实验六、小鼠精巢细胞减数分裂标本的制备

【实验操作】 实验操作】
6、预固定。 预固定。 向离心管中加入1 向离心管中加入1ml 3:1甲醇:冰醋酸，轻轻吹打混匀，静置 甲醇:冰醋酸，轻轻吹打混匀， 2 min，1000 rpm离心8min，弃上清。 min， rpm离心8min，弃上清。 7、固定。 固定。 向上述沉淀中加入5 向上述沉淀中加入5ml 3:1甲醇:冰醋酸，吹打混匀，静置10 甲醇:冰醋酸，吹打混匀，静置10 －20 min，1000 rpm离心8min，弃上清。 min， rpm离心8min，弃上清。 8、再固定。加5 ml 1:1甲醇:冰醋酸，吹打混匀，静置5 min， 、再固定。加5 1: 甲醇:冰醋酸，吹打混匀，静置5 min， 1000 rpm离心8min，弃上清，加3－4滴1:1甲醇:冰醋酸固定 rpm离心8min，弃上清，加3 甲醇: 液悬浮细胞。
骨髓细胞的收集
1、来源丰富、个体较小的小动物骨髓细胞收集法： （1）处死动物，取长骨 （2）去干净骨上所附肉（先用刀片刮，再用纱布擦） （3）用剪刀剪开骨头两端 （4）用注射器吸生理盐水或低渗液将骨髓腔中细胞 冲出，收集到离心管中 2、大动物骨髓细胞收集：骨髓穿刺法取红骨髓 、大动物骨髓细胞收集：骨髓穿刺法取红骨髓
二、减数分裂II 减数分裂II
可分为前、中、后、末四个四期，与有丝 分裂相似。
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验
目
的
学习滴片法制备单细胞悬液染色体的一般方法。 学习滴片法制备单细胞悬液染色体的一般方法。 以小鼠精巢细胞染色体制片为标本观察减数分 裂过程中不同时期的染色体。 裂过程中不同时期的染色体。
【试验原理】 试验原理】
示意图
一、减数分裂I 减数分裂I
1、前期I 前期I 减数分裂的特殊过程主要发生在前期I，通常人为划分为5 减数分裂的特殊过程主要发生在前期I，通常人为划分为5 个时期：①细线期（leptotene）、②偶线期（zygotene）、 个时期：①细线期（leptotene）、②偶线期（zygotene）、 ③粗线期（pachytene）、④双线期（diplotene）、⑤终变 ③粗线期（pachytene）、④双线期（diplotene）、⑤终变 期（diakinesis）。 期（diakinesis）。 终变期：二价体显著变短， 并向核周边移动， 终变期：二价体显著变短 ， 并向核周边移动 ， 在核内均匀 散开。 散开。 2、中期I 中期I 3、后期I 后期I 4、末期I 、末期I
实验六： 实验六： 小鼠精巢细胞减数分裂标本的 制备与观察
【背景知识】 背景知识】
减数分裂（ Meiosis） 减数分裂 （ Meiosis ） 是发生于生殖细胞的一种特殊的细 胞分裂方式，DNA复制一次，而细胞连续分裂两次， 胞分裂方式，DNA复制一次，而细胞连续分裂两次，形成 单倍体的精子和卵子。 单倍体的精子和卵子。 减数分裂远比有丝分裂复杂，经两次细胞分裂，分别称减 数分裂Ⅰ、减数分裂Ⅱ 数分裂Ⅰ、减数分裂Ⅱ，两次分裂间又一个较短的间期， 这个间期DNA不复制。 这个间期DNA不复制。
羽髓细胞的收集
剪掉盲端 冲洗
培养血细胞的收集
（1）用吸管先将培养液转入离心管中（10ml ）用吸管先将培养液转入离心管中（10ml 带刻度） （2）再给培养瓶中加入生理盐水，用吸管吸 取瓶中生理盐水冲洗整个培养瓶底壁，将 附着在底壁上的细胞（主要为淋巴细胞） 冲洗下来转入培养液所在离心管。
1、收集尽量多的细胞 2、加入低渗液后一定要轻轻吹打，以免细胞 加入低渗液后一定要轻轻吹打， 核提前破裂， 引起染色体外遗 、 核提前破裂 ， 引起染色体外遗、 无规则排 列。 3、滴片时玻片一定要带水 4、注意染色。
【结果观察】 结果观察】
观察各期细胞核及染色体。
作业： 作业：
绘制所看到的中期Ⅰ和中期Ⅱ 绘制所看到的中期Ⅰ和中期Ⅱ的染色体图， 说明其中染色单体组成情况。
【实验操作】 实验操作】
1、注射秋水仙素，增加中期分裂相。 注射秋水仙素，增加中期分裂相。 试 验 前 4 － 5 小 时 ， 小 鼠 腹 腔 注 射 秋 水 仙 素 0.5ml （100µg/ml）。 100µg/ml） 2、取睾丸并清洗。 取睾丸并清洗。 断颈处死小鼠，剖开腹部，取出肾形睾丸，放入盛有4 断颈处死小鼠，剖开腹部，取出肾形睾丸，放入盛有4－5 ml 2％柠檬酸钠溶液的平皿中清洗并去掉外面脂肪等物， 柠檬酸钠溶液的平皿中清洗并去掉外面脂肪等物， 弃污液。 弃污液。 3、挑出曲细精管并剪碎。 挑出曲细精管并剪碎。 另加柠檬酸钠溶液 1ml ， 用尖头镊尖或解剖针将曲细精管 另加 柠檬酸钠溶液1ml， 用尖头镊尖或解剖针 将曲细精管 拉出，并用眼科剪尽量将其剪碎。 拉出，并用眼科剪尽量将其剪碎。
雄性动物精子发生于睾丸曲精细管的生精上皮细 胞 ， 由其中的精原细胞经多次有丝分裂和生长， 由其中的精原细胞经多次有丝分裂和生长 ， 形成初级精母细胞， 形成初级精母细胞 ， 初级精母细胞经减数分裂形 成次级精母细胞， 成次级精母细胞 ， 次级精母细胞有丝分裂成精细 胞，再经一系列变化成精子。 再经一系列变化成精子。 因此， 通过分离曲细精管 、 剪碎并加入液体吹打 ， 因此 ， 通过分离曲细精管、 剪碎并加入液体吹打， 可使官腔各种细胞游离出来， 然后经过低渗 、 可使官腔各种细胞游离出来 ， 然后经过低渗、 固 定 、 染色等过程就可制成包含减数分裂各期的标 本。
【实验操作】 实验操作】
4、游离并收集细胞。 游离并收集细胞。 将剪碎的曲细精管及溶液移入离心管中 用吸管反复吸打1 将剪碎的曲细精管及溶液移入离心管中，用吸管反复吸打1 －2min，使尽量多的细胞从管腔中游离出来； min， 静置5 min（ 300rpm离心2 min） 静置5 min（或300rpm离心2 min），使大的膜管状杂质下 沉； 吸上清液于另一管中， 吸上清液于另一管中，1000 rpm离心5 min，沉淀即为不同 rpm离心5 min， 发育阶段的细胞。 发育阶段的细胞。 5、低渗处理，使细胞胀大。 低渗处理，使细胞胀大。 加入5 加入5ml 0.075M的KCI，轻轻（为什么？）吹打混匀，静置 075M KCI，轻轻（为什么？ 吹打混匀， 10 min。 min。
小鼠曲细精管管腔
曲细精管管腔
【实验材料及用品】 实验材料及用品】
1、 材料：成年雄性小白鼠 2、 用品：注射器、平皿、尖头镊子、剪刀 用品：注射器、平皿、尖头镊子、 （ 普通剪刀、 眼科小剪刀） 、 吸管、 离心 普通剪刀 、 眼科小剪刀 ） 吸管 、 管、离心机、玻片等。 离心机、玻片等。
实验试剂 实验试剂
1、100µg/ml秋水仙素。 100µg/ml秋水仙素。 2 、 2％柠檬酸钠溶液 3、 0.075M的KCI 075M 4、3:1甲醇:冰醋酸及1:1甲醇:冰醋酸（应现配） 甲醇:冰醋酸及1 甲醇: 5、 PH6.8，0.01M的PBS缓冲液 PH6.8，0.01M的PBS缓冲液 6、Gimesa原液 Gimesa原液 7、 Gimesa工作液：1份Gimesa原液加9份PH6.8，0.01M的PBS Gimesa工作液：1 Gimesa原液加9 PH6.8，0.01M的 缓冲液，混匀。工作液应现用现稀释。
【实验操作】 实验操作】
9、滴片。 滴片。 滴一滴细胞悬液于冰水中刚捞出的湿载玻片 滴一滴细胞悬液于冰水中刚捞出的湿载玻片 上，自然干燥。 自然干燥。 10、染色。 10、染色。 Gimesa染液染20- min， Gimesa染液染20-30 min，流水洗去多余染液， 待干
【注意事项】 注意事项】