抗菌肽作为水产饲料添加剂的应用前景

近年来，随着水产养殖业的快速发展、高密度集约化程度的增大，养殖病害问题逐年增加，抗生素等药物滥用情况严重，致使部分水产品中的药物残留量增加或严重超标，不仅威胁到食品安全，也影响了水产品的出口，给我国的水产养殖业造成了巨大的经济损失。由于目前水产养殖中抗生素耐药菌株的出现速度已经远远超过了抗生素研发速度，并且现有的抗生素开发策略多局限于既有的抗生素类别，难以有实质上的突破，一种新的抗生素出现不久很快就会有病菌产生耐药。抗感染形势的严峻性迫切需要寻找与现有抗生素抗菌机理完全不同的新型抗菌物质。

抗菌肽是广泛存在于细菌、植物、软体动物、两栖动物、鱼类、鸟类和哺乳动物体内的一类小分子多肽，由２０～６０个氨基酸残基组成，具有广谱杀菌作用。同抗生素的单一作用位点不同，抗菌肽是作用于细菌的整个细胞膜，使膜去极化或者形成“孔洞”，造成细胞内含物外流或者肽分子进入细胞内部与ＤＮＡ、ＲＮＡ等靶标作用，进而杀死细菌。除高效杀菌作用外，抗菌肽还具有明显的杀伤真菌、病毒和原虫的作用，并能选择性杀伤肿瘤细胞而不破坏正常细胞，因此是生物体天然免疫防御系统的重要组成部分。由于抗菌肽本身是来源于养殖动物自身的一种小蛋白，动物对其的排异反应很低，而且杀菌作用发挥到一定的程度之后，动物体内的很多蛋白酶就把抗菌肽降解了，检测不到残留物质，对环境没有任何污染，是一种无毒、无害、绿色环保的产品。同时，抗菌肽还具有不易出现耐药性突变、分子量小、热稳定性好、水溶性好、作用迅速等特点。它在水产养殖业中的推广应用，对提高鱼体的抗病力，减少甚至杜绝抗生素类药物的使用，维持鱼类健康，实现水产养殖业的可持续发展具有重要的现实意义。

一般而言，抗菌肽可通过以下３种途径获得：①从生物体内直接提取纯化；②化学人工合成；③采用基因工程技术构建抗菌肽基因工程菌株。但由于抗菌肽为体内诱导合成，生物体中含量较低，因此从生物体内直接提取的难度大，对技术和成本的要求高，难以规模化生产。而化学合成的方法同样存在成本较高的问题。一般小于１０个氨基酸残基的多肽的合成较为经济，１０个残基以上多肽的合成则很昂贵，限制了应用。因此利用基因工程的方法来生产抗菌肽是降低成本的一条有效途径。有关抗菌肽基因的表达研究最初是在原核表达系统中进行的，但由于抗菌肽对原核细胞有一定的毒性，因此抗菌肽基因只能以融合蛋白形式在大肠杆菌中进行表达。近年来，以啤酒酵母、毕赤酵母、昆虫等为基因工程宿主，进行表达分离纯化及应用的研究引起人们的重视，为抗菌肽的开发与应用奠定了良好的基础。

现在越来越多的鱼类抗菌肽被克隆出来，品种涉及鲶鱼、鲑鱼、罗非鱼、比目鱼、斑马鱼等多种鱼类，从已报道的序列来分析，它们的结构与组成复杂多样，并没有很高的同源性，但存在一些共同特征，如含有较多精氨酸或赖氨酸而使分子带正电；含有较多疏水氨基酸，可使分子折叠成疏水或双亲性α螺旋结构等。体外研究表明，许多抗菌肽对鱼类特异的甚至其他动物的病原微生物都具有杀伤活性，其最小抑菌浓度（ＭＩＣ）多在毫摩尔水平，如鲶鱼和泥鳅抗菌肽对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真菌的ＭＩＣ为０．５～２毫摩尔／升之间；鲈鱼抗菌肽对杀鲑气单胞菌、嗜水气单胞菌等鱼类致病菌的ＭＩＣ甚至低达１．２毫摩尔／升；此外，虹鳟和鲈鱼的抗菌肽对某些寄生虫也具有致死效力，但其杀伤作用需要较高的浓度，而且其活性主要针对滋养体时期。

目前，国内作为添加剂生产应用的抗菌肽主要是蚕抗菌肽ＡＤ－酵母制剂，大多数试验也是围绕这种抗菌肽进行的。黄永彤等发现抗菌肽对肉鸡有促进生长和提高免疫力的作用，与中草药、抗生素相比，在出栏率、平均个体重量及饲料利用率等方面均无显著差异，在出栏前３天停喂，抽检无残留。王广军等（２００５）研究了抗菌蛋白在南美白对虾养殖中的应用效果，结果表明，在饲料中添加抗菌蛋白，无论是在日生长速度、相对增重率、饲料系数及成活率，还是抗病力方面均有显著的提高。此外，抗菌肽能有效杀灭霉腐微生物，在机体内还可以被蛋白酶降解，双重安全的保证使得抗菌肽还可以在饲料工业中作为饲料防腐剂使用。

由于抗菌肽代替抗生素作为饲料添加剂的研究最近几年才发展起来，虽然取得了一些进展，但还处于探索阶段，距离形成成熟的技术、大规模地应用到动物生产中还有很多问题需要解决：①抗菌肽的种类很多，哪些种类作为饲料添加剂效果较好而且又比较经济；不同种类的抗菌肽之间是否有相互作用，有待于进一步研究；

②抗菌肽在动物体内含量少，天然资源缺乏；化学合成的生产成本昂贵，目前还无法投入大规模的生产；用基因工程的方法大规模地生产抗菌肽，或者通过日粮因素调控抗菌肽基因的表达还需进一步研究；③抗菌肽在体内容易被蛋白酶水解，需要用脂质包被或对其进行化学

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修饰来保护，因此还需对它的释放机制、受体结合、降解活性及其类似物的结构与活性的关系等进行研究；④

目前人们关于抗菌肽作为饲料添加剂真正用在实际生产方面的试验还比较少，其效果以及是否有副作用还需要更多的动物试验来证实。

但随着对水产动物各种抗菌肽的分离、结构和功能的进一步研究，将为设计新型抗菌制剂提供理论依据；而基因工程技术的不断提高又使得通过抗菌肽基因的克隆与表达从而大量生产抗菌肽成为可能。我国在抗菌肽的基础研究和开发应用领域起步稍晚，但也取得了一些令世界瞩目的成绩，积累了一些成功的经验。相信随着对抗菌肽认识的不断深入，以及基因工程技术的不断发展，抗菌肽作为饲料添加剂的产业化将不会遥远。

北京市水产科学研究所 罗 琳

邮编 １０００６８

上海汉宝生物工程有限公司 蔡雪峰

近年来，随着微生物制剂产业的发展，市场出现了一些混乱的局面，产品质量、价格以及功效等参差不齐，给老百姓选择上带来了很大的误区。针对这种情况，越来越多的水产业者开始自主开发用“土方”来培养某些有益微生物，达到自给自足的目的，此类家庭式的培养虽然取得了一定的效果，但总的来说由于技术含量不高，经常出现一些问题。下面笔者将自己多年来在生产一线积累的一些常见微生物培养经验提供给大家，以供参考。

一、培养设施条件及器具

对一般的养殖场、育苗场而言，在培养设施上首先要求有一个光线好、封闭、清洁的独立工作室作为保种和扩大培养的场所，对工作室要求不高，但最好配备紫外灯管作为消毒之用。水、药物消毒灭菌一般采用高温消毒或化学消毒的方式，所以配备一般的煤气罐、煤气灶和烧壶就足够了。在器具上还要求配备一定数量的三角烧瓶（２．５升、５升）、烧杯、细口玻璃瓶（２０升，或用大塑料桶代替）、玻璃棒等常用玻璃器皿。另外根据生产需要配备相应数量的０．５米３左右（高度１．２米为好）的玻璃缸桶、小型充气泵等。

二、菌种的来源、保存及扩大培养１．菌种的来源

菌种的来源通常有两种方式：一种是通过正规的生物公司、科研院所或高等院校购买，这种方式质量一般可以得到保证，但对养殖户来说较为困难；另一种是直接选用市场上同类优质产品，该产品若出自声誉良好的生产厂家，在经过生产使用效果较好的情况下，可以直接选用作为菌种，通常的做法是同时采用多个厂家的同类产品，经过培养比较后选其最优者。

２．菌种的保存及扩大培养菌种一般在小型三角烧瓶中进行保存，通常的做法是将海水（或淡水）在三角烧瓶中煮沸消毒、冷却，加上相应的培养基后接入菌种，如果是厌氧菌则用消毒好的塑料薄膜封口密闭培养，好氧菌则用消毒好的牛皮纸（或其他纸）封口。在保种过程中要经常摇瓶，操作时要注意不要让液体溅到封口纸上，否则会很容易引起污染；同时要观察菌种是否有污染，最常见的污染状况是菌种上层出现点状霉斑，时间久了就会形成一层异状菌膜，此种情况出现应把整瓶菌种淘汰。

在保种过程中要注意观察培养基颜色的变化，通过变化可以了解细菌生长的情况，观察到培养基颜色由深变浅，可以镜检细菌的密度，如合适即要及时进行分瓶或扩大培养。扩大培养一般用２０升的玻璃瓶（或塑料桶），接种比例一般在１：（５～３）之间为宜。整个操作过程要注意避免污染，配备紫外灯管的要提前进行空气消毒，不具备的可用酒精灯作局部空气消毒。

三、常见几种有益菌的培养

各种有益菌的培养方式有很多，培养基的配方也有多种，但都遵循投其所好、因需而配的原则。笔者近年来经过多次尝试，现把几种常用微生物的简易培养方法总结如下（各种有益菌培养基基本成分如表１）。

１．光合细菌的培养

生产中光合细菌主要用于养殖池塘底质、水质的改善和稳定、轮虫等动物性饵料的强化、以及贝类等幼体的直接摄食等，特别是在池塘养殖或育苗上用量较大。针对这种情况，在培养上分别采取两种方式：一是在保种和扩大培养期，采用全封闭式厌气光照培养，主要是接种在封闭的大玻璃瓶或半透明塑料桶内培养；二是生产性大规模培养期，采用开放式微气光照培养，主要在０．５升的玻璃钢桶中充气培养。