓度为每毫升含1 mg维生素D
3
；
维生素D
3标准工作液：准确吸取维生素D
3
标准贮备液，用正已烷按1∶100
比例稀释，该标准溶液浓度为每毫升含10μg(400IU)维生素D3；
酚酞指示剂乙醇溶液（10g/L）；
氮气（%）。
仪器
实验室常用设备；圆底烧瓶，带回流冷凝器；恒温水浴或电热套；旋转蒸发器；
超纯水器(或全磨口玻璃蒸馏器)。
高效液相色谱仪(两套)，带紫外检测器。
4.试样的制备
选取有代表性的饲料样品至少500g，四分法缩减至100g，磨碎，全部通过
孔筛，混匀，装入密闭容器中，避光低温保存备用。
5.过程简述
.试验溶液的制备
皂化：
称取试样，配合饲料10～20g，浓缩饲料10g，精确至。
维生素预混料或复合预混料1～5g，精确至。
置入250mL圆底烧瓶中，加50～60mL抗坏血酸乙醇溶液，使试样完全分散、浸湿，加10mL氢氧化钾溶液，混合均匀。
置于沸水浴上回流30min，不时振荡防止试样粘附在瓶壁上，皂化结束，分别用5mL乙醇、5mL水自冷凝管顶端冲洗其内部，取出烧瓶冷却至约40℃。
提取：
定量转移全部皂化液于盛有100mL乙醚的500mL分液漏斗中，用30～50mL 蒸馏水分2～3次冲洗圆底烧瓶并入分液漏斗，加盖，放气，随后混合，激烈振荡2 min，静置分层。
转移水相于第二个分液漏斗中，分次用100，60mL乙醚重复提取两次，弃去水相，合并三次乙醚相。
用氯化钠溶液100mL洗涤一次，再用蒸馏水每次100mL洗涤乙醚提取液至中性，初次水洗时轻轻旋摇，防止乳化。
乙醚提取液通过无水硫酸钠脱水，转移到250mL棕色容量瓶中，加100mgBHT使之溶解，用乙醚定容(V ex)。
以上操作均在避光通风柜内进行。
浓缩：
从乙醚提取液(V ex)中分取一定体积(V ri)(依据样品标示量、称样量和提取液量确定分取量)，置于旋转蒸发器烧瓶中，在部分真空，水浴温度50℃的条件下蒸发至干，或用氮气吹干。
残渣用正已烷溶解(需净化时用甲醇溶解，)，并稀释至10 mL(V en)使其获得的溶液中每毫升含维生素D32～10μg(80～400IU)，离心或通过μm过滤膜过滤，收集清液移入2mL小试管，用于高效液相色谱分析柱分析。
使用高效液相色谱净化柱提取：
用5 mL甲醇溶解圆底烧瓶中的残渣，向高效液相色谱净化柱中注射甲醇溶
液(按.所述色谱条件，以维生素D
3标准甲醇溶液流出时间)收集含维生素D
3
的馏
分于50mL小容量瓶中，蒸发至干(或用氮气吹干)，溶解于正已烷中。
所测样品的维生素D
3
标示量在每千克超过10000IU范围时，可以不使用高效液相色谱净化柱，直接用分析柱分析。
.测定
高效液相色谱净化条件：
柱和固定相：Lichrosorb RP-8，粒度10μm，25cm×10mm(内径)。
移动相：甲醇＋水(90＋10)。
流速：min。
温度：室温。
检测器：紫外检测器，使用波长264nm。
高效液相色谱分析条件：
正相色谱：
柱长：25cm、内径4mm不锈钢柱。
固定相：硅胶 Lichrosorb si60，粒度5μm。
移动相：正已烷＋1,4-二氧六环(93＋7)，恒量流动。
流速：1mL/min。
温度：室温。
进样体积：20μL。
检测器：紫外检测器，使用波长264nm。
保留时间：。
反相色谱：
柱长：，内径4mm不锈钢柱。
固定相：ODS(或C
18
)，粒度5μm。
移动相：甲醇＋水(95＋5)，恒量流动。
流速：1mL/min。
温度：室温。
进样体积：20μL。
检测器：紫外检测器，使用波长264nm。
保留时间：。
定量测定
按高效液相色谱仪说明书调整仪器操作参数和灵敏度(AUFS)，为准确测量按
要求对分析柱进行系统适应性试验，使维生素D
3与维生素D
3
原或其他峰之间有
较好分离度，其R≥。
向色谱柱注入相应的维生素D
3
标准工作液(V st)和试验溶液(V i)，得到色谱峰面积的响应值(P st、P i)，用外标法定量测定。
6.结果计算
计算公式：结果按式(1)计算：
ωD＝P i×V ex×V en×ρi×V st×
(1)
P st×m×V ri×V i×f i
式中：ωD——每克或每千克样品中含维生素D3的量，IU；
m——样品质量，g；
V
ex
——提取液的总体积，mL；
V
ri
——从乙醚提取液(V ex)中分取的溶液体积，mL；
V
en
——试验溶液最终体积，mL；
ρ
i
——标准溶液浓度，μg/mL；
V st ——维生素D
3
标准溶液进样体积，μL；
V
i
——从试验溶液中分取的进样体积，μL；
P
st
——与标准溶液进样体积(V st)相应的峰面积响应值；
P
i
——与从试验溶液中分取的进样体积(V i)相应的峰面积响应值；
f i ——转换系数，1国际单位(IU)维生素D
3
相当于μg胆钙化醇；
——为回流皂化时生成维生素D3原的校正因子。
注：标准维生素D
3
结晶纯品与试样同样皂化处理后，所得标准溶液注入高
效液相色谱分析柱以维生素D
3
峰面积计算时可不乘。
平行测定结果用算术平均值表示，保留有效数3位。
7.允许差
同一分析者对同一试样同时两次测定(或重复测定)所得结果相对偏差：
每千克试样中含维生素D
3
的量,IU 允许相对偏差，%
×103～×105±20
＞×105～×106±15
＞×106±10
8.来源
中国国家标准 GB/T 17818—1999。