植物基因组DNA的提取

成分 CTAB
浓度 2%
DNA 提
取 液
Tris-HCl （pH8.0）
EDTA （pH8.0）
NaCl
PVP （聚乙烯 吡咯烷酮）
βHale Waihona Puke Baidu巯基乙醇
100mM 20mM 1.4M 0.1%
2%
作用
备注
能溶解细胞膜和核膜蛋 白，使核蛋白解聚，使 DNA得以游离出来
CTAB在低于 15℃时容易形 成沉淀析出， 所以用之前要 65℃预热
4、注意事项
➢ 在加入氯仿-异戊醇抽提离心后，拿出离 心管时动作要轻缓，吸取上层溶液时所 用的枪头要减去下面尖端部分，吸取时 不要吸取中间的蛋白质层；
➢ 用70%的乙醇洗DNA后，要使乙醇完全 挥发，否则会对后续的PCR产生影响， 甚至对限制性酶作用产生非特异性；
4、注意事项
➢ 最后溶于TE缓冲液中： 在无离子水溶液中，低浓度的核酸由于 磷酸基负电荷的排斥作用会引起变性。
4、参考文献
[1] 钟卫鸿.基因工程技术实验指导[M].北京： 化学工业出版社，2007，7.
[2] 王镜岩，朱圣庚，徐长法.生物化学教程[M]. 北京：高等教育出版社，2008，6.
[3] 孙明.基因工程[M].北京:高等教育出版社， 2006，5.
[4] 彭学贤.植物分子生物技术应用手册[M].北京： 化学工业出版社，2006，2.
2、材料、仪器、试剂
• 2.1 材料 水稻幼苗叶子
• 2.2 仪器 ➢高速冷冻离心机、台式离心机、水浴锅、
研钵、50mL离心管及1.5mL Eppendorf （EP）管、移液枪及枪头、药匙。
2、材料、仪器、试剂
▪ 2.3 试剂
➢CTAB提取液： 2%CTAB，100mM Tris-HCl（pH8.0）， 20mM EDTA（pH8.0），1.4M NaCl， 0.1%PVP（聚乙烯吡咯烷酮）， 2% β-巯基乙醇；
星星活性
星星活性（star activity）： 在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似 的序列，这个改变的特殊性称星星活性。
影响星星活性的因素有很多：
甘油浓度高（>5%），酶过量（>100U/μL）,离子强度
低（<25mM），pH过高（>8.0），或者加入了有机溶 剂DMSO（二甲基亚砜），乙醇，乙二醇，或者用其 他二价离子如Mn2+、Cu2+、Co2+、Zn2+代替了Mg2+。
放置30min，或者室温放置1h；
⑩ -20 ℃保存。
4、注意事项
➢ CTAB在低于15 ℃时溶于沉淀，所以 使用之前要65 ℃时预热，用前再加 巯基乙醇或者加入亚精胺（100μL DNA加5μL 0.1M的亚精胺）；
➢ 在研磨前，研钵里不得有任何水分， 否则加液氮时容易结冰；
➢ 在用不锈钢灭菌后的药匙移取粉末 时，可用枪头的大头移取；
➢ 10mg/mL RNase A； ➢ 液氮
3、方法与步骤
① 在CTAB提取液中加入2% β-巯基乙醇，在65 ℃水浴锅中预热（CTAB需在65 ℃保温溶解， 充分混匀后使用）；
② 取幼嫩的水稻叶子0.5g，洗净、吸干、剪碎 （冻存材料必须直接研磨，绝对不能化冻； 研磨后的粉末应在化冻前转移，否则内源性 DNase有可能降解）
提供一个缓冲环境，防 止核酸被破坏
螯合Mg2+或Mn2+抑制 DNase活性
提供一个高盐环境，使 DNP充分溶解，存在于 液相中
酚的络合物，能与多糖 和酚类物质形成不溶的 络合物，减少酚的污染， 去除酚和多糖
抗氧化剂，防止酚变成 使用之前再加 醌，避免褐变，使酚容 易去除
2.3 试剂
➢ 氯仿-异戊醇（24:1，v/v） 氯仿是使蛋白质变性并有助于液相与有机相 的分开，而异戊醇可降低表面张力，从而可消 除抽提过程中出现的泡沫；
植物基因组DNA的提取
植物基因组DNA的提取
1、实验原理 2、材料、仪器、试剂 3、方法与步骤 4、注意事项 5、参考文献
植物基因组DNA的提取
植物基因组DNA提取的方法主要有： ➢ SDS法 ➢ CTAB法是一种阳离子去污剂，在高离子强度
的溶液里，CTAB与蛋白质和大多数酸性多聚 糖以外的多聚糖形成复合物，只是不能沉淀 核酸，重要用途提取DNA和RNA。
➢ 异丙醇（-20℃预冷）； ➢ 70%乙醇（-20℃预冷）
洗去DNA表面盐类等杂质；
2.3 试剂
➢ TE缓冲液（pH8.0）： 10mM Tris-HCl，1mM EDTA （pH8.0） ，121 ℃高压蒸汽灭菌 TE中的EDTA 能螯合Mg2+或Mn2+抑制DNase活 性，且pH为8.0，可防止DNA发生酸解；
3、方法与步骤
⑤ 加入1倍体积的冰异丙醇或者2倍体积冰无水乙
醇，颠倒混匀，冰浴1h，或者-20 ℃放置30min， 或-80 ℃放置10min；
⑥ 室温下12000rpm离心10min（可离心时间长一 些）；
⑦ 弃上清，用70%冰乙醇清洗沉淀两次； ⑧ 室温晾干约20~30min；
⑨ 加入100μL TE 缓冲液，加入2μL RNase，37 ℃
1、实验原理
• SDS、CTAB等离子型表面活性剂，能溶解细 胞膜和核膜蛋白，使核蛋白（DNP）解聚，从 而使DNA得以游离出来。
• 再加入苯酚和氯仿等有机溶剂，能使蛋白质变 性，并使抽提液分相，因核酸（DNA、RNA） 水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细 胞碎片和大部分蛋白质。上清液中加入冰无水 乙醇或者异丙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于 TE溶液中，即得植物总DNA溶液。
3、方法与步骤
③ 移入经过预冷的研钵中，加入液氮研钵至粉末 状，用干净的灭菌不锈钢药匙快速转移粉末至 1.5mL离心管中；加入250μL的CTAB提取液，
总体积达到500μL，混匀后置65 ℃磁力搅拌水 浴锅中保温60min；
④ 加入等体积的氯仿-异戊醇（24:1），轻轻地颠 倒混匀，室温下12000rpm离心10min，移至上 清至新1.5mL EP管；（可重复④ ，抽提两次）
CTAB法
CTAB法，是1980年Murray和Thompson 修改而成的快速简便提取植物DNA的方 法。
CTAB法
十六烷基三甲基溴化铵
(cetyltrimethyl ammomum bromide，简称为 CTAB)，为阳离子去污剂，可溶解细胞膜，能 与核酸形成复合物，在高盐溶液（>0.7mol/L NaCl）中可溶，当盐浓度降低到一定程度 （0.3mol/L NaCl）时，可沉淀CTAB-核酸的复 合物，通过有机溶剂抽提和离心沉淀即可除去 蛋白质，多糖和酚等杂质。最后通过冰乙醇或 异丙醇沉淀DNA，而CTAB因溶于冰乙醇或异 丙醇而被除去。