第六章 酶、细胞、原生质体固定化

被交联，酶活力损失大。
(2)制备的固定化酶颗粒较小，给使用
带来不便。
4. 包埋法（entrapment）
将酶用物理的方法 包埋在各种载体（高聚 物）内。分为： 网格型：将酶包埋在高 分子凝胶细微网格中。 微囊型：将酶包埋在高 分子半透膜中。
1）网格型包埋法 （gel (lattic) entrapment） 又称凝胶包埋法
优越性：
(1)降低成本，省去酶的分离纯化工作; (2)既可作为单一酶，也可作为复合酶系 完成部分代谢过程。
局限性：
(1)细胞内多种酶的存在，会形成不需要的 副产物。 (2)只适用于生产胞外酶和其他能分泌到胞 外的产物 (3)细胞膜、细胞壁和载体都存在着扩散限 制作用。
3.固定化原生质体
意义：
(1)固定化原生质体去除了细胞壁的扩散障 碍，有利于氧的传递，营养成分的吸收和 胞内产物的分泌。 (2)原生质体不稳定，容易破裂，固定化后， 由于载体的保护作用，稳定性提高。
小结：
1.酶的固定化有几种方法？阐述其机理。 2.简述固定化原生质体制备的两个阶段。 3.固定化酶的应用主要在哪些方面，并举 例说明？（查阅资料）
第六章 酶、细胞、原生质体固定化
游离酶的缺点：
1.酶是蛋白质，稳定性差（热、酸碱、有 机溶剂对其有影响）。 2.不能回收利用。 3.产物的分离纯化困难。
★ 改善方法： 固定化生物技术
第一节 酶、细胞、原生质体固定化
一、定义及特点
1.固定化酶(imm在一定空间范围内进行催 化反应的酶。
借助双功能试剂使酶分子之间发生交
联的固定化方法。
双功能试剂：
常用的是戊二醛 O O
H — C — CH2 — CH2 — CH2 — C — H
戊二醛有两 个醛基，均可与 酶或蛋白质的游 离氨基反应,使酶 蛋白交联。
此法与共价偶联法利用的均是共价键， 不同之处：交联法不使用载体。
缺点：
(1)反应条件激烈，酶分子的多个基团
三、在分析检测中的应用
1.酶传感器
固定化酶和电化学传感器的结合。
优点：
①既有不溶性酶体系的优点，又具有电化学
电极的高灵敏度；
②酶的专一反应性，使其具有较高的选择性，
能够直接在复杂试样中进行测定。
1967年Updike等采用酶的固定化 技术，将葡萄糖氧化酶固定在疏水膜 上，然后再和氧电极结合，组装成了 世界上第一个生物传感器——葡萄糖 氧化酶电极。
二、固定化方法
（一）酶的固定化方法
固定化方法
吸附法
共价偶联法
交联法
包埋法
物理 吸附法
离子交 换吸附
网格型
微囊型
1.吸附法（adsorption）
依据带电的酶或细胞和载体之间的静电
作用，使酶吸附于惰性固体的表面或离子交
换剂上。
优点：条件温和，操作 简便，酶活力损失少。 缺点：结合力弱，易解 吸附。
世界上第一种工业化生产的固定化酶
乙酰 -DL — 氨基酸
酰化酶
L — 氨基酸 +乙酸 乙酰 -D — 氨基酸
A-L-Ala A-D-Ala
固定化 酶柱子
离心机
泵 储 罐 反应产物
L-Ala A-D-Ala
消 旋 反 应 器
晶体 L-Ala
2.葡萄糖异构酶
世界上生产规模
最大，应用最为成功
的一种固定化酶。
2.共价偶联法（covalent binding or covalent coupling） 借助共价 键将酶的活性 非必需侧链基 团和载体的功 能基团进行偶 联。
•优点：酶与载体结合牢固，不会轻
易脱落，可连续使用。
•缺点：反应条件较激烈，易影响酶
的空间构象而影响酶的催化活性。
3.交联法（crosslinking）
与网格型包埋法相比，微囊型包埋法的优点： 半透膜能阻止蛋白质分子渗漏和进入，注入体内既可 避免引起免疫过敏反应，也可使酶免遭蛋白水解酶的 降解，具有较大的医学价值。
缺点：反应条件要求高,制备成本也较高。
包埋法是目前应用最多的一种较理想的方
法，与其它固定化方法相比：
•优点：不与酶蛋白氨基酸残基反应，很少改变
2.酶联免疫测定
(1)将适宜的酶与抗体或抗原结合在一起。制 成酶标抗体（或酶标抗原 ）；
(2)将酶标抗体（或酶标抗原）与样品中的待 测抗原（或抗体）混合，通过免疫反应二者 即可特异性地结合在一起，形成酶－抗体－ 抗原复合物。通过酶催化反应的速度即可测 定复合物中酶的含量，进而测出样品中的待 测抗原（或抗体）的量。
德国研发的环境废水BOD分析仪
•医疗方面
葡萄糖传感器和血糖测定仪
用葡萄糖氧化酶
（glucoseoxidase,GOD）制成葡萄糖
传感器，可测定血液中葡萄糖浓度。
手掌型葡萄糖(glucose)分析仪


食品鲜度
肉鲜度传感器
肉类在腐败过程中会产生各种胺类，故胺类 测定能反映肉类的新鲜程度。 用单胺氧化酶膜和氧电极组成的酶传感器 测定肉在贮藏过程中的鲜度。
（三）原生质体的固定化方法
1.原生质体的制备
收集对数生长期的细胞 悬浮于高
离心分离
渗溶液中
原生质体
加入细胞壁水解酶
2.原生质体固定化
一般采用网格包埋法（即凝胶包埋法）。
注意：一般要加渗透压稳定剂，以防止原 生质体破裂。
第二节 固定化酶与固定化细胞的应用
一、在工业生产上的应用
1. 氨基酰化酶（Aminoacylase）
葡萄糖酶电极
半透膜 酶胶层
感应电极
酶电极示意图
ß －D－葡萄糖＋O2
D－葡萄糖酸－1，5－内酯＋H2O2
Glucose Membrane Glucose oxidase Oxygen
Gluconic acid
Hydrogen peroxide
Electrode
根据反应中消耗的O2、生成的葡萄糖酸和H2O2的量， 可以用氧电极、pH电极和H2O2电极来测定葡萄糖的含量。
酶的高级结构，酶活回收率高。
•缺点：只适合作用于小分子底物和产物的酶。
吸附法
共价偶联法
交联法
包埋法
酶的四种固定化方法
各种固定化方法的优缺点比较
固定化方法
吸附法
物理吸附法 离子吸附法 易 中等 易 弱
包埋法 共价结 交联法 合法
较难 强 高 不能 低 不变 难 强 低 不能 高 可变 较难 强 中等 不能 中等 可变
什么是固定化酶？
水溶性酶 水不溶性载体 固定化技术
水不溶性酶
（固定化酶）
优点：
(1)可提高稳定性。
(2)能回收，易与产物分离，可反复使用。
缺点：
(1)存在扩散限制。适于催化小分子物质。
(2)酶活性下降。
2. 固定化细胞（immobilized cell）
固定在载体上并在一定空间范围内进行
生命活动（生长、繁殖、新陈代谢）的细胞。
海藻酸钙凝胶包埋法：
滴至 海藻酸钠溶液＋E (or cell) CaCl2 溶液中 IE(or IC)
角叉菜胶包埋法：
滴至
角叉菜胶＋E (or cell)
KCl 溶液中
IE (or IC)
2）微囊型包埋法 （microencapsulation） 又称半透膜包埋法
半透膜孔径<酶分子孔径，小于半透膜孔 径的小分子底物和产物可以自由进出， 被称为“人工细胞”。
制备难易 结合程度 活力回收 再生 费用
高，酶易流失 高 可能 低 可能 低 不变
底物专一性 不变
（二）细胞的固定化方法
1) 直接固定法
不使用载体，借助物理（如加热、冰冻）、
化学方法（如柠檬酸、各种絮凝剂）将细胞直接
固定。 一般只用于单酶或少数几种酶催化的反应。
2)吸附法（固定化动物细胞的主要方法） 3)包埋法（凝胶包埋）
二、固定化酶在医学上的应用
1. 消血栓：

纤溶酶是异源蛋白质，在人体内引起免疫 反应，无法长期使用。 酶的不稳定性使其在较短的时间内失活。

用包埋法制备的酶固定化技术可克服上 述弊端，酶在囊中不能漏出，小分子物质 能自由进出。
2. 人工肾：
原理：将病人血液中的尿素经脲酶水解成 氨，再用活性炭吸附。即：用固定化脲酶 和微胶囊活性炭组成人工肾。
酶传感器工作原理示意图
酶传感器主要由固定化酶膜和变换器组成： 固定化酶膜：选择性地“识别”并催化被检测物质 发生化学反应； 变换器：把催化反应中底物或产物的变量转换成电 信号，通过仪表显示出来。
2）酶传感器的应用

水质监测
用化学法测定酚时，硫化物、油类等 可干扰其测定。 从马铃薯中提纯、经吸附交联得到 的固定化多酚氧化酶与氧电极构成酚传感 器，可检测大多数酚类化合物。