基因工程chapter 5 目的基因的分离与鉴定

例如：人的基因组是 3×109 bp，插入DNA片断的平均长度如果是2×104 bp
G
N= 4.61× F
= 4.61×
3×109 2×104
= 6.9×105
5.1.2 cDNA文库的构建
1. cDNA
以mRNA为模板逆转录出的DNA称cDNA。
3’
mRNA
5’
5’ 引物 cDNA
反转录酶
3’
2. cDNA library
② mRNA的分离纯化
分离mRNA用商业化的Oligo dT纤维柱。
（3）cDNA的合成 ① cDNA第一链合成
逆转录酶能以RNA为模板合成DNA。 用Oligo dT（或随机引物）作引物，合成cDNA的第一链。
3’AAAAAAA 5’ TTTTTTT
cDNA
mRNA
反转录酶
5’
Oligo dT引物
（1）对载体的要求
载体容量越大，所要求的DNA片断数目越少，所需的重组子越少。
（2）目前常用的载体 载体系列： 容量为 24 kp
Cosmid： 容量为 50 kb
YAC：
容量为 500kb
BAC:
容量为 300 kb
基因组文库的大小
一个文库要包含99%的基因组DNA时所需要的克隆数目。
N=
ln (1-p) ln (1-f)
已知序列
限制酶 未知序列
连接酶
2. 不对称PCR
目的：扩增产生特异长度的单链DNA。 方法：采用两种不同浓度的引物。分别称为限制性引物和非限制性引物，其 最佳比例一般是0.01:0.5 μM，关键是限制性引物的绝对量。 用途：制备核酸序列测定的模板
制备杂交探针 基因组DNA结构功能的研究
低浓度引物
RNaseH
3’ mRNA 5’
聚D合NA酶mRNA cDNA第一链
DNA
聚合酶mRNA
去引物 DNA ligase
3’ 5’
cDNA第二链 cDNA第一链
RNaseH
大 肠 杆 菌 酶 降 解 取 代 法
﹙4﹚cDNA的克隆
将上述合成的cDNA与载体（质粒或噬菌体）组成重组子，然后转化到受体 菌中扩增。 其技术与基因组DNA文库的构建相同。
妙用RNaseH
这种酶能识别mRNA-cDNA杂交分子中的mRNA，并将其降解成许多小片断。 小片断正好成为DNA聚合酶的引物，用来合成冈崎片断。 DNA Pol I除去引物并修补后再使用DNA连接酶连成一整条DNA链。
3’ 5’ 引物
mRNA
cDNA
反转录酶
3’ 5’ 引物
mRNA cDNA第一链
目的基因
载体 真核生物
连接 电穿孔或显微注射
重组பைடு நூலகம்体
转化或转导
原核生物
筛选和鉴定
5.3 目的基因的连接
• 直接连接 • 同聚物加尾 • 人工接头
直接连 接-1
直接连接1 同一粘性末端
缺点： 自我环化 无方向性 武汉工商学院《基因工程》
直接连接2 不同粘性末端
优点： 不会自我环化 定向性
存在的问题： 目的基因两端不一定 有酶切位点
同聚物加尾法
优点： 能把任何片段连接起来 缺点： 插入片段不能再切下来
非酶切位点
人工接头1
衔接物：用化学合成法合成的一段10-12bp的特定限制性内 切酶识别位点序列的平端双链。
GGAATTCC CCTTAAGG
武汉工商学院《基因工程》
优点：可酶切，还可连接Polylinker 缺点：如果插入片段内部也有该酶位点，不能得到完整的插入片段
1.反向PCR (reverse PCR)
目的：是用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段，对某个已知DNA 片段两侧的未知序列进行扩增。 用途：探索邻接已知DNA片段的序列；用于仅知部分序列的全长cDNA的克 隆；扩增基因文库的插入DNA；建立基因组步移文库。
未知序列
已知序列
未知序列
限制酶 未知序列
BamH I
BamH I
BamH I
策略：随机片断化
目的基因
限制性内切酶局部消化法：控制内切酶的用量和消化时间，使基因组 中的酶切位点只有一部分被随机切开。
② 机械切割法
a.超声波
超声波强烈作用于DNA，可使其断裂成约300bp的随机片断。
b.高速搅拌
1500转/分下搅拌30min，可产生约8kb的随机片断。
宿主细胞DNA
基因组DNA 限制性内切酶
接入载体
进入细胞，培养 筛选单克隆
基因组克隆文库
2. 基因文库构建的一般步骤
1）基因组DNA大片段的制备
制备高分子质量的DNA：尽量避免机械切割， 避免其他DNA污染
断点完全随机，片断长度合适于载体连接。不能用一般的限制性内切酶消 化法。
物理切割法：
超声波（300bp）或机械搅拌（8kb）。
讨论：为什么要利用反转录PCR扩增目的基因，而 不是直接扩增？
反转录PCR（RT-PCR)的步骤
逆转录酶 ＤＮＡ聚合酶
mRNA
杂化双链
cDNA
PCR扩增
5.2.2 其他PCR技术扩增目的基因
• 反向PCR (reverse PCR) • 不对称PCR • 反转录PCR（RT-PCR) • 锚定PCR • cDNA末端快速扩增技术RACE
② 降解mRNA模板 用碱处理或用RNaseH降解mRNA-DNA杂交分子中的mRNA。
3’ 5’ 引物
mRNA
cDNA
反转录酶
5’
3’
3’
mRNA
5’
5’ 引物
cDNA第一链
3’
碱 或RNaseH
5’ 引物
cDNA第一链
3’
③ cDNA第二链合成
剩下的cDNA单链的3’末端一般形成一个弯回来的双链发卡结构（机理不明）， 可成为合成第二条cDNA链的引物。用DNA聚合酶合成第二链DNA.。
5’
cDNA第一链
cDNA第二链合成
DNA聚合酶
5’ 3’
cDNA第一链 cDNA第二链
④去掉发卡结构
用核酸酶S1可以切掉发卡结构（但这会导致cDNA中有用的序列被切 掉！）。
5’ 3’
cDNA第一链 cDNA第二链
核酸酶S1
5’ 3’
cDNA第一链 cDNA第二链
3’ 5’
自 我 引 导 合 成 法
p: 文库包含了整个基因组DNA的概率（99%） f: 插入载体的DNA片段的平均长度占整个基因组DNA的百分数 N：所需的重组载体数（克隆数）
N=
ln (1-p) ln (1-f)
=
ln (1-99%)
ln (1-f)
= 4.61×
G F
N=
4.61×
G F
G：Genome大小；F：Fragment大小
直接连接、同聚物加尾或人工接头。
① 粘性末端 直接连接
②同聚物加尾法
优点：能把任何片段连接起来 缺点：不能把插入片段再切下来
非酶切位点
③人工接头
人工接头：用化学合成法合成的一段10-12bp的特定限制性内切酶识别位点 序列的平端双链。
EcoRI linker： GGAATTCC CCTTAAGG
酶切法：
内切酶Sau3A进行局部消化。可得到10-30kb 的随机片断。
2. 基因文库构建的一般步骤
1）基因组DNA大片段的制备 ①限制性内切酶法 用限制性内切酶把基因组DNA切成不同大小的片断。
酶切
优点：带有粘性末端，产物可以直接与载体连接。 缺点：目的基因内部也可能有该内切酶的切点。目的基因也被切成碎片！
linker的作用：用T4 DNA连接酶连到平端DNA上，然后再用酶切，形成一 个人工粘性末端。
各种酶的接头可以向公司定做或购买。
2. 基因文库构建的一般步骤
4）重组体转化宿主细胞
重组噬菌体和cosmid都能在体外包装成噬菌体颗粒，以感染的 方式将重组DNA分子导入大肠杆菌（效率较高）。
2. 基因文库构建的一般步骤
第5章 目的基因的分离与鉴定
目录
5.1基因文库法获得目的基因 基因组文库的构建 cDNA文库的构建
5.2 PCR技术分离目的基因 5.3 目的基因的连接 5.4 重组载体的导入 5.5 重组载体的筛选和鉴定
5.1 基因文库法获取目的基因
对于复杂的染色体DNA分子来说，单个基因所占比例微小， 若想从庞大的基因组中将其分离出来，一般需要先进行扩增， 故需要构建基因文库。
利用某种生物的总mRNA合成cDNA，再将这些cDNA与载体连接，转入细菌 细胞中进行保存和扩增，称cDNA文库。
基因组文库 cDNA文库
3. cDNA文库的特点
（1）不含内含子序列。 （2）可以在细菌中直接表达。 （3）包含了所有编码蛋白质的基因。 （4）比DNA文库小的多，容易构建。 （5）以mRNA为材料，适用于某些RNA病毒基因组结构研究。
RACE流程
RACE流程
SMART RACE cDNA synthesis Kit原理
cDNA第一链的合成机制
思考题
1. 比较基因组文库与cDNA文库的概念和特点。 2. 简述基因组文库的构建的步骤。 3. 简述cDNA文库的构建的步骤。 4. 简述RT-PCR法获得目的基因的原理及步骤。
5. cDNA文库的局限性
✓ 并非所有的mRNA分子都具有polyA结构。 ✓ 细菌或原核生物的mRNA半衰期很短。 ✓ mRNA在细胞中含量少，对酶和碱极为敏感， 分离纯化困难。
✓ 仅限于克隆蛋白质编码基因。 ✓ 所含遗传信息远少于基因组文库，受细胞来源或发育时期的影响。
5.2 PCR技术分离目的基因
人工接头2 DNA接头 (adapter)
一头平末端、另一头粘性末端（某种酶切位点序列）。
BamHI adapter 5‘p-GATCCCGG-OH3’ GGCC-p5’
用T4 DNA连接酶连到DNA分子的两端，直接成为人工粘性末端。
人工接头2 DNA接头 (adapter)
CCGGGATCCCGG
cDNA 末端核酸转移酶
3’GG…GG
5’
CC…CC 锚定引物
3’GG…GG
5’
CC…CC
3’GG…GG CC…CC
4. cDNA末端快速扩增技术RACE
原理：利用Oligo (dT) 对mRNA 进行反转录的同时在两头加上通 用接头(引物) ，从而可利用基因特异的引物，通过PCR 反应快速 获得目的序列的5′端和 3′端。
2. 基因文库构建的一般步骤
2）载体的选择与制备
基因组文库：λ-DNA或cosmid， 大型基因组使用YAC或BAC
cDNA文库构建载体：质粒
Why？
质粒 λ-DNA Cosmid BAC YAC
15kb 25kb 45kb 300kb 400kb
2. 基因文库构建的一般步骤 3） DNA片段与载体的连接
基因组文库 cDNA文库
5.1.1 基因组文库的构建
1.基因文库（gene library）
将某种生物细胞的全部基因组DNA切割成大小合适的 片断，并将所有这些片断都与适当的载体连接，引入相 应的宿主细胞中保存和扩增。理论上讲，这些重组载体 上带有了该生物体的全部基因，称为基因组文库。
文库中所有克隆所携带的 DNA 片段重新组合起来可 以覆盖该生物的整个基因组。
注：cDNA文库包含某种生物体特定组织、特定发育阶段表达的基因。
4. 构建cDNA文库的一般步骤
（1）总RNA（total RNA）提取 （2）mRNA的分离纯化
① 原理 利用mRNA都含有一段polyA尾巴，将mRNA从总RNA（rRNA、tRNA 等）中分离纯化。 mRNA只占总RNA的1%-5%。
5）基因组文库质量的评价
1、完备性高，筛选任一基因的概率均应为99% 2、重组克隆的总数不宜过大 3、载体的装载量最好大于基因的长度 4、克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域 5、克隆片段易于从载体分子上完整卸下 6、重组克隆能稳定保存、扩增、筛选
构建基因文库的载体选用
载体能够容载的DNA片断大小直接影响到构建完整的基因文库所需要的重组 子的数目。
GGCCCTAGGGCC
接头自我连接
P-
-P
GATCCCGG GGCC
平末端DNA
BamHI adapter
GATCCCGGGGCC-
-CCGG -GGCCCTAG
◆ PCR技术由于能从复杂DNA背景中将特定的DNA 区段扩增出来，使目标DNA在体系中大量合成，从 而很容易将其从体系中分离或克隆出来。
◆ 高效性、特异性
PCR原理
5.2.1 已知基因全长序列
要表达某种已知蛋白质
数据库中查到相应的序列 设计针对性的特异引物
RT-PCR扩增
……
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/
高浓度引物
3. 锚定PCR（anchored PCR, A-PCR） PCR技术需了解靶基因片段两侧的序列
对于未知序列和具有不同末端序列怎么办？
锚定PCR首先合成第一链cDNA,然后再添加一同聚物尾（polydG),与同 聚物尾配对的3’锚定引物（带有限制性内切位点polydC)一起作PCR扩增