基因工程载体vector
载体的名词解释生物学
载体的名词解释生物学生物学中，载体（Vector）是指用来传递、繁殖和表达外源DNA（或RNA）分子的工具。
在分子生物学和基因工程领域，载体扮演着至关重要的角色。
本文将探讨载体在生物学中的定义、种类、应用以及相关的研究进展。
一、载体的定义载体是指一种生物分子，能够携带外源DNA或RNA分子。
它为这些分子提供一个合适数量及合适的环境，使其稳定存在，并能进行复制、传递和表达。
载体可以是DNA、RNA或蛋白质，也可以是一个细胞、病毒、质粒等。
二、载体的种类1. DNA载体DNA载体是最常见且最重要的载体类别之一。
其中，质粒是最常用的DNA载体。
质粒是一种环状DNA分子，能够自主复制并存在于细胞质中。
质粒可以在接受外源DNA后进行基因复制，从而将外源DNA稳定的传递给目标细胞。
此外，噬菌体也是常见的DNA载体，它是一种病毒，能够感染细菌，并在细菌内复制自身。
2. RNA载体RNA载体主要指RNA病毒，它是一种只能通过RNA复制和传递基因的病毒。
RNA载体包括正义病毒和反义病毒。
正义病毒将其RNA转录成DNA并插入宿主细胞染色体中，从而实现基因传递。
反义病毒则利用RNA复制酶来生成更多的RNA病毒。
三、载体的应用1. 外源基因表达载体在基因工程中广泛应用于外源基因表达。
研究人员可以将感兴趣的基因插入载体中，然后将其导入目标细胞。
通过选择适当的载体和表达元件，外源基因可以被成功地表达出来。
这对于探究基因功能、生物制剂的生产以及疾病治疗等方面都具有重要意义。
2. 基因治疗载体在基因治疗中扮演着关键的角色。
基因治疗是一种利用外源基因修复或替代患者体内缺乏或异常基因的方法。
通过将修复好的基因插入载体中，并将其导入患者体内，可以实现基因的传递和修复，从而治疗患者的遗传性疾病。
3. 基因传递载体还可以用于基因传递研究。
通过将感兴趣的基因插入载体中，研究人员可以将其引入目标细胞，并观察和研究基因的功能和表达。
这对于揭示基因功能及相关生理机制具有重要意义。
基因工程
.R质粒:通称抗药性因子。它们编码有一种或数 种抗菌素抗性基因，并且通常能够将此种抗性 转移到缺管该质粒的适宜的受体细胞，使后者 也获得同样的抗菌素抗性能力。
.Col质粒:即所谓产生大肠杆菌素因子。它们 编码有控制大肠杆菌素合成的基因。大肠杆菌 是一类可以使不带有Col质粒的亲缘关系密切 的细菌菌株致死的蛋白质。
在P2噬菌体 在P2噬菌体溶
局限性：只能以P2噬菌体溶原细胞作为受体 （2）最常用的筛选标记：Lac Z基因
主要有如下特点：
(1)筛选简便； (2)可克隆的片段大，最大可达23 kb， 而质粒最大仅10 kb左右； (3)转化效率高。
λ噬菌体载体可分为：
插入型载体 替换型载体λ噬菌体载体是主要用于cDNA构建， 也经常用于外源目的基因的克隆。
质粒转移的必备条件
1.转移起点(oriT),它是质粒DNA转移时的复制起点— 顺式作用（cis-action） 2. 细胞附属物—性纤毛，由蛋白质构成—反式作用
3.转移过程所需的全部酶类—反式作用
质粒转移类型 1.自我转移（Self-transmissible） 2.辅助转移（Donation）—可转移质粒仅具备 oriT，若无辅助质粒，前者不会发生接合转移。 若辅助质粒可提供所有反式作用的蛋白质，前 者便会发生接合转移。
注意：λ噬菌载体作为载体，其重组噬菌体DNA 大小只能： 38kb ~ 52kb。
体外包装：λ噬菌载体 + 尾部蛋白 + 头部蛋白
3.单链DNA噬菌体载体
M13、f1、fd是一类亲缘关系十分密切的丝状 大肠杆菌噬菌体。 优点： .单链DNA噬菌体的复制，是以双链环形DNA为 中间媒介的，复制形式的DNA（RF DNA） .RF DNA和ssDNA，都能够转染感受态的大肠杆 菌细胞
基因工程载体
基因工程载体体外获得的任一DNA片段,必须插入到能够自我复制的载体内,再转入宿主细胞,才能得到复制和进行表达。
基因工程载体(Vectors)确实是携带外源基因进入受体细胞进行繁育和表达的一种工具。
载体的功能运送外源基因高效转入受体细胞为外源基因提供复制能力或整合能力为外源基因的扩增或表达提供必要的条件基因工程中3种要紧类型的载体：1.质粒载体2.噬菌体载体3.柯斯质粒〔cosmid〕载体基因工程对载体的要求〔1〕在宿主细胞内能独立复制。
〔2〕有选择性标记。
〔3〕有一段多克隆位点。
外源DNA插入其中不阻碍载体的复制。
〔4〕分子量小，拷贝数多。
〔5〕容易从宿主细胞中分离纯化。
第一节质粒(plasmid)载体质粒是一种独立于染色体外的双链闭环的DNA分子，具有自主复制和转录能力，能在子代细胞中保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息。
质粒的复制和转录要依靠于宿主细胞编码的某些酶和蛋白质，如离开宿主细胞那么不能存活，而宿主即使没有它们也能够正常存活。
(一)质粒的构形环形双链的质粒DNA在提取过程中通常显现三种不同的构型：①共价闭合环形DNA〔cccDNA〕②开环DNA〔open circular,ocDNA〕③线形DNA〔linear,lDNA〕〔二〕质粒的转移性指质粒从一个细胞转移到另一个细胞的特性。
接合型质粒：除了带有自我复制所必需的遗传信息外，还带有一套操纵细菌配对和质粒接合转移的基因。
如：F质粒〔性质粒或F因子〕甚至能使寄主染色体上的基因随其一道转移到原先不存在该质粒的受体菌中。
不符合基因工程的安全要求。
非接合型质粒：带有自我复制所必需的遗传信息，但失去了操纵细菌配对和质粒接合转移的基因，因而不能从一个细胞转移到另一个细胞。
如R质粒〔抗性质粒〕、Col质粒〔细菌素养粒〕。
符合基因工程的安全要求。
R质粒：带有一种或数种抗生素抗性基因，使寄主获得同样的抗生素抗性性状〔resistance〕。
Col质粒：细菌素通过与敏锐细菌细胞壁的结合作用，抑制一种或数种细胞生命过程。
《基因工程》第三章 载体2
Such as ultraviolet light
Cell division
Assembled or packaged Lysis of cell and release of mature phage particles
2.λ噬菌体作为克隆载体的依据
①λ噬菌体温和噬菌体，感染性高，易操作。
β—半乳糖苷酶基因（lacZ 和lacZα） β—半乳糖苷酶基因有1021 AAs，基因产物不具酶活性，装配 为四聚体后才有酶活。该蛋白质可分为两部分：α链和β链。前 者负责四聚体装配，后者具β—半乳糖苷酶活性；只有当两者都 存在时，才会表现出酶活性，该作用称之为α-互补作用。这两个 部分可独立存在， 分别由两个基因编码。为α链编码的基因称之 为lacZα(编码145 AAs)。这两个基因（LacZ和LacZα）均可作为 标记基因。 β—半乳糖苷酶基因的优点: a. 酶催化X-Gal水解为兰色产物，检测直观 b. lacZα编码5'-端可容许很大的变化而不影响酶活性 c. lacZα和β链基因的分别表达可使载体小而容量大
荧光素酶基因 荧光素酶或由萤火虫产生的可催化蜜蜂荧光素氧化的酶，并 产生荧光，若在反应中加入CoA，可使灵敏度提高10倍；或由发 光细菌（Photobacterium fischeri）产生的荧光素酶，它与 FMN-氧化还原酶联用，通过NAD(P)H的变化测定酶活。
发光蛋白质基因 发光蛋白是由水母产生的一种可发光的蛋白质，该蛋白质可 使大肠杆菌菌落呈蓝色。
Polylinker or multiple cloning site [MCS]
pUC family
pUCm-T载体(pUCm-T Vector): 1 线性化的载体， 2 载体每条链的3’端带有 一个突出的T。
基因工程载体
Foreign gene
MCS
Marker
作为基因工程载体的条件
具备与外源DNA片段连接和重组的克隆位点． 进入受体细胞后能稳定存在于细胞质中或与染 色体整合在一起．
在宿主细胞或受体细胞中自我复制或随整合的 受体细胞染色体DNA一起复制．
外源基因能在受体细胞中表达．
克隆载体进入细胞后有可供选择标记．
质粒载体的一般特性
质粒的组成与构型 细胞内：超螺旋环状共价双链DNA分子 细胞外：超螺旋、开环，线形
双螺旋共价闭合 环（超螺旋）
开环双螺旋 （一个裂口）
线状双螺旋 （两个裂口）
质粒DNA分子的大小：细菌质粒的大小相差较大， 小的仅不足1kb，大的可达数百kb.
不相容性（Incompatible）：两种类似的但又不 同的质粒不能存在于同一细胞中．
结构：外壳蛋白 DNA
形态：头部 尾部
λ噬菌体的电子显微镜照片
λ基因组DNA的特点
a) 在噬菌体内呈线性双链DNA分子(48502bp) 在两端各有12个碱基组成的5’单链互补粘 性末端(Cohesive end ),进入宿主细胞后, 粘性末端连接形成环状分子(Cos位点)． 5’-GGGCGGCGACCTXX…XXG-3’ XX…XXCCCCGCCGCTGGA-5’
b) λ基因组DNA上有多种限制酶识别位点． c) λ噬菌体包装DNA的大小为原λDNA长度的
75-105%( 38-54 kb)．
1.2 λ基因组DNA的结构
噬菌体的组装
三、病毒载体
• 质粒和噬菌体载体只能在细菌中繁殖，不能满足 真核DNA重组需要。感染动物的病毒可改造用作 动物细胞的载体。由于动物细胞的培养和操作较 复杂、花费也较多，因而病毒载体构建时一般都 把细菌质粒复制起始序列放置其中。使载体及其 携带的外来序列能方便地在细菌中繁殖和克隆， 然后再引入真核细胞。目前病毒载体常用者有改 造来自猴肾病毒SV40（Simian Virus 40）、逆转 录病毒和昆虫杆状病毒等，使用这些病毒载体的 目的多为将目的基因或序列放入动物细胞中表达 或试验其功能、或作基因治疗等。
基因工程载体
第三章基因工程载体体外获得的任一DNA片段,必须插入到可以自我复制的载体内,再转入宿主细胞,才能得到复制和进行表达。
基因工程载体(Vectors)就是携带外源基因进入受体细胞进行繁殖和表达的一种工具。
载体的功能运送外源基因高效转入受体细胞为外源基因提供复制能力或整合能力为外源基因的扩增或表达提供必要的条件基因工程中3种主要类型的载体：1.质粒载体2.噬菌体载体3.柯斯质粒（cosmid）载体基因工程对载体的要求（1）在宿主细胞内能独立复制。
（2）有选择性标记。
（3）有一段多克隆位点。
外源DNA插入其中不影响载体的复制。
（4）分子量小，拷贝数多。
（5）容易从宿主细胞中分离纯化。
第一节质粒(plasmid)载体质粒是一种独立于染色体外的双链闭环的DNA分子，具有自主复制和转录能力，能在子代细胞中保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息。
质粒的复制和转录要依赖于宿主细胞编码的某些酶和蛋白质，如离开宿主细胞则不能存活，而宿主即使没有它们也可以正常存活。
(一)质粒的构形环形双链的质粒DNA在提取过程中通常出现三种不同的构型：①共价闭合环形DNA（cccDNA）②开环DNA（open circular,ocDNA）③线形DNA（linear,lDNA）（二）质粒的转移性指质粒从一个细胞转移到另一个细胞的特性。
接合型质粒：除了带有自我复制所必需的遗传信息外，还带有一套控制细菌配对和质粒接合转移的基因。
如：F质粒（性质粒或F因子）甚至能使寄主染色体上的基因随其一道转移到原先不存在该质粒的受体菌中。
不符合基因工程的安全要求。
非接合型质粒：带有自我复制所必需的遗传信息，但失去了控制细菌配对和质粒接合转移的基因，因而不能从一个细胞转移到另一个细胞。
如R质粒（抗性质粒）、Col质粒（细菌素质粒）。
符合基因工程的安全要求。
R质粒：带有一种或数种抗生素抗性基因，使寄主获得同样的抗生素抗性性状（resistance）。
Col质粒：细菌素通过与敏感细菌细胞壁的结合作用，抑制一种或数种细胞生命过程。
vector nti 载体分析
载体（vector） ，指在基因工程重组DNA技术中将DNA片 段（目的基因）转移至受体细胞的一种能自我复制的DNA 分子。
载体必备条件 ①含有复制起始位点，能够独立复制,在宿主细胞中能保存下来 并能大量复制。 ②有多个限制酶切点，而且每种酶的切点最好只有一个。 ③有一定的标记基因，便于进行筛选。 三种最常用的载体是细菌质粒、噬菌体和动植物病毒。
①Ori的位置，了解质粒的 类型
③筛选标记
载体必备条件 ①含有复制起始位点， 能够独立复制,在宿主 细胞中能保存下来并能 大量复制。 ②有多个限制酶切点， 而且每种酶的切点最好 只有一个。 ③有一定的标记基因， 便于进行筛选。
①Ori的位置，了解质粒的 类型（原核/真核/穿梭质 粒）
②看多克隆位点（MCS）
③筛选标记 ④表达系统元件
谢谢
pBR322是一个人工 构建的重要质粒， 有万能质粒之称。 它是由pSF2124、 pMB1及pSC101三个 亲本质粒经复杂的 重组过程构建而成 的。
如何读懂质粒图谱
p BR 322
Plasmid 研究者Bolivar和Rogigerus
实验编号
载体必备条件 ①含有复制起始位点， 能够独立复制,在宿主 细胞中能保存下来并能 大量复制。 ②有多个限制酶切点， 而且每种酶的切点最好 只有一个。 ③有一定的标记基因， 便于进行筛选。
植物基因工程载体
4、植物病毒载体
与农杆菌Ti质粒载体相比, 植物病毒表达载体 系统具有许多优点: 首先，是病毒增殖水平较高, 可使伴随的外源基因高水平表达; 其次, 病毒增殖 速度快, 外源基因在很短时间(通常在接种后1~2 周内)可达最大量的积累; 第三, 病毒基因组小, 易 于进行遗传操作, 大多数植物病毒可以通过机械 接种感染植物, 适于大规模商业操作; 第四, 宿主 范围广, 一些病毒载体能侵染农杆菌不能或很难 转化的单子叶、豆科和多年生木本植物, 扩大了 基因工程的宿主范围; 第五, 病毒颗粒易于纯化, 可显著降低下游生产成本。所以植物病毒是外
而根瘤菌染色体上的操纵子表达产
物则与单链T-DNA结合形成复合物，
后者转化植物根部细胞。
植物根部 羟基乙酰丁香酸 Ti 质粒 单链 T-DNA
植物细胞
Ti 质粒的结构与功能
T-DNA的染色体整合机制
表达 特异性核酸内切酶
在LB和RB的第三和第四个碱基之间切开 单链T-DNA整合在植物的基因组上
Ti 质粒的结构与功能
名称
酵母人工染色体(YAC)
人工染色体的种类和特点
宿主细胞
功能元件来 源
结构
插入片段 容量
参考文献
酵母细胞
酵母染色体
线状DNA 100~2000(kb)
Murry,et al.,1983
细菌人工染色体(BAC)
大肠杆菌
大肠杆菌F因子
环状质粒 <350(kb)
Shizuya,et al.,1992
来源于P1人工染色体(PAC)
电击法
将高浓度的质粒DNA加入到植物细胞的原 生质体悬浮液中，混合物在 200 - 600 V / cm 的电场中处理若干秒钟，然后将原生质体在组 织培养基中生长 1 - 2 周，再生出整株植物。
载体(vector)一个能够在宿主生物体内进行复制的DNA分子,其间
重组DNA 分子。P313
载体的主要功能就是能够在宿主细胞内进行
复制（或整合）和表达，除此之外载体还要 为外源基因提供进入受体细胞的能力。
载体必备特性 1.具有对受体细胞的可转移性，提高载体导入受体 细胞的效率；
2.1.5 Plasmids in organisms other than bacteria
The yeast 2μm plasmid
2.2 Bacteriophages
2.2.1 Basic features of bacteriophages
2.1.3 Conjugation and compatibility
一个非接合性质粒可以在某些环境下，在与接合质粒共存于同 一个细胞的情况下，发生协同转移。
2.1.3 Conjugation and compatibility
质粒的不相容性：具有相同或相似复制子结构及特征的 两种不同的质粒不能稳定的存在于同一受体细胞内，这 种现象称为质粒的不相容性。
2.1.1 Basic features of plasmids
Replication strategies for (a) a nonintegrative plasmid, and (b) an epiopy number
质粒大小范围：1.0kb～250kb。构建克隆载体的 质粒大小一般要小于10kb。
λ噬菌体适合作克隆载体的优点
λDNA中功能相关基因簇集分布
λ噬菌体 DNA的两个 5′末端为 12bp的单链 ，两端序列 互补成为天 然的“粘性 末端”。 λ 噬菌体DNA 进入宿主菌 后，通过两 个末端互补 结合而形成 粘性末端位 点（cohesive end site,简称 cos位点）， 整个DNA分 子环化。
基因工程载体(vector)性质以及应用
pSC101质粒载体性质：
①严紧型复制控制 低拷贝 1-2个拷贝/细胞 ②9.09kb ③编码一个tetr， 有EcoRⅠ、 HindⅢ、BamHⅠ等7个
酶切单一位点，可插入失活。 缺点：低拷贝，表达效率低。
pSC101是第一个成为用于克隆真核DNA的大肠杆菌 质粒载体，1973年成功地将带有非洲爪蟾核糖体基 因的EcoRI DNA片段，连接到pSC101复制子上。
基因工程载体（vector）性质和应用
㈢、重要的质粒载体
目前常用于基因克隆的质粒载体均为人工构建。 经改造后达到这些要求： ①其分子结构中必须具有多个单一限制酶切割位点， 且切点最好位于选择性标记上 ②构建重组质粒后必须具有转化功能 ③最好带有两个以上强选择性标记 ④分子量较小，为松弛型复制控制，易于操作 ⑤宿主范围小，无感染性，不受其他质粒诱动。
野生型的λ噬菌体DNA两端各具12个核苷酸组成 的粘性末端，可用来构建柯斯质粒（cosmid）。
基因工程载体（vector）性质和应用
l 噬菌体生物学特性： 生物结构
1、λ噬菌体的结构和性质
λ噬菌体为双链DNA病毒，宿主
为E.Coli。在宿主内有溶菌和溶
源两种形式，在溶源方式中，噬 菌体感染宿主后其DNA整合到宿 主染色体DNA中，伴随宿主染色 体复制而复制。
基因工程载体（vector）性质和应用
基因工程载体（vector）性质和应用
λ噬菌体DNA是有48502bp组成的线性双螺旋分子，分子量 3.1×107dal。 迄今已定位的基因至少61个，其中一半参与了噬菌体生命 周期的活动，我们称这类基因为λ噬菌体的“必要基因 ”； 另一部分基因，当它们被外源基因取代后，并不影响噬菌 体的生命功能，我们称这类基因为λ噬菌体的“非必要基因”。 这为其作为基因工程噬菌体载体的基础。
基因工程复习
基因工程复习一、名词解释1、载体（Vectors）：在基因工程操作中，把能携带外源DNA进入受体细胞的DNA分子叫载体。
2、质粒（plasmid）：是生物细胞内固有的、能独立于寄主染色体而自主复制、并被稳定遗传的一类核酸分子，多存在于细菌、霉菌、蓝藻、酵母等细胞中。
绝大多数的质粒是DNA型的，具有共价、封闭、环状双链的分子结构，即cccDNA。
3、穿梭质粒载体（shuttle plasmid vectors）：人工构建的、具有两种不同复制起点和选择标记、可以在两种不同的寄主细胞中存活和复制的质粒载体。
4、噬菌粒载体（phagemid vectors）：是一类人工构建的含有单链噬菌体包装序列、复制子以及质粒复制子、克隆位点、标记基因的特殊类型的载体。
5、cos位点（cohensive-end site DNA两端各有12bp的粘性末端，粘性末端形成的双链区域称为cos位点。
6、柯斯克隆：应用cosmid载体在大肠杆菌中克隆大片段的真核基因组DNA技术，叫“柯斯克隆”（cosmid cloning）。
7、限制性内切酶（Restriction endonuclease）：是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列（4—8bp），并由此处切割DNA双链的核酸内切酶。
8、限制-修饰系统（Restriction modification system）：是一种存在于细菌，限制性内切酶将侵入细菌体内的外源DNA切成小片断，细菌自身的DNA碱基被甲基化酶甲基化修饰所保护，不能被自身的限制性内切酶识别切割，从而保护个体免于外来DNA的侵入的系统。
9、Klenow fragment: Klenow片段，是大肠杆菌DNA聚合酶I的大片断，用枯草杆菌蛋白酶位点特异性降解的方法从DNA聚合酶I中制备，其保留了DNA聚合酶I的5'→3'聚合酶活性和3'→5'外切酶活性，但缺少5'→3'外切酶活性。
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人类基因组草图绘制完成
基因工程历史中的三个重要事件
1、1972年，美国斯坦福大学的P. Berg博士率先 完成了DNA体外重组试验。（分享1982年诺贝 尔化学奖）
EcoR1 T4DNA连接酶
SV40DNA+λ嗜菌体DNA
重组DNA
2、具有性状功能的基因能否重组？
1973年，美国斯坦福大学的S.Cohen等人成功地进行了另一个 体外DNA重组试验。
R6-5 +pSC101 EcoR1 T4DNA连接酶 重组DNA转入大肠杆菌重组菌
Kanr Tetr
Kanr + Tetr
三、主要步骤与内容：
1、获得目的基因
2、在体外，将带有目的基因的外源DNA片段连接到能自我 复制并具有选择记号的载体分子上，形成重组DNA分子。
3、将重组DNA分子转移到适当的宿主细胞中，并与之一起 增殖。
4、从大量细胞繁殖群体中，筛选出获得重组DNA分子的 宿主细胞克隆。
5、从这些筛选出来的宿主细胞克隆中，提取出已经得到 扩增的目的基因，供进一步分析研究用。
社 2006
第一节 基因工程的发展历史和基本概念 一、基因工程的发展历史
基因工程发展史有关的重要事件
年份
重要事件
1869 1944 1953 1958 1961
1965 1966 1967 1970 1972~1 973 1974 1975~1 977 1982 1985 1997 2000
F.Miescher首次从鲑鱼精子中分离到DNA O.T.Avery等人在肺炎链球菌转化实验中发现遗传信息的携带者是DNA而不是蛋白质 J.D.Watson和H.C.Creck提出了DNA分子结构的双螺旋模型 M.Meselson和F.W.Stahl提出了DNA半保留复制模型 M.W.Nirenberg等人应用合成的mRNA分子[poly(U)]破译出了第一批遗传密码 F.Jacob和J.Monod提出了调节基因表达的操纵子模型 证明细菌的抗药性通常有一类叫”质粒”的额外染色体携带
（2）识别位点即为切割位点；
（3）位点上核苷酸顺序通常呈双重旋转对称结构， 即呈回文结构。
EcoR I的切割位点
EcoR I的识别序列
5‘ … G C T G A A T T C G A G … 3’ 3‘ … C G A C T T A A G C T C … 5’
切割方式通常有三种：
①在识别顺序两条链对称轴上同时切断磷酸二酯键，形成 齐平末端。如HaeⅢ， PvuII。
6、将目的基因克隆到表达载体上，导入宿主细胞，使之 在新的遗传背景下实现功能表达，产生出人类所需要的 物质。
第二节 基因工程的工具酶
定义：凡在基因工程中应用的酶统称为工具酶。
一、限制酶 (restrict enzymes)
（一）限制与修饰现象 大多数的细菌对于噬菌体的感
染都存在一些功能性障碍，即所 谓的寄主控制的限制(restriction)和 修饰(modification)现象，简称R/M 体系。
M.W.Nirenberg,S.Ochoa,H.G.Khorana共同破译了全部的遗传密码 发现了可将DNA连接起来的DNA连接酶 H.O.Smith等分离到第一种核酸内切限制酶,它可以在特定位点将DNA分子切割开来 以H.Boyer,P.Berg等人为代表的一批美国科学家发展了重组DNA技术,并于己于1972年得到第一 个重组的DNA分子,1973年完成第一个细菌基因的克隆 首次实现了异源真核生物基因在大肠杆菌中的表达
PvuII 37 ℃ 5‘ … G-C-T-C-A-G-OH
பைடு நூலகம்
P-C-T-G-G-A-G … 3’
参考书
1、基因工程原理 吴乃虎 科学出版社 第二版 1998
2、分子克隆实验指南 第二版 J.萨姆布鲁克等 科 学出版社 1992
3、现代生物技术导论 瞿礼嘉等 高等教育出版社 1998
4、现代生物技术概论 何忠效等 北京师范大学出 版社
5、生物制药技术 王旻等 化学工业出版社 2003 6、基因工程 楼士林等 科学出版社 2002 7、生物技术与生物药物 王旻等译 化学工业出版
转移到原核细胞重并实现其功能表达。 3、说明了质粒-大肠杆菌不失为一种成功的基因克隆体
系，可以作为基因克隆的模式系统进行深入研究。
二、基本概念 定义：基因工程是指按照人们的意愿，在体外将
核酸分子插入病毒、质粒或其他载体分子，构 成遗传物质的新组合，并使之转入到原先没有 这类分子的宿主细胞内，形成能持续稳定繁殖 的新物种。其目的是为人类提供有用产品及服 务。
3、不同物种、尤其是真核 基因能否在原核生物中重 组与表达？ 1974年，S.Cohen与 H.Boyer合作进行了如下 试验，结果表明：动物基 因的确进入到大肠杆菌细 胞，并转录出相应的RNA.
以上试验的重要意义有三点： 1、说明像pSC101这样的质粒分子是可以作为基因克隆的
载体，能够将外源DNA分子导入宿主细胞。 2、说明像非洲爪蟾这样真核动物的基因是可以被成功地
②在识别顺序两条链对称轴上两侧同时从5‘ 端切断磷酸 二酯键，形成5‘ 磷酰基端2~5个核苷酸单链粘性末端。 如EcoRⅠ。
③在识别顺序两条链对称轴上两侧同时从3‘ 端切断磷酸 二酯键，形成3‘羟基端2~5个核苷酸单链粘性末端。入 PstⅠ。
PvuII等产生的平头末端
5‘ … G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G … 3’ 3‘ … C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C … 5’
作用：一是保护自身的DNA不受限制， 而是破坏外源DNA使之迅速降解。
（二）限制酶的命名和分类
定义：凡在识别并切割双螺旋DNA分子内特定核苷酸 顺序的酶统称为限制酶。 （1）限制酶命名：
（2）限制酶分类：
根据酶的性质，可分为三类
（三）第Ⅱ型限制酶的作用性质
1、基本特性：
（1）识别位点为4~8个核苷酸序列；