植物基因组DNA的提取
植物基因组DNA的提取及分析
植物基因组DNA的提取及分析一、植物基因组DNA提取的步骤：1.样本的准备：从植物中选择健康和新鲜的组织样本，如叶片、茎、根等。
样本选择要避免含有大量的绒毛、叶色不正常等因素的部位。
2.细胞破碎：将样本放入液氮中迅速冷冻，然后用研钵和研钉对样本进行研磨，直至样本完全破碎。
3.细胞裂解：将研磨的样本加入裂解缓冲液，边振荡边研磨使样本均匀混合。
4.蛋白质去除：使用酚/氯仿提取法去除蛋白质。
加入等体积的酚/氯仿/异丙醇混合液，轻轻混合，然后离心离心管以分离上清和下层。
5.DNA沉淀：将上清转移至新的离心管中，加入等体积的冷乙醇进行DNA沉淀。
静置一段时间后，离心离心管以沉淀DNA。
6.DNA洗涤：将DNA沉淀物用70%乙醇洗涤一至两次，去除残留的盐和其他杂质。
7.DNA溶解：用适量的稳定缓冲液溶解DNA，使其达到一定浓度并避免降解。
二、植物基因组DNA分析的方法：1.PCR扩增：PCR技术可以通过放大DNA片段来研究特定基因或DNA 序列。
首先选择适当的引物，然后将DNA样本与引物、核酸酶、dNTPs等反应液混合，进行多次循环的变温扩增反应。
2.聚丙烯酰胺凝胶电泳：将PCR扩增的产物与DNA分子量标记物置于聚丙烯酰胺凝胶中，然后进行电泳。
电泳结束后，通过紫外线照射或染色剂染色，观察电泳图谱，可以得到DNA片段的大小和数量。
3.酶切电泳：使用限制性内切酶切割DNA片段，然后将切割后的DNA 片段进行电泳分析。
根据DNA片段的大小和相对迁移速度，可以进行DNA 的分析和比较。
4.南方杂交：将DNA样本与标记了放射性同位素或荧光染料的DNA探针进行杂交反应。
通过探针与目标DNA片段的互补配对，可以检测目标DNA的存在和数量。
5.DNA测序：通过测序技术获得DNA序列信息，可以揭示基因组的结构和功能。
通过以上方法，我们可以提取和分析植物基因组DNA，更好地了解植物基因组的组成和功能，为植物的遗传改良和研究提供重要的信息。
植物基因组DNA提取
植物基因组DNA提取第一篇：植物基因组DNA提取植物基因组DNA提取一、实验目的1、掌握植物基因组总DNA的抽提方法和基本原理。
2、学习根据不同的植物和实验要求设计和改良植物总DNA抽提方法。
二、实验原理通常采用机械研磨的方法破碎植物的组织和细胞，由于植物细胞匀浆含有多种酶类(尤其是氧化酶类)对DNA的抽提产生不利的影响，在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂(如巯基乙醇)以降低这些酶类的活性。
在液氮中研磨，材料易于破碎，并减少研磨过程中各种酶类的作用。
十六烷基三甲基溴化铵(hexadyltrimethyl ammomum bromide，简称为CTAB)、十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate，简称SDS)等离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来。
加入苯酚和氯仿等有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。
上清液中加入无水乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于TE溶液中，即得植物总DNA溶液。
三、实验仪器及试剂实验仪器：高速离心机；烘箱；冰箱；水浴锅；高压灭菌锅；Nanodrop。
实验试剂：玻璃珠，十二烷基磺酸钠(SDS)；三羟甲基氨基甲烷（Tris）；乙二胺四乙酸（EDTA）；氯化钠；苯酚；氯仿；无水乙醇等。
四、实验步骤1.SDS提取缓冲液在65℃水浴中预热。
2.将叶片置于1.5ml离心管中，液氮速冻，组织研磨器打样。
3.加入700 μl的SDS提取缓冲液，涡旋摇匀。
4.置于65℃的水浴中，每隔10 min轻轻摇动，30 min后取出。
5.加入200 μl KAc溶液，摇匀，放入-20℃冰箱30 min。
6.10000 rpm离心5 min，上清移至新离心管中，12000 rpm离心5 min。
7.上清移至新离心管中，加入700 μl异丙醇，-20℃冰箱30 min。
植物基因组DNA的提取与检测
生命科学学院专业生物技术 2016级生技班666组姓名余梓棋同实验者黄剑宇黄少凯 2018年 5 月 8日题目：植物基因组DNA的提取与检测一．实验目的:1.了解真核生物基因组DNA提取的一般原理；2.掌握基因组DNA提取的方法和步骤。
二．实验原理1.液氮研磨：液氮能迅速将植物组织温度降到零度以下，使组织细胞变得脆而易碎，此时对植物组织进行研磨，能大大提高研磨的效率，植物组织迅速变为粉末状，增大表面积，提高提取植物DNA的效率。
2.SDS等离子型表面活性剂处理：SDS等离子型表面活性剂能溶解膜蛋白而破坏细胞膜，使核蛋白解聚，从而使DNA游离出来，且使DNA保持溶解溶液状态，易于分离3.苯酚和氯仿处理：苯酚和氯仿等有机溶剂能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质；4.异丙醇处理：上清液中加入异丙醇使DNA沉淀，离心后DNA沉淀于离心管底部，便于移去提取液。
而后将沉淀DNA溶于TE缓冲液中，即得植物基因组DNA溶液；5.DNA的琼脂糖凝胶电泳鉴定：带电荷的物质，在电场中的趋向运动称为电泳。
DNA的琼脂糖凝胶电泳可以分离长度为200bp至近50kb的DNA分子。
DNA的迁移率（U）的对数与凝胶浓度（T）之间存在反平行线性关系。
因此，要有效地分离不同大小的DNA片生命科学学院专业生物技术 2016级生技班666组姓名余梓棋同实验者黄剑宇黄少凯 2018年 5 月 8日段，选用适当的琼脂糖凝胶浓度是非常重要的。
三．实验材料及设备1.实验材料：新鲜的植物幼嫩叶片2.实验仪器：（1）研磨皿，10、100、1000μL取液器各一支，台式高速离心机，漩涡器；（2）电泳仪，电泳槽，样品槽模板（梳子），有机玻璃内槽，水平仪，取液器，微波炉，凝胶成像系统。
3.实验试剂：（1）植物DNA提取a.细胞提取液：100mmol/L Tris-HCl, pH8.0, 5mmol/L EDTA,500mmol/L NaCl, 1.25% SDS，1%β-巯基乙醇（去除酚类）；b.氯仿:异戊醇（24:1）；c.其它试剂：液氮、无水乙醇、 TE缓冲液、异丙醇、洗涤缓冲液；作用：氯仿可使蛋白质变性，有助于液相与有机相的分离。
试验一植物基因组DNA提取
实验一植物基因组DNA提取目的：了解植物细胞的特点，掌握植物基因组DNA分离、纯化的原理。
原理：用植物基因组DNA提取液处理研磨、收集后的样品，提取液中的乙二胺四乙酸二钠（EDTA）能螯合金属离子，以防止破碎细胞的脱氧核糖核酸酶对DNA 的降解作用，而细胞破碎液中的蛋白酶K在37℃温浴过程中还能降解蛋白质，从而减少了蛋白质对DNA的污染。
然后用CTAB处理，在特定的盐浓度下，CTAB 使基因组DNA处于溶解状态，而蛋白质仍为沉淀。
经细胞破碎液获得的DNA 粗提取液再用酚、氯仿、异戊醇处理，其中酚是高效的蛋白变性剂，可进一步将蛋白、脂类和细胞碎片去掉，然后用氯仿、异戊醇处理，一方面可达到去蛋白的目的，另一方面还可去除残留的酚。
一、材料植物的根、茎、叶。
二、设备移液管，高速冷冻离心机，台式离心机，水浴锅。
三、试剂1、CTAB或Nacl溶液：4.1克NaCl溶解于80ml水，缓慢加入10克CTAB，加水至100ml。
2、其它试剂：氯仿、异戊醇（24：1），酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），异丙醇，TE，10%SDS，蛋白酶K（20mg/ml），5mol/LNaCl。
四、操作步骤1、选新鲜无病虫害的叶片用自来水冲洗吸干，用蒸馏水洗两次，然后用超纯水洗一遍，吸干，剪碎称0.5-0.25克。
2、将所取材料放入预冷的研钵（研钵提前要灭菌），研成粉末后置于7ml离心管内（可以换为将样品放置到7ml离心管中800ulＣＴＡＢ后用玻棒捣碎）。
3、加入2.4ml 65℃预热的CTAB，充分混合后65℃水浴90min以上，冷却到室温，加入等体积氯仿异戊醇（24：1），轻轻颠倒混匀4℃离心6000g×10min，取上清加入2/3体积的-20℃预冷的异丙醇轻轻混匀，-20℃度放置20min，4℃离心5000g×5min，去上清。
4、再沉淀中加入0.6ml的65℃CTAB温育30min，待沉淀充分溶解，加入等体积氯仿异戊醇充分混匀，4℃离心6000g×5min，去上清加入2/3体积的-20℃预冷的异丙醇，轻轻混匀-20℃放置20min。
植物基因组DNA的提取
10、紫外检测仪。
五、实验操作方法和步骤 （一） 植物基因组DNA的提取
称取植物幼嫩叶子0.5g 65℃水浴保温1hr， 其间经常轻柔摇动 离心5,000g×5min 置于预热到65℃的研体中， 加少许石英砂；加入预热到 65℃的核酸提取缓冲液3ml 迅速研成匀浆 转移到7ml带盖离心管中
在DNA提取过程中必须始终注意以下几个关键问题： （1）DNA的二级结构和双链易受多种因素（如强酸、强碱、加热、低盐浓度、 有机溶剂、酰胺类、尿素等）的影响引起双链解开，即“变性”，因此抽提时 避免使用变性的条件。 （2）抑制内外源DNase的活力。DNase就象一把刀，它能把大分子的DNA切成碎 片，所以要加以杜绝，现可以通过多种途径来做到这一点：a、低温操作；b、 调节pH，使偏碱（pH8.0）；c、抽提液中加表面活性剂；d、加螯合剂（EDTA） 除去酶的铺助因子（Mg2+），使酶活性丧失。 （3）防止化学降解。如过酸或过碱以及其它化学因素，会使DNA降解，一般综 合考虑，取pH8.0左右为宜。 （4）防止物理因素降解。如温度太高或机械张力剪切等，DNA分子特别大，极 易被机械张力拉断，甚至在细管中稍急一些的流动也会使DNA断裂，所以在抽 提过程中要特别注意这一点，操作过程要尽量简便、温和、减少搅拌次数，也 不要剧烈摇动。 （5）植物的次生代谢物（主要是胞质内的多酚类或色素类化合物）对核酸提 取有干扰作用。因此，一般尽可能选幼嫩的、代谢旺盛的新生组织作为提取 DNA的材料，这是因幼嫩的新生组织次生代谢物较少，DNA含量高，且易于破碎， 植物材料最好是新鲜的。
三、实验材料与试剂
1、实验材料 植物基因组DNA样品
2、实验试剂
⑴ ddH2O； ⑵ TE缓冲液（pH 8.0）。 四、实验器材与仪器 1、离心机、离心管（5ml）及离心管架； 2、微量移液器10ul、200ul、1000ul及枪头； 3、紫外分光光度计； 4、石英比色皿（0.5cm光径）或1cm光径的微量石英比色皿（50ul、100ul）。
植物基因组DNA提取技术
、
TE缓冲液、无水乙醇、70%乙醇。
实验仪器
离心机
研钵
不同型号的 eppendorf管
实验过程
实验步骤：
称取样品，液氮研磨，加入预热的(60℃ ) CTAB及β-巯基乙醇 保温1h,期间不停的摇均 吸取上清液,移至新的离心管中,加入等体积氯仿：异戊醇（24：1），轻缓颠倒 混匀,10000rpm,10min 取上清液，移至新的离心管中,加等体积氯仿：异戊醇,颠倒混匀, 10000rpm,10min 取上清液，加入0.6-0.7V的异丙醇（预冷），后4 ℃ /-20 ℃保温沉淀 10000rpm,10min离心取沉淀，70%乙醇清洗两次，吹干 用TE溶解DNA,然后低温保存
除多糖：
高盐法：用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入1/2 体积的5M NaCl，高盐可溶解多糖。
用多糖水解酶将多糖降解。
在提取缓冲液中加一定量的氯苯(1/2体积)，氯苯
可以与多糖的羟基作用，从而去除多糖。
除酚类物质：
在抽提液中加入防止酚类氧化的试剂：β-巯基 乙醇、抗坏血酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇等 加入易与酚类结合的试剂：如PVP、PEG(聚乙二 醇)，它们与酚类有较强的亲和力，可防止酚 类与DNA的结合
实验过程 DNA样品在0.7% Agarose胶上电泳（例图） 高质量的基因组DNA带型 单一无拖尾现象 DNA浓度及纯度的检测 A260=1 约 50 μg/ mL 双链 DNA， A260/280 约为1.8
注意事项
1. 微量移液枪的使用一定要规范，吸取氯仿 等有机试剂要注意不要将试剂吸入枪中；
问题解析
DNA提取常见问题
问题一：DNA样品不纯，抑制后续酶解和PCR反应。
原 因
植物基因组DNA快速提取方法
植物基因组DNA快速提取方法
步骤：
1.向无菌的1.5ml的EP管中加入400ul 的DNA提取液；
2.用小剪刀剪取少许（肉眼可见即可）拟南芥幼嫩叶片于上述1.5ml
的EP管中（为了防止DNA交叉污染，剪取一片拟南芥组织后需将剪刀用卫生纸擦干净）；
3.用无菌的研磨棒将1.5ml的EP管中的叶片研磨至无可见叶片颗粒；
4.12000 RPM室温离心5分钟后取上清液于新的1.5ml的EP管中；
5.向上述EP管中加入400ul的异丙醇轻轻混匀后，室温静止10分
钟；
6.12000 RPM室温离心10分钟后弃上清，并加入400ul的70%的乙
醇；
7.混匀后12000 RPM室温离心5分钟后弃上清，将EP管置于37度
培养箱大约10分钟（晾干酒精）；
8.晾干后加入50ul的无菌水溶解基因组DNA;
9.去上述提取好的基因组DNA大约2ul作为模板即可进行后续的
PCR反应；
所需仪器：离心机，1ml和200ul移液枪，无菌研磨棒，无菌的1.5ml 的EP管；卫生纸；
溶液配制：
DNA提取液（500ml）（可长期室温保存）
200mM的Tris盐酸加入100ml 1M 的Tris盐酸存储液（PH：8.0）250mM的NaCl 加入25ml 5M的NaCl存储液
25mM的EDTA 加入25ml 的0.5M的EDTA存储液
0.5%的SDS 加入12.5ml的20%的SDS存储液
选择是难，更何况是心灵选择。
高渐离为了荆轲，他选择了死；马本斋母亲为了革命，她选择了牺牲；祝英台为了真挚爱情，她选择了化蝶。
在这友情、亲情与爱情之间选择，他们是这样做。
实验1植物基因组DNA的提取
实验1 转基因植物PCR 检测一、植物DNA 的提取技术(CTAB 法)一、实验目的1.掌握用CTAB 法提取植物总DNA 的方法和基本原理。
2.学习根据不同的植物和实验要求设计和改良植物总DNA 抽提方法。
二、原理CTAB 法[十六烷基三甲基溴化铵(hexadyltrimethyl ammomum bromide ，简称为CTAB)]是一种快速简便的提取植物总DNA 的方法。
通常采用机械研磨的方法破碎植物的组织和细胞，然后加入CTAB ，CTAB 是离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使核酸(DNA 、RNA)得以游离出来。
再加入苯酚和氯仿等有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸(DNA 、RNA)水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。
上清液中加入无水乙醇使DNA 沉淀，沉淀DNA 溶于TE 溶液中，即得植物总DNA 溶液。
三、实验材料大豆幼苗[材料的采集与保存对提取DNA 的产量和质量有很大影响。
通常应尽可能采集新鲜、幼嫩的组织材料，采集过程中应尽可能保持组织材料所含的水分。
通常的做法是取样时立即用浸湿的纱布包裹采集到的组织材料，放置在带有冷藏功能的采集箱中，这样通常使组织材料在3-5d 内仍然保持新鲜。
野外远距离采集样本时，在可能的条件下应冷冻保存（如放置于液氮中）；当不具备冷冻条件时，最好用盛有无水CaSO4的瓶子分别保存，使其迅速干燥，这种方法可将材料保存数月，返回后应尽快进行DNA 的提取工作。
那些具有大量次生代谢产物（如单宁、酚类、醌类等）的植物材料，应尽可能采集幼嫩组织。
]四、试剂4.1 CTAB 提取缓冲液：100 mmol/L Tris-HCl （pH8.0），20 mmol/L EDTA-Na 2，1.4mol/L NaCl （如表1），2% CTAB ，使用前加入0.1%（V/V ）的β-巯基乙醇。
表1 CTAB 提取缓冲液配制4.2 TE 缓冲液：10mmol/L Tris-HCl, 1mM EDTA （ pH8.0）。
植物提取dna的方法有哪些方法有哪些
植物提取dna的方法有哪些方法有哪些
植物提取DNA的方法有如下几种常见的方法：
1. CTAB法（Cetyltrimethylammonium bromide法）：这是一种常见的DNA 提取方法，利用CTAB和其他化学试剂来分离DNA。
2. 酚/氯仿提取法：通过酚和氯仿来提取DNA，可以有效地分离植物细胞中的DNA。
3. 细胞壁酶法：使用细胞壁酶来降解细胞壁，然后通过物理方法和化学方法提取DNA。
4. 硅胶柱法（Silica column法）：使用硅胶柱来吸附DNA，然后通过洗涤和洗脱的处理，得到纯净的DNA。
5. 盐法：通过高盐浓度和乙醇等试剂来沉淀DNA，然后经过洗涤和离心分离。
6. 磁珠法：使用具有磁性的珠子来吸附和纯化DNA，具有操作简便和高纯化度的优点。
除了以上提到的方法，还有一些其他的DNA提取方法，如酶解法、离心分离法等。
每种方法都有其特定的优缺点，适用于不同的样本和实验需求。
对于特定的
植物种类和实验目的，可根据需要选择最合适的DNA提取方法。
植物基因组 DNA 提取
植物基因组D NA 提取2ml 离心管提取取新鲜叶片采用C TAB 法，按M urry 等{Murray, 1980 #9}的方法，略加改进，具体操作过程如下：1. 2.0 ml 离心管加入离心管盖大小新鲜叶片2片；2. 液氮充分研磨成粉末，加入900 µL CTAB 缓冲液；3. 65 ℃水浴1小时，期间摇匀3次；4. 置于4℃冰箱冷却至15 ℃以下；5. 加入900 µL25: 24:1 酚/氯仿/异戊醇，上下混匀2-5 分钟，保证样品与氯仿充分混合；6. 12,000 rpm 离心20-30 分钟；7. 取上清液约800 µL，加入预先加好的700 µL 异丙醇的1.5 ml 离心管中，轻轻上下颠倒混匀；8. -20℃冰箱静止30 分钟以上；9. 12,000 rpm 离心15-20 分钟，弃上清夜；10. 75%酒精洗涤沉淀，弃上清液，12,000 rpm 离心15-20 分钟；11. 风干D NA，让酒精挥发干净（4 小时以上或过夜）；12. 加入100 µL 的纯水（含终浓度为1%RNase）溶解D NA；13. 放入37 ℃环境中，约60 分钟消化R NA；14. 取2 µL DNA 进行检测。
50ml 离心管提取取新鲜叶片采用C TAB 法，按M urry 等{Murray, 1980 #9}的方法，略加改进，具体操作过程如下：1. 取新鲜叶片在研钵用液氮研磨成粉末；2. 向50ml 离心管里加入叶片粉末，至刚好覆盖住管圆底部，加入20mlCTAB 缓冲液充分混匀；3. 65 ℃水浴1小时，期间摇匀3次；4. 取出，冷却至15 ℃以下；5. 加入20ml 的25: 24:1 酚/氯仿/异戊醇，上下混匀2-5min，保证样品与氯仿充分混合；6. 4500rpm 离心40 分钟；（如不需要抽提第2次，可直接到9步骤）7. 小心吸取上清液至新的50ml 离心管中，加入20ml 的氯仿溶液，混匀2-5min左右8. 4500rpm 离心40 分钟；9. 取上清液于50ml 离心管中，加入等体积的异丙醇，轻轻上下颠倒混匀，此时会看到絮状沉淀；10. -20℃冰箱静止30min 以上；11. 4500rpm 离心40min，弃上清夜；12. 加入5ml 的75%酒精洗涤沉淀，4500 rpm 离心30min，弃上清液；13. 风干D NA，让酒精挥发干净（4 小时以上或过夜）；14. 加入约300 µL 的纯水（含终浓度为1%RNase）溶解D NA；15. 放入37 ℃环境中，约60min 消化R NA；16. 取2 µL DNA 进行检测。
7植物基因组DNA提取-CTAB法
1. 2% CTAB抽提缓冲液
CTAB 2g， NaCl 8.18g ， EDTA-Na2-2H2O 0.74g， 10ml 1mol/L Tris-HCl(pH8.0)， 先用 70ml ddH2O溶解, 再定容至100ml，灭菌, 冷却后 加入0.2% β-巯基乙醇0.2ml。
终浓度： CTAB 2%, NaCl 1.4mol/L（生理平衡 作用）, EDTA20mmol/L(螯合离子作用)，β-巯基 乙醇 100 mmol/L或PVP（聚乙烯吡咯烷酮 ）（降 低氧化酶类的活性，防止酚氧化成醌，有效去除 多酚。）
复习题（判断）
将DNA提取液65度温育20分钟，可以灭活DNase。 （）
在抽提过程中如果水相和有机层的界面不太清楚， 说明其中蛋白质含量较高，可增加氯仿/异戊醇 抽提的次数或适当延长离心的时间。（ ）
（二）获取程序及原理
1. 破壁破膜，释放染色体
利用液氮对植物组织进行研磨，破碎细胞；然后 加入CTAB缓冲液。
有效制备DNA时要考虑两个原则： 防止和抑制内源 DNase 对 DNA的降解； 尽量减少对溶液中DNA的机械剪切破坏。
在液氮冷冻条件下研磨破碎，保证材料在此过程 中DNase无法活动。
高等植物总DNA提取
—— CTAB法AB法
实验类型：验证型
一、实验目的与要求
掌握CTAB法抽提植物DNA的基本原理。 学习并掌握CTAB法抽提植物DNA的技术和方法。
二、实验原理
（一）植物细胞中DNA在哪里？怎样获得？
➢ 植物细胞中的DNA主要存在于细胞核内，称为 核DNA、染色体DNA、核基因组DNA，细胞质中 也有少量DNA，主要分布在线粒体、叶绿体内，称 为核外DNA。 ➢ 细胞内的各种DNA称为总DNA。 ➢ 程序：破壁破膜→去蛋白质→沉淀DNA
植物基因组DNA提取
实验一植物基因组DNA提取一、目的与原理DNA是绝大多数生物(除少数RNA病毒外)储存、传递信息的生物大分子。
为了进行DNA 分子的体外重组，必须提取具有天然结构并具有一定长度的DNA大分子。
提取分离DNA大分子，有酚法，氯仿一异丙醇法、酶法、SDS法、CTAB法等方法。
主要操作都是围绕如何尽可能除尽结合蛋白质和多糖等杂质，本实验的目的是介绍CTAB法。
CTAB 法提取基因组DNA 原理：CTAB 是一种非离子去污剂。
CTAB 与核酸形成复合物，此复合物在高盐（＞0.7mM）浓度下可溶，并稳定存在，但在低盐浓度（0.1－0.5 mM NaCl）下CTAB－核酸复合物就因浓度降低而沉淀，而大部分的蛋白质及多糖等仍溶解于溶液中。
经离心弃上清后，CTAB－核酸复合物再用75％酒精浸泡可洗脱掉CTAB。
二、实验材料、仪器和试剂(一) 实验材料：新鲜的植物叶片（水稻叶子），适量液氮(二) 试剂：(1)EDTA溶液(0.5M、pH=8.0、500 mL)(2)Tris·HCl溶液(1.0 M、pH=8.0、500 mL)(3)2％CTAB抽提液(pH=8.0、500 mL)①称取CTAB粉末10.000 g，NaCl粉末40.908 g，PVP 405.000 g；②0.5M EDTA溶液20 mL；1.0M Tris·Cl溶液50 mL；③定溶至500 mL，121℃高压灭菌后，常温放置，待用。
(4)1×TE缓冲液(pH=8.0、200 mL)(5)RNase(10 mg/mL)1.5 mL离心管(121℃高压灭菌)，加入0.015 g RNase，15μL 1M Tris·Cl溶0.001305 gNaCl(几小粒)，无菌ddH2O(重蒸水)定容至1.5 mL，100℃煮15min；低温放置，待用。
(RNaseA，Sigma，M=487.5)。
（三）仪器通风橱、天平、离心机、摇床、微量移液器、水浴锅、研钵三、植物组DNA提取步骤1.准备工作。
分子实验-植物DNA提取
0 1 实验原理
1、破壁：在液氮中对植物组织进行研磨，破碎细胞。并减少 研磨过程中各种酶类的作用。
2、溶解：CTAB离子型表面活性剂能溶解膜蛋白而破坏细胞膜， 使核蛋白解聚，从而使DNA游离出来。
3、分离：苯酚和氯仿等有机溶剂能使蛋白质变性，并使抽提 液分相，因核酸水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去 细胞碎片和大部分蛋白质。
三、主要仪器及耗材： 研钵及研钵棒、水浴锅、移液枪及配套枪头、2.0ml离心管、 离心机、 电子天平、通风橱、冰箱、电泳仪、 凝胶成像系统、超微量核酸蛋白测 定仪系统。
04
PART FORE
操作步骤
0 4 操作步骤
1.配置试剂： （1）10 ml 4% CTAB提取缓冲液
CTAB NaCl 1 M Tris- HCl(pH 8.0) 0.5 mol/L EDTA(pH 8. 0) ddH2O
(二)琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA:
1、将溶液加入样品槽时，勿划破或戳破加样孔，勿带入气泡; 2、使用干净的电泳溶液。
THANKS
心管，使之充分作用15 min。
0 4 操作步骤
10.重复第7步骤。 11.在上清液中，加入2倍体积预冷的无水乙醇，轻柔颠倒，充分混匀，
室温放置 10min。 12.12 000 r/min 离心 5 min，弃上清，用70%的乙醇洗涤沉淀2次。 13.室温挥发乙醇5-10min，加入适量的ddH2O溶解。 14.电泳检测。取3 μL提取的植物总DNA，加入 1μL 6x Loading buffer，
0.4g 1.64g 20ml 0.8ml 7.2ml
（2）10ml 70%乙醇
无水乙醇
7ml
水
3ml
0 4 操作步骤
植物基因组DNA提取、酶切及电泳分析
二、原理十六烷基三乙基溴化胺是一种去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中（0.7mol/L NaCl）是可溶的，当降低溶液盐浓度到一定程度(0.3 mol/L NaCl)时，从溶液中沉淀，通过离心就可将CTAB与核酸的复合物同蛋白质、多糖类物质分开，然后将CTAB 与核酸的复合物沉淀溶解于高盐溶液，再加乙醇使核酸沉淀，CTAB能溶解于乙醇。
三、试剂与器材（一）、试剂1 、DNA extraction ：500ml31.885g sorbitol (山梨醇)6.05g tris PH8.2 (一般不调)2、Nuclei lysis buffer: 500ml100ml 1M Tris PH7.5100ml 0.25M EDTA200ml 5M NaCl10g CTAB100ml ddH2O3、5% lauroyl sarcosine (N-月桂酰肌氨基钠盐) 500ml用时，将上述三种溶液按1：1：0.4 比例混匀，加入亚硫酸氢钠（3.8g/l），65℃预热，既为抽提液。
（二）器材恒温水浴、研钵、电泳设备四、操作步骤（一）、基因组DNA提取1 取0.15g左右小麦叶片，在液氮中研磨后放入1.5ml离心管中，加入700ml抽体液（65℃预热）混匀，放入65℃水浴中，裂解40-60分钟，期间温和混匀几次。
2 取出裂解好的DNA ，加入700ml氯仿：异戊醇（24：1），猛烈混匀，离心（1000rpm，10分钟）。
3 取上清于新管中，（不要混入氯仿），加入0.8-1倍预冷异丙醇，缓慢混匀后，再猛烈混匀，使DNA成团，-20℃放半小时以上。
4 将析出的DNA 离心，14000rpm，10分钟。
5 去掉上清，将沉淀用1ml 70% 乙醇清洗一次，离心干燥，溶于50ml ddH2O。
植物基因组DNA的提取
浴锅中保温60min；
④ 加入等体积的氯仿-异戊醇（24:1），轻轻地颠 倒混匀，室温下12000rpm离心10min，移至上 清至新1.5mL EP管；（可重复④ ，抽提两次）
4、参考文献
[1] 钟卫鸿.基因工程技术实验指导[M].北京： 化学工业出版社，2007，7. [2] 王镜岩，朱圣庚，徐长法.生物化学教程[M]. 北京：高等教育出版社，2008，6. [3] 孙明.基因工程[M].北京:高等教育出版社， 2006，5. [4] 彭学贤.植物分子生物技术应用手册[M].北京 ：化学工业出版社，2006，2.
3、方法与步骤
①
②
在CTAB提取液中加入2% β-巯基乙醇，在65 ℃水浴锅中预热（CTAB需在65 ℃保温溶解 ，充分混匀后使用）； 取幼嫩的水稻叶子0.5g，洗净、吸干、剪碎 （冻存材料必须直接研磨，绝对不能化冻； 研磨后的粉末应在化冻前转移，否则内源性 DNase有可能降解）
3、方法与步骤
4、注意事项
CTAB在低于15 ℃时溶于沉淀，所以
使用之前要65 ℃时预热，用前再加 巯基乙醇或者加入亚精胺（100μL DNA加5μL 0.1M的亚精胺）； 在研磨前，研钵里不得有任何水分 ，否则加液氮时容易结冰； 在用不锈钢灭菌后的药匙移取粉末 时，可用枪头的大头移取；
4、注意事出离 心管时动作要轻缓，吸取上层溶液时所 用的枪头要减去下面尖端部分，吸取时 不要吸取中间的蛋白质层； 用70%的乙醇洗DNA后，要使乙醇完全 挥发，否则会对后续的PCR产生影响， 甚至对限制性酶作用产生非特异性；
实验一SDS法提取植物基因组DNA
实验一SDS法提取植物基因组DNA 一材料、试剂和仪器
1材料新鲜的组织材料或-80℃冻存的材料
2试剂
(1)提取缓冲液
Tris-HCl100mmol/L（pH8.0）
EDTA50mmol/L（pH8.0）
NaCl500mmol/L
灭菌后加β-巯基乙醇至10mmol/L
(2)裂解液20%SDS
(3)高盐溶液5mol/LKAc
(4)RNaseA10mg/ml
(5)异丙醇
(6)灭菌ddH2O或TE
3.仪器:离心机，恒温水浴,台式高速离心机，电泳装置
二实验程序
1、取幼嫩的组织材料1-2g,用蒸馏水冲洗干净，再用灭菌
ddH2O冲洗2次，放入经液氮预冷的研钵中，加入液氮研磨至粉末状，用干净的灭菌不锈钢勺转移粉末到加有500μL提取液的离心管中,轻轻混匀。
2、向管中加入50μL20%SDS溶液，混匀，不可过于强烈震荡以防基因组DNA断裂，65℃保温10min，并不时摇动。
3、加入150μL5mol/LKAc，混匀，置冰上20-30min。
4、4℃,15000rpm离心15min,转移上清到另一离心管中，加入0.7V的异丙醇，混匀，-20℃沉淀30min。
5、12000rpm离心10min回收基因组DNA沉淀，吹干后加入适量的灭菌ddH2O或TE溶解DNA。
6、加入1/10体积的RNaseA，37℃保温20min，除去RNA。
7、CI抽提后，加2V乙醇，-20℃沉淀30min。
12000rpm离心10min回收基因组DNA沉淀。
8、用400μL70%乙醇洗一次后，吹干，加入适量的灭菌ddH2O 或TE溶解DNA。
9、电泳检测完整性。
植物基因组DNA提取步骤
植物基因组DNA提取实验操作步骤1取植物新鲜组织约100mg或干重组织约30mg，加入液氮充分研磨。
（植物细胞有细胞壁,液氮可以让细胞冷冻起来,变得很脆,这样容易破细胞壁。
同时,液氮的超低温可以大大降低酶活性,防止降解。
注：1、液氮的温度是-196℃，不要冻伤自己的手，带上手套。
2、用一个保温杯，大一点的，把液氮取出来放在保温杯里，盖上盖子。
3、然后用液氮将研磨棒和研钵预冷。
4、将样品快速放入研钵中，快速研磨，在液氮挥发完之前再加入液氮，一定不要让液氮挥发完或者样品呈现那种黏糊的状态，这样样品中DNA容易降解。
5、等到样品呈现细粉末状态了基本就可以了，用药勺把样品迅速舀到1.5ml 离心管里。
）2将研磨好的粉末迅速转移到预先装有700μL65℃预热缓冲液GP1的离心管中（实验前在预热的GP1中加入巯基乙醇，使其终浓度为0.1%），迅速颠倒混匀后，将离心管放在65℃水浴20min，水浴过程中颠倒离心管以混合样品数次。
（水浴时间依实验具体情况而定，看样品裂解情况，具体看裂解液变得清澈透明为止）3加入700μL氯仿，充分混匀，12,000rpm（~13,400×g）离心5min。
注：若提取富含多酚或淀粉的植物组织，可在第3步前，用酚：氯仿/1:1进行等体积抽提。
4小心的将上一步所得水层上相转入一个新的离心管中，加入700μL缓冲液GP2，充分混匀。
5将混匀的液体转入吸附柱CB3中，12,000rpm（~13,400×g）离心30s，弃掉废液。
（吸附柱容积为700μL左右，可分次加入离心。
）6向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12,000rpm（~13,400×g）离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
7向吸附柱CB3中加入600μL漂洗液PW（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12,000rpm（~13,400×g）离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
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提供一个缓冲环境，防 止核酸被破坏
螯合Mg2+或Mn2+抑制 DNase活性
提供一个高盐环境，使 DNP充分溶解，存在于 液相中
酚的络合物，能与多糖 和酚类物质形成不溶的 络合物，减少酚的污染， 去除酚和多糖
抗氧化剂，防止酚变成 使用之前再加 醌，避免褐变，使酚容 易去除
2.3 试剂
➢ 氯仿-异戊醇（24:1，v/v） 氯仿是使蛋白质变性并有助于液相与有机相 的分开，而异戊醇可降低表面张力，从而可消 除抽提过程中出现的泡沫；
1、实验原理
• SDS、CTAB等离子型表面活性剂，能溶解细 胞膜和核膜蛋白，使核蛋白（DNP）解聚，从 而使DNA得以游离出来。
• 再加入苯酚和氯仿等有机溶剂，能使蛋白质变 性，并使抽提液分相，因核酸（DNA、RNA） 水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细 胞碎片和大部分蛋白质。上清液中加入冰无水 乙醇或者异丙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于 TE溶液中，即得植物总DNA溶液。
➢ 异丙醇（-20℃预冷）； ➢ 70%乙醇（-20℃预冷）
洗去DNA表面盐类等杂质；
2.3 试剂
➢ TE缓冲液（pH8.0）： 10mM Tris-HCl，1mM EDTA （pH8.0） ，121 ℃高压蒸汽灭菌 TE中的EDTA 能螯合Mg2+或Mn2+抑制DNase活 性，且pH为8.0，可防止DNA发生酸解；
3、方法与步骤
③ 移入经过预冷的研钵中，加入液氮研钵至粉末 状，用干净的灭菌不锈钢药匙快速转移粉末至 1.5mL离心管中；加入250μL的CTAB提取液，
总体积达到500μL，混匀后置65 ℃磁力搅拌水 浴锅中保温60min；
④ 加入等体积的氯仿-异戊醇（24:1），轻轻地颠 倒混匀，室温下12000rpm离心10min，移至上 清至新1.5mL EP管；（可重复④ ，抽提两次）
成分 CTAB
浓度 2%
DNA 提
取 液
Tris-HCl （pH8.0）
EDTA （pH8.0）
NaCl
PVP （聚乙烯 吡咯烷酮）
β-巯基乙醇
100mM 20mM 1.4M 0.1%
2%
作用
备注
能溶解细胞膜和核膜蛋 白，使核蛋白解聚，使 DNA得以游离出来
CTAB在低于 15℃时容易形 成沉淀析出， 所以用之前要 65℃预热
4、参考文献
[1] 钟卫鸿.基因工程技术实验指导[M].北京： 化学工业出版社，2007，7.
[2] 王镜岩，朱圣庚，徐长法.生物化学教程[M]. 北京：高等教育出版社，2008，6.
[3] 孙明.基因工程[M].分子生物技术应用手册[M].北京： 化学工业出版社，2006，2.
植物基因组DNA的提取
植物基因组DNA的提取
1、实验原理 2、材料、仪器、试剂 3、方法与步骤 4、注意事项 5、参考文献
植物基因组DNA的提取
植物基因组DNA提取的方法主要有： ➢ SDS法 ➢ CTAB法是一种阳离子去污剂，在高离子强度
的溶液里，CTAB与蛋白质和大多数酸性多聚 糖以外的多聚糖形成复合物，只是不能沉淀 核酸，重要用途提取DNA和RNA。
放置30min，或者室温放置1h；
⑩ -20 ℃保存。
4、注意事项
➢ CTAB在低于15 ℃时溶于沉淀，所以 使用之前要65 ℃时预热，用前再加 巯基乙醇或者加入亚精胺（100μL DNA加5μL 0.1M的亚精胺）；
➢ 在研磨前，研钵里不得有任何水分， 否则加液氮时容易结冰；
➢ 在用不锈钢灭菌后的药匙移取粉末 时，可用枪头的大头移取；
3、方法与步骤
⑤ 加入1倍体积的冰异丙醇或者2倍体积冰无水乙
醇，颠倒混匀，冰浴1h，或者-20 ℃放置30min， 或-80 ℃放置10min；
⑥ 室温下12000rpm离心10min（可离心时间长一 些）；
⑦ 弃上清，用70%冰乙醇清洗沉淀两次； ⑧ 室温晾干约20~30min；
⑨ 加入100μL TE 缓冲液，加入2μL RNase，37 ℃
CTAB法
CTAB法，是1980年Murray和Thompson 修改而成的快速简便提取植物DNA的方 法。
CTAB法
十六烷基三甲基溴化铵
(cetyltrimethyl ammomum bromide，简称为 CTAB)，为阳离子去污剂，可溶解细胞膜，能 与核酸形成复合物，在高盐溶液（>0.7mol/L NaCl）中可溶，当盐浓度降低到一定程度 （0.3mol/L NaCl）时，可沉淀CTAB-核酸的复 合物，通过有机溶剂抽提和离心沉淀即可除去 蛋白质，多糖和酚等杂质。最后通过冰乙醇或 异丙醇沉淀DNA，而CTAB因溶于冰乙醇或异 丙醇而被除去。
4、注意事项
➢ 在加入氯仿-异戊醇抽提离心后，拿出离 心管时动作要轻缓，吸取上层溶液时所 用的枪头要减去下面尖端部分，吸取时 不要吸取中间的蛋白质层；
➢ 用70%的乙醇洗DNA后，要使乙醇完全 挥发，否则会对后续的PCR产生影响， 甚至对限制性酶作用产生非特异性；
4、注意事项
➢ 最后溶于TE缓冲液中： 在无离子水溶液中，低浓度的核酸由于 磷酸基负电荷的排斥作用会引起变性。
星星活性
星星活性（star activity）： 在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似 的序列，这个改变的特殊性称星星活性。
影响星星活性的因素有很多：
甘油浓度高（>5%），酶过量（>100U/μL）,离子强度
低（<25mM），pH过高（>8.0），或者加入了有机溶 剂DMSO（二甲基亚砜），乙醇，乙二醇，或者用其 他二价离子如Mn2+、Cu2+、Co2+、Zn2+代替了Mg2+。
➢ 10mg/mL RNase A； ➢ 液氮
3、方法与步骤
① 在CTAB提取液中加入2% β-巯基乙醇，在65 ℃水浴锅中预热（CTAB需在65 ℃保温溶解， 充分混匀后使用）；
② 取幼嫩的水稻叶子0.5g，洗净、吸干、剪碎 （冻存材料必须直接研磨，绝对不能化冻； 研磨后的粉末应在化冻前转移，否则内源性 DNase有可能降解）
2、材料、仪器、试剂
• 2.1 材料 水稻幼苗叶子
• 2.2 仪器 ➢高速冷冻离心机、台式离心机、水浴锅、
研钵、50mL离心管及1.5mL Eppendorf （EP）管、移液枪及枪头、药匙。
2、材料、仪器、试剂
▪ 2.3 试剂
➢CTAB提取液： 2%CTAB，100mM Tris-HCl（pH8.0）， 20mM EDTA（pH8.0），1.4M NaCl， 0.1%PVP（聚乙烯吡咯烷酮）， 2% β-巯基乙醇；