基因工程的载体
基因工程载体
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基因诊断
利用基因工程载体携带特定的检测基因或标记物， 对疾病相关基因进行快速、灵敏的检测和诊断。
应用领域与前景
农业生产
通过基因工程载体将优良性状基因导入农作物或家畜家禽的 基因组中，改良品种性状，提高产量和品质。
前景
随着科学技术的不断进步和创新，基因工程载体的研究和应 用将更加深入和广泛。未来，基因工程载体有望在个性化医 疗、精准农业、生物安全等领域发挥更大的作用，为人类健 康和生活质量的提高做出更大的贡献。
人工染色体载体
概念
人工染色体载体是一种基于天然染色体结构设计的基因工程载体，可模拟天然染色体的功 能和特性。
优点
人工染色体载体具有较大的容量，可容纳多个外源基因和调控元件。此外，人工染色体载 体还具有稳定的遗传特性和较低的免疫原性，可实现外源基因的长期稳定表达和遗传。
缺点
人工染色体载体的构建和操作相对复杂，技术难度较大，且成本较高。目前主要应用于基 础研究和临床试验阶段。
潜在生态风险分析
基因污染
基因工程载体可能通过水平基因转移等方式，将外源基因 导入非目标生物体内，造成基因污染。
生态平衡破坏
外源基因的导入可能对目标生物及其相关生物种群的生态 平衡产生不良影响，如改变种间竞争关系、影响食物链等。
生物多样性减少
基因工程载体的广泛应用可能导致生物多样性减少，特别 是对一些濒危物种和生态系统的影响更为显著。
人类健康影响评估
食品安全问题
基因工程载体在食品生产中的应用，如转基因作物，可能对人体健 康产生潜在风险，如引发过敏反应、产生毒素等。
医药安全问题
基因治疗等医疗手段的应用，可能存在潜在的安全隐患，如基因编 辑的脱靶效应、基因治疗的副作用等。
基因工程载体
基因工程载体体外获得的任一DNA片段,必须插入到能够自我复制的载体内,再转入宿主细胞,才能得到复制和进行表达。
基因工程载体(Vectors)确实是携带外源基因进入受体细胞进行繁育和表达的一种工具。
载体的功能运送外源基因高效转入受体细胞为外源基因提供复制能力或整合能力为外源基因的扩增或表达提供必要的条件基因工程中3种要紧类型的载体：1.质粒载体2.噬菌体载体3.柯斯质粒〔cosmid〕载体基因工程对载体的要求〔1〕在宿主细胞内能独立复制。
〔2〕有选择性标记。
〔3〕有一段多克隆位点。
外源DNA插入其中不阻碍载体的复制。
〔4〕分子量小，拷贝数多。
〔5〕容易从宿主细胞中分离纯化。
第一节质粒(plasmid)载体质粒是一种独立于染色体外的双链闭环的DNA分子，具有自主复制和转录能力，能在子代细胞中保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息。
质粒的复制和转录要依靠于宿主细胞编码的某些酶和蛋白质，如离开宿主细胞那么不能存活，而宿主即使没有它们也能够正常存活。
(一)质粒的构形环形双链的质粒DNA在提取过程中通常显现三种不同的构型：①共价闭合环形DNA〔cccDNA〕②开环DNA〔open circular,ocDNA〕③线形DNA〔linear,lDNA〕〔二〕质粒的转移性指质粒从一个细胞转移到另一个细胞的特性。
接合型质粒：除了带有自我复制所必需的遗传信息外，还带有一套操纵细菌配对和质粒接合转移的基因。
如：F质粒〔性质粒或F因子〕甚至能使寄主染色体上的基因随其一道转移到原先不存在该质粒的受体菌中。
不符合基因工程的安全要求。
非接合型质粒：带有自我复制所必需的遗传信息，但失去了操纵细菌配对和质粒接合转移的基因，因而不能从一个细胞转移到另一个细胞。
如R质粒〔抗性质粒〕、Col质粒〔细菌素养粒〕。
符合基因工程的安全要求。
R质粒：带有一种或数种抗生素抗性基因，使寄主获得同样的抗生素抗性性状〔resistance〕。
Col质粒：细菌素通过与敏锐细菌细胞壁的结合作用，抑制一种或数种细胞生命过程。
基因工程-载体
常用的质粒载体 pUC系列
University of California的J. Messing和J. Vieria于1978年，在pBR322的基础上改造 而成。属正选择载体。如pUC7、pUC8、pUC9、pUC10、pUC11、pUC18、pUC19。 1、元件来源 复制起点ori---pBR322的 ori Ampr 基因---pBR322的Ampr基因 大肠杆菌β-半乳糖基因（lacZ’基因） 多克隆位点（MCS）区段---位于lacZ’基因 中的靠近5`-端。 2、长度 约2.7kb
Apr转化子 Tcr转化子
影印到Tc平板上 影印到Ap平板上
Apr TcS为重组子 ApS Tcr为重组子
Apr Tcr为原载体
即为非重组子
Ampr
1)限 制 酶 切 2)DNA重 组
无 DNA插 入
Ampr Tcr
转化
Ampr Tcr
Tc
有 DNA插 入 外 源 DNA
Ampr Tcs Ampr Tcs
2、非接合型质粒（不能自我转移）：虽然带有自我复制所必需的遗传信息， 但失去了控制细菌配对和质粒接合转移的基因，因此不能从一个细胞转移到另一
个细胞。如R质粒（抗生素抗性质粒）和Col质粒（大肠杆菌素colicin ）。符合 基因工程的安全要求。
大肠杆菌素是大肠杆菌分泌的一类细菌素（bacteriocin），对于其他不能分泌特异性大肠 杆菌素免疫蛋白（Immunity protein）的细菌具有杀灭作用，现在一般认为有调节菌群数 量的作用。 大部分大肠杆菌素由质粒编码，其中最著名的没过于pColE1 。
第一节 质粒载体
质粒（plasmid）：是独立于染色体以外的能自主复制的双链闭合环状DNA分子。 广泛存在于细菌、霉菌、蓝藻、酵母等细胞中。
基因工程中常用载体及其主要特点
基因工程中常用载体及其主要特点基因工程这一话题，听起来就像科幻小说里的情节，其实离我们并不遥远。
今天咱们就聊聊基因工程中的一些常用载体，简单明了，让你听得懂，明白得了！准备好了吗？那就跟我一起走进这奇妙的基因世界吧！1. 什么是载体？首先，得先搞清楚，什么是载体。
简单来说，载体就是那些能“背负”外来基因的“快递小哥”。
它们把我们想要的基因装上，然后送到目标细胞里。
这就像是你点了一份外卖，外卖小哥把美味的食物送到你家。
没有它们，我们的基因工程可就没法开展了。
想象一下，如果没有这些小哥，基因可怎么进得了细胞的大门呢？1.1 质粒载体说到载体，质粒可算是老前辈了。
质粒就像是细菌的“USB闪存”，它能自我复制，携带外来基因，简直就是基因工程的明星。
质粒的特点是操作简单、成本低，而且它们在细菌中可以很稳定地传递下去。
想想看，若是你把一张重要的文件放在闪存里，不仅可以在一台电脑上使用，还能借给朋友，这种“共享经济”在基因界也在不断上演。
质粒载体就是这样的存在，方便又实用，真是个好帮手！1.2 噬菌体载体再说说噬菌体载体。
这个名字听起来就有点威风，实际上它就是一种能感染细菌的病毒。
噬菌体载体像个特种部队，能精准地将目标基因送到细菌里。
它的特点是能在细菌中以极高的效率进行复制。
想象一下，像忍者一样悄无声息地完成任务，真是酷毙了！当然，它的使用相对复杂，需要一定的技术支持，不过一旦掌握，可是非常厉害的工具。
2. 常见的真核载体讲完细菌的载体，咱们再来看真核细胞的载体，这可得好好聊聊了。
2.1 真核表达载体真核表达载体，是为了在真核细胞中表达外来基因而设计的。
这就像是在高档餐厅里，得有专业的厨师才能把菜做好。
真核表达载体通常含有强大的启动子、终止子和选择标记。
它们能够确保外来基因在真核细胞中顺利表达。
举个例子，就像你去商场买了新衣服，得先试穿才知道合不合适，对吧？这载体也得确保外来基因在细胞中能够“穿”得合适，才能发挥作用。
基因工程第五章-载体
cccDNA在较高高的温度和PH值条件下才会变性，（较线 性和开放环结构的DNA），如果变性，由于团在一起，条 件恢复后，会很快复性，形成cccDNA，线性和环状的变 性后，复性会形成杂乱的大分子团状结构，从而从体系中 沉淀下来。
3. 质粒DNA的分子量和拷贝数：
按质粒的分子量大小，可分为量大类： 3――7kb，拷贝数多； 70－150kb，含有与质粒功能有关的更多基因，可自我传 递（可编码一套控制质粒DNA转移的基因，所以可从一 个细胞转到另一个细胞），如果一个细胞含有这种质粒， 他可以带动小质粒进行传递转移。这种质粒的拷贝数低。
质粒的拷贝数：分子的多与寡是决定产量的重要因素。
pBR322 拷贝数大于25个 ColE1 15个 产量0.23ug/ml 0.11 ug/ml
基因克隆尽量选择松弛型质粒，如果是严紧型要进行质粒 复制子改造。
质粒的大小：通常质粒越大，拷贝数也越少，所以我们 在进行基因重组时，首先要选择分子量小的质粒，其次 质粒分子量大的要使外源基因的片断长度合适，不要过 大。
பைடு நூலகம் 2、pUC质粒载体：
pUC质粒载体：是由美国加利福尼亚大学的专家构建 的。是在pBR322质粒载体的基础上，组入了一个带 有多克隆位点的LacZ’基因，而发展成为具有双功能 检测特性的质粒载体。
最常用的克隆载体，优点： 具有更小的相对分子量和更高的拷贝数。 在构建pUC质粒载体时仅留下pBR322的复制起始起 始位点和AMP抗性基因，分子大大减小，他的拷贝数 可以达到500－700个/个细胞。 适合组织化学法检测重组子。有利于检测 具有多克隆位点，便于片断的插入。
沉淀出来。
第一步：（1）在5m1含相应抗生素的LB培养基中接种 一单菌落，于37℃剧烈振荡培养过夜。（2）将1.5m1 培养物倒入Eppendorf管中，用微量离心机于4℃以 12000rpm离心30秒。 （3）吸去培养液，使细菌沉淀 尽可能干燥。（4）将细菌沉淀重悬于100μl用冰预冷的 溶液I中（溶液Ⅰ：50mmol／L 葡萄糖， 25mmol／L Tris· (pH 8．0)， 10mmol／L CI EDTA(pH 8．0，溶菌酶4－5mg，酶作用环境由缓冲 液提供)。剧烈振荡。须使细菌沉淀在溶液Ⅰ中完全分 散，将两个微量离心管的管底部互相接触，室温静止5 －30min，细胞壁降解。
第三章基因工程载体
3个会导致Ampr基因失活
9个导致Tetr基因失活
氨苄青霉素和四环素抗性 24个单一克隆位点。
pBR322的优点
① 双抗生素抗性选择标记
抗生素抗性基因的插入失活效应是检测重 组体质粒的有效方法，分两次先后选择： 没有获得载体的寄主细胞 在Amp或Tet中都死亡。 获得重组载体的寄主细胞 在Aplasmid ）:在整个细胞
周期中随时可以复制，每个细胞中有许多拷贝, 一般10-60 拷贝，如Col E1质粒。
氯霉素扩增：在抑制蛋白合成并阻断细菌染色体
复制的氯霉素存在时，松弛型质粒可继续扩增， 其拷贝数可达2000-3000个，称氯霉素扩增效应
严紧型复制质粒 （stringent plasmid ）：
plasmid 接合型质粒（自我转移的 质粒）：质粒可从一个细胞自发转移到另一个细胞。
Non
Conjugative plasmid 非接合型质粒
（不能自我转移的质粒）：由于失去控制细菌配 对和自我转移的基因，质粒不能从一个细胞自发 的转移到另一个细胞。
结合型质粒：相对分子质量大、拷贝数小、 严紧型复制 非结合型质粒：相对分子质量小、拷贝数多、松弛型复制
① colicin E1基因的结构 cea imm 免疫基因 kil 溶菌基因
结构基因
② 杀死不含有ColE1细菌的原因 cea + kil基因产物 ③ 不被其他细菌的colicin E1所杀死的原因 imm基因
克隆位点
EcoR I
EcoR I位于E1内部，插入外源DNA导致E1 失活，使受体菌不能合成E（ColE1-），但 仍表现出对E1免疫型（ImmE1+）。
外源DNA
Colicin E1
基因工程的载体
常用抗生素的作用方式及抗性机理
抗生素名称 氨苄青霉素 （Amp） 氯霉素 （Cm） 卡那霉素 （Kan） 链霉素 （Sm） 四环素 （Tet） 作用方式 抗性机理 一种青霉素的衍生物，通过干扰 bla抗性基因编码的一种周质酶，即β-内 细菌胞壁合成之末端反应，而杀 酰胺酶，可特异的切割amp的β-内酰胺 死生长细胞。 环，从而失去杀菌效力。 一种抑菌剂，通过同核糖体50S 亚基的结合作用，干扰细胞蛋白 质的合成，并阻止肽键的形成。 cat抗性基因编码乙酰转移酶，特异地使 氯霉素乙酰化而失活
λ噬菌体载体
结构特点: ①线性双链DNA分子 ②具非必需区(约1/3长度） ③两端具12个核苷酸单链互补粘性末端 ④可在E.coli中大量繁殖 ⑤可克隆15Kb左右的外源DNA
（2）质粒的基本特性
1) 2) 3) 4) 5) 自主复制性 不相容性 可扩增性 可转移性 携带遗传标记 野生型的质粒DNA上往往携带一个或多个遗传 标记基因，这使得寄主生物产生正常生长非必需 的附加性状，包括：抗生素、抗抗生素、抗重金 属、产生细菌毒素等。对DNA重组分子的筛选具有 重要意义。
（3）质粒DNA的转移
质粒自主转移
导入
+
自主转移
+
无DNA转移
donor
H H
H
+
辅助转移
H
+
质粒的辅助转移
H
H
+
Notransfer
质粒的重组转移
R-重组DNA分子
重组
+
DNA 转移
R
+ R
（4）质粒的命名
人工组建的质粒 第一个字母是质粒的英文名字（Plasmid）的第一 个字符p, 用小写。后面有两个字母是大写，代表质 粒的发现者和实验室名称，再后面是质粒的编号。
基因工程-载体
② 开环DNA（ open circular， ocDNA ）
一条链上有一至数个缺口。
③ 线形DNA （ linear ，lDNA）
3. 质粒空间构型与电泳速率 同一质粒尽管分子量相同，不同的构 型电泳迁移率不同：
scDNA最快、l DNA次之、ocDNA最慢。
O的不相容性的分子机制：
两种含有不同复制子结构的不同质粒，在复制时各受自己的 拷贝数控制系统的调节，致使两种质粒的最终拷贝数恒定， 因此在经过若干复制周期和细胞分裂周期后仍能共处于同一 细胞内。
两种含有相似复制子结构的不同质粒，在复制时受到同一种 拷贝数控制系统的干扰，致使两种质粒的最终拷贝数不同， 其中拷贝数多的质粒在以后的细胞分裂周期中更具优势。
点，位于lacZ’基因的5’端。
pUC18/19
2. ColE1
（1）类型 天然质粒，属高拷贝型。 特点是在培养基中加入氯霉素抑制细菌 蛋白质合成后，质粒仍然能复制达到每 个细胞1000-3000拷贝之多！
（2）长度 6.3 kb。
（3）选择标记
大肠杆菌素（colicin）E1和对E1免疫的 基因（immE1）
① colicin E1基因的结构
唯一的克隆位点 EcoR I 正好位于这个 基因的内部。
可以通过插入失活筛选。但细菌群体容 易自发突变出抗colicin E1的细胞…….
2. 质粒载体必须具备的基本条件
（1） 具有复制起点（ORI）
（2）具有抗菌素抗性基因
是筛选的标志。理想的载体应该有两 种以上抗菌素抗性基因。 （3）若干限制性内切酶的单一位点 （多克隆位点）：
6、质粒载体的构建
1. 天然质粒的局限性
（1）分子量大，拷贝数低
基因工程第三章基因工程的载体
基因工程载体的种类
质粒载体
质粒是一种裸露的、独立于细菌 拟核DNA之外的DNA分子，具有 自我复制能力，可携带外源DNA 片段。
病毒载体
病毒载体是指能够将外源DNA片 段插入到病毒基因组中，并利用 病毒的复制机制将外源DNA片段 导入到受体细胞中的媒介。
基因工程载体的作用
基因转移
基因工程载体能够将外源DNA片 段导入到受体细胞中，实现基因 的转移和表达。
通过优化载体结构，提高其在宿主细胞内的稳定性，降低丢失和突变 的风险。
开发NA的载体，提高基因工 程的效率和安全性。
拓展载体功能
通过基因工程技术对载体进行改造，赋予其新的功能，如表达调控、 靶向输送等。
智能化载体
利用合成生物学和纳米技术，开发具有智能响应能力的基因工程载体， 实现基因治疗的精准化和个性化。
利用基因工程载体生产食品添加剂、 酶制剂等，提高生产效率和产品质量。
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此外，噬菌体载体还可以用于疫苗研 发和生物治疗等领域。
04 人工染色体载体
人工染色体的概念与特性
人工染色体是一种通过基因工程技术 构建的染色体，具有与天然染色体相 似的结构和功能。
人工染色体具有高容量、可定制和可 调控等特性，能够承载和表达大量的 外源基因，为基因治疗、生物制药等 领域提供了新的工具。
质粒载体的应用
总结词
质粒载体在基因工程中广泛应用于基因克隆、表达和基因治疗等领域。
详细描述
质粒载体此外，质粒载体还可以用于基因治疗和疫苗研制等领域， 为疾病治疗和预防提供了新的手段。
03 噬菌体载体
噬菌体的生物学特性
基因克隆
基因工程载体可作为基因克隆的 工具，将外源DNA片段插入到载 体中，通过复制和扩增实现基因 克隆。
基因工程载体质粒
丢失四环素抗性标记的正选择体系
原理是具有四环素抗性的细菌对亲脂的螯合剂萎蔫酸 (fusaric acid)极为敏感，因此，将外源性DNA插入到质粒 载体的四环素抗性基因的酶切位点上，在含有萎蔫酸的培 养基上筛选对四环素敏感的重组子，则是十分方便的方法。
人工质粒要素
1．质粒的基因组小好（不影响生物学功能前题） 。转化入细菌的转化率与质粒大小呈反比，当质 粒大于15kb时，转化率将成为限制因素,质粒大， 拷贝数越低。
。
2．质粒应易于转化。 3．质粒应有较多的拷贝数。 4．选择标记。 5．质粒DNA可插入结合较大的外源DNA
大肠杆菌质粒分子的结构示意图
环形质粒分子
环形染色体DNA
质粒DNA
大肠杆菌细胞 抗菌素抗性基因
控制质粒DNA转移的基因
质粒主要包括几个组成部分
• 复制子（reilcator） • 复制起始位点(replication origin site) • 多克隆位点（Polylink）(MCS) • 辅助序列(COS位点等) • 选择标记(LacZ,抗性等)
Merry，1983 YAC) 9,来源于P1的细菌人工染色体（P1-derived artificial
chromosome PAC, loannon，1994）、 10,哺乳动物人工染色体（MAC，mamal artificial
chromosome，Farr，1991） 11,人类人工染色体（HAC，human artificial
pUC 18 和pUC 19质粒图谱
• 质粒主要包括几个组成部分：
• 一、复制子（reilcator）
• 也就是基础复制子（basic replicon）， 具有原质粒同样拷贝数的最小自主复制 单位。一般约2kb，含一个复制起始部 位Orgin（Ori）拷贝数多少和携带有 控制复制的基因信息。
基因工程载体
第三章基因工程载体体外获得的任一DNA片段,必须插入到可以自我复制的载体内,再转入宿主细胞,才能得到复制和进行表达。
基因工程载体(Vectors)就是携带外源基因进入受体细胞进行繁殖和表达的一种工具。
载体的功能运送外源基因高效转入受体细胞为外源基因提供复制能力或整合能力为外源基因的扩增或表达提供必要的条件基因工程中3种主要类型的载体：1.质粒载体2.噬菌体载体3.柯斯质粒（cosmid）载体基因工程对载体的要求（1）在宿主细胞内能独立复制。
（2）有选择性标记。
（3）有一段多克隆位点。
外源DNA插入其中不影响载体的复制。
（4）分子量小，拷贝数多。
（5）容易从宿主细胞中分离纯化。
第一节质粒(plasmid)载体质粒是一种独立于染色体外的双链闭环的DNA分子，具有自主复制和转录能力，能在子代细胞中保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息。
质粒的复制和转录要依赖于宿主细胞编码的某些酶和蛋白质，如离开宿主细胞则不能存活，而宿主即使没有它们也可以正常存活。
(一)质粒的构形环形双链的质粒DNA在提取过程中通常出现三种不同的构型：①共价闭合环形DNA（cccDNA）②开环DNA（open circular,ocDNA）③线形DNA（linear,lDNA）（二）质粒的转移性指质粒从一个细胞转移到另一个细胞的特性。
接合型质粒：除了带有自我复制所必需的遗传信息外，还带有一套控制细菌配对和质粒接合转移的基因。
如：F质粒（性质粒或F因子）甚至能使寄主染色体上的基因随其一道转移到原先不存在该质粒的受体菌中。
不符合基因工程的安全要求。
非接合型质粒：带有自我复制所必需的遗传信息，但失去了控制细菌配对和质粒接合转移的基因，因而不能从一个细胞转移到另一个细胞。
如R质粒（抗性质粒）、Col质粒（细菌素质粒）。
符合基因工程的安全要求。
R质粒：带有一种或数种抗生素抗性基因，使寄主获得同样的抗生素抗性性状（resistance）。
Col质粒：细菌素通过与敏感细菌细胞壁的结合作用，抑制一种或数种细胞生命过程。
基因工程常用的三种载体
基因工程常用的三种载体载体是基因工程中常用的一种工具，用于将外源基因导入宿主细胞中并进行表达。
常见的载体有质粒、病毒和人工染色体。
本文将分别介绍这三种载体的特点、用途和优缺点。
1. 质粒：质粒是圆形、双链DNA分子，广泛应用于基因工程中。
质粒的构建相对简单，可以通过DNA重组技术来插入外源DNA 片段。
质粒通常包含由宿主细胞识别的来源于细菌或酵母的起源序列，以实现在细胞中的复制和维持。
此外，质粒上还包含选择性标记基因和表达调控元件，以便筛选和调控目标基因的表达。
质粒在基因工程中有着广泛的应用。
首先，质粒载体可以在大肠杆菌等常见细菌中表达外源基因，用于重组蛋白的产生和纯化，或进行功能研究。
此外，质粒也可以构建用于植物和动物细胞的转染，用于基因转导和基因治疗等领域的研究。
质粒的优点在于构建简单，易于操作，并且可以在多种细胞中进行表达。
然而，质粒的转染效率较低，不适合大规模基因转导。
此外，在某些细胞中，质粒的稳定性较差，易丧失外源基因。
2. 病毒：病毒是一类依赖于细胞代谢活动的生物体，可以将外源基因导入宿主细胞并进行复制和表达。
常见的基因工程病毒载体包括腺病毒、逆转录病毒和腱实病毒等。
病毒载体的主要特点是高效的基因转导能力和细胞特异性。
由于病毒依赖于细胞进行复制和表达，因此病毒载体能够实现高效转导和表达目标基因。
此外，病毒载体还可以通过选择性修饰病毒表面蛋白来实现对特定细胞的特异性转染，进一步提高基因转导效率。
病毒载体被广泛应用于基因治疗和基因敲除等研究领域。
在基因治疗中，病毒载体能够将替代基因导入患者细胞中，以治疗某些遗传性疾病。
在基因敲除中，病毒载体则可以导入携带某种特殊序列的DNA片段，进而敲除靶基因。
然而，病毒载体也存在一些限制。
首先，病毒复制过程中可能引起细胞毒性反应，对细胞造成伤害。
其次，病毒载体的构建和生产相对复杂，需要严格的无菌操作和关键的质控步骤。
3. 人工染色体：人工染色体是一种合成的染色体模拟体，可用于将大片段基因组DNA导入宿主细胞中。
基因工程载体
基因工程载体是指用于携带外源基因，并在细胞内进行复制和表达的分子。 它们是改造生物的基础。
基因工程载体的类型
质粒
常用于细菌表达，包括原核生物和真核生物的质粒。
病毒载体
包括腺病毒、逆转录病毒等，常用于转导和转化细胞。
工具基因
可直接或间接编码外源蛋白质，还可辅助其他载体用于目的基因的快速识别与筛选。
用于表达重组蛋白等药物，开 发快速且经济有效的制剂工艺。
基因工程载体可用于生物药物及生产技术的研发，是生物医药领域的重要组成部分。
基因工程载体的设计和构建
1
槽式开阔系统
通过个性化定制载体的结构、比例、含量和形态，提升载体的反应性和扩散性。
2
基因簇筛选
可通过对质粒载体进行簇分析和筛选，去除异质体和残留DNA等，提升载体质 量。
3
切割与黏合
运用限制性内切酶、酶切ligase、PCR反应等技术，制备并放大载体。
基因工程载体的后续研究和发展
1 功能扩展
以基因载体为核心，引导基因工程技术的快速发展。
2 多样性构建
以创新设计为核心，开发绿色化、精简化、标准化、差异化、低耗能的基因载体构建平 台。
3 质量控制
研究基因工程质量控制的理论、方法及其结构化的过程，以期提升载体质量，并引导其 向更广泛领域扩展。
常见的基因工程载体
1
慢病毒
2
常用于生物学研究中的基因修饰技术，
有望成为治疗人类遗传病的一种有效工
3
具。
大肠杆菌BL21
用于重组表达外源蛋白，是最常用的质 粒载体。
转座子
可用于转移基因，可以使植物和动物的 产生长期、稳定、准确的基因转移。基因工程载体的特点和优势
基因工程的载体种类
基因⼯程的载体种类基因⼯程的载体对于外源基因的复制、扩增、传代乃⾄表达⾄关重要，其必需具备以下条件：①具有有效运载能⼒，能够进⼊宿主细胞；②对多种限制酶有单⼀或较少的切点，最好是单⼀切点，即本⾝是⼀个复制⼦，携带外源基因前后均能在宿主细胞内⾃主复制，或者能够整合到宿主细胞中；③在宿主中能控制外源基因的表达活动；④要有筛选标记，鉴定⽅便，装卸⼿续简单；⑤容易控制，安全可靠。
在基因⼯程（DNA重组）中，使⽤的载体有：①克隆载体（clone vector），即以繁殖DNA分⼦为⽬的的载体；②穿梭载体（shuttle vecto），⽤于真核⽣物DNA⽚段在原核⽣物中增殖，然后在转⼊真核⽣物细胞宿主表达；③表达载体（express vector），⽤于⽬的基因的表达。
现在对载体提出了更⾼的要求，如：⾼拷贝数、具有强启动⼦和稳定的mRNA、具有⾼的分离稳定性和结构稳定性、转化频率⾼、宿主范围⼴、插⼊外源基因容量⼤且可以重新完整地复制与转录、和宿主细胞匹配等。
此外，载体在宿主不⽣长或低⽣长速率时仍能⾼⽔平地表达⽬的基因。
但达到上述要求的载体很少，尤其是当动物细胞作为宿主细胞时，⽬前能⽤的主要时病毒，进⼊宿主的⽬的基因⼀般只能是⼀个基因，⽽以基因组或多个基因同时进⾏重组还有⼀定困难。
⼀、质粒克隆载体除酵母杀伤质粒（killer plasmid）为RNA外，其他质粒多位环状DNA分⼦，每个质粒都有⼀段DNA复制起始点的序列，帮助实现质粒的复制。
质粒⼀般决定抗⽣素的抗性、产⽣抗⽣素酶系、糖酵解酶系、降解芳⾹族化合物酶系、肠毒素及限制-修饰酶系等。
其中严紧型复制控制质粒的复制与宿主染⾊体同步，并与宿主蛋⽩质合成有关，与DNA聚合酶I活性⽆关，蛋⽩质合成停⽌，质粒与宿主染⾊体复制亦停⽌，故只有1个或少数⼏个拷贝；⽽松弛型复制控制质粒的复制与宿主染⾊体复制不同步，与蛋⽩质合成⽆关，与DNA聚合酶I活性有关，蛋⽩质合成停⽌，质粒仍可复制，故可以在宿主有10—206个拷贝。
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第三章基因工程的载体一、概述二、质粒载体三、表达载体一、概述•1 概念•载体：携带外源目的基因或DNA片段进入宿主细胞进行复制和表达的工具称之为载体，化学本质是DNA分子。
•克隆载体：主要用来克隆和扩增DNA片段，能带动外源基因在宿主细胞中复制扩增。
•表达载体：除具有克隆载体的基本元件外，还具有转录、翻译所必需的DNA元件，使外源基因在宿主细胞中有效表达。
一、概述•2 功能•运送外源基因高效转入受体细胞；•为外源基因提供复制能力和整合能力；•为外源基因的扩增或表达提供必要的条件。
一、概述•3 分类•按来源分：质粒载体、噬菌体载体、病毒载体、酵母人工染色体载体•按功能和用途分：克隆载体和表达载体•按性质分：融合型载体和非融合型载体•按受体细胞分：原核细胞载体和真核细胞载体一、概述•4 特性•载体能在宿主细胞内进行独立稳定的DNA自我复制；或整合到染色体DNA上，随着染色体DNA的复制而同步复制；在载体中插入外源基因后，仍然保持稳定的复制状态和遗传特性；•载体容易从宿主细胞中分离纯化；•有限制性酶切的克隆位点，以便于目的基因的组装，即多克隆位点；一、概述•4 特性•能赋予细胞特殊的遗传标记，以便于对导入的重组体进行鉴定和检测；•载体在细胞内的拷贝数高，方便外源基因在细胞内大量扩增；•载体在细胞内稳定性高，保证重组体稳定传代而不易丢失；•用于表达目的基因的载体还应具有启动子、增强子二、质粒载体1、质粒的基本特性2、常用的质粒载体3、质粒DNA的提取4、大肠杆菌感受态细胞的制备及转化二、质粒载体质粒载体是以质粒DNA分子为基础构建而成的基因载体，主要用于原核生物和真核生物的基因转移及建立基因组文库和cDNA文库。
1、质粒的基本特性（1）概念①染色体外的遗传因子，能进行自我复制（但依赖于宿主编码的酶和蛋白质）；②大多数为双链，闭环DNA分子，少数为线形；③大小为1 kb-200 kb，也有更大的。
双螺旋共价闭合环（超螺旋）开环双螺旋（一个裂口）线状双螺旋（两个裂口）构型：共价闭合环状、开环和线性（2）质粒的复制﹡ 复制起始区：通常一个质粒含有一个与相应的顺式作用控制要素结合在一起的复制起始区。
﹡ 复制子有不同的组成方式：滚环、θ等；﹡ 在E.coli中，使用的大多数载体都带有一个来源于pMB1质粒或ColE1质粒的复制子。
（3）拷贝数严谨型：拷贝数较少，大约1-几个松弛型：拷贝数较多，几十至几百一些质粒载体所携带的复制子及拷贝数质粒复制子拷贝数pBR322及其衍生质粒pMB1 15-20 pUC载体pMB1 500-700 pACYC及其衍生质粒p15A 10-12（4）质粒的不相溶性﹡ 两种质粒在同一宿主中不能共存的现象称为质粒的不相溶性。
﹡ 在第二个质粒导入后，在不涉及DNA限制系统时，不相溶的质粒一般为利用同一复制系统，质粒分配到子细胞时会发生竞争，随机挑选，最终放大。
（4）质粒的不相溶性﹡ 不相溶群：指那些具有不相溶的质粒组成的一个群体，一般具有相同的复制子。
现已发现30多个不相溶群。
（5）转移性﹡ 在自然条件下，很多质粒可以通过细菌接合的作用转移到新宿主内。
﹡ 要素：移动基因mob，转移基因tra，转移起始位点。
﹡ 例：pBR322有起始位点bom的nic位点，可在第三个质粒（如ColK）编码的转移蛋白质作用下，通过接合性质粒来进行转移，但大多数载体无nic/bom位点（如pUC ）。
（6）选择标记选择标记基因用于鉴别目标DNA的存在，将成功转化了质粒的宿主挑选出来。
(1)氨苄青霉素抗性基因ampicillin,Amp r, amp r青霉素抑制细菌细胞壁肽聚糖的合成，与有关的酶结合，抑制转肽反应并抑制其活性。
Amp r编码一个酶，可分泌进入细菌的周质区，并催化β-内酰胺环水解，从而解除氨苄青霉素的毒性。
（2）四环素抗性基因tetracycline,tet r四环素与核糖体30 S亚基的一种蛋白质结合，从而抑制核糖体的转位。
tet r基因编码一个由399个aa组成的膜结合蛋白，可阻止四环素进入细胞。
（3）氯霉素抗性基因chloramphenicol,Cm r, CatCm与核糖体50 S亚基结合并抑制蛋白质合成。
Cat基因编码一个四聚体细胞质蛋白，每个亚基23 kDa。
氯霉素乙酰转移酶在乙酰辅酶A存在的条件下，催化氯霉素羟乙酰氧基衍生物的形成，该产物不能与核糖体结合。
（4）卡那霉素和新霉素抗性基因kanamycin / neomycin 可与核糖体成分相结合并抑制蛋白质合成的脱氧链霉胺氨基糖苷。
这两种抗生素可被氨基糖苷磷酸转移酶(APH(3‘)-II)所灭活，该酶为25 kDa ，似乎位于外周质腔，这些抗生素的磷酸化干扰了它们向细胞质内的主动转移。
（5）Sup F琥珀突变抑制基因终止密码：UAA（赭石），UAG（琥珀），UGA（乳白）Sup F编码细菌的抑制性tRNA，在某一宿主中含具琥珀突变的tet r和amp r，只有当含Sup F的质粒转入后，宿主才会对amp和tet具抗性。
（6）其它正向选择标记质粒可编码一种使某些宿主菌致死的记忆产物，而含有外源基因片段插入后，该基因便失活。
筛选标记插入失活：在质粒pBR322的抗四环素基因上插入一个外源基因后，导致抗四环素基因失活，变成只对氨苄青霉素有抗性，这样就可通过对抗生素是双抗还是单抗来筛选是否有外源基因片段插入到载体中，这种筛选方法称为插入失活。
筛选标记α-互补（α-complementation ）Lac Z ´基因的互补编码缺失第11-41位氨基酸宿主LacZ LacZ ΔM15β-半乳糖苷酶1024 aa载体140 aa140 aa+MCS LacZ ´IPTG：异丙基-β-D-硫代半乳糖苷Isopropyl-β-D-Thiogalactoside诱导物X-gal：5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-β-D-Galactoside 底物（生色剂）β-半乳糖苷酶分解x-gal形成蓝色产物MCS：Multiple cloning sitesLacZ ΔM15LacZ´IPTG/x-galLacZ ΔM15LacZ ´蓝色LacZ ΔM15 LacZ ´ΩDNA IPTG/x-gal白色在载体中加入一个短区段，含LacZ基因的调控区和前140个aa的编码信息，在这个编码区中插入一个多克隆位点，它并不破坏阅读框架，相当于在β-半乳糖苷酶的氨基端插入了几个氨基酸，而不影响未加几个氨基酸时的功能。
lacZΔM15编码缺失第11-41位氨基酸的β-半乳糖苷酶，但无酶学活性。
当LacZ´与lacZΔM15的产物混合在一起时却有酶学活性，所以在载体上加lacZ/（MCS），并在受体菌中引入lacZΔM15即可实现α-互补。
在生色底物（x-gal）存在下形成蓝色菌落，而外源基因插入到质粒的MCS后，几乎不可避免地导致产生α-互补能力的氨基酸片段。
α-互补：LacZ基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的β-半乳糖苷酶阴性的突变体之间实现互补。
lacZΔM15 放在F质粒上，随宿主传代lacZ ´放在载体上，作为筛选标记相应的受体菌：TG1，XL1-Blue，JM101等。
（7）质粒载体的多克隆位点基因工程载体含有一个人工合成的多种限制性内切核酸酶的单一识别序列，称为多克隆位点（multiple cloning site, MCS)（8）质粒DNA的电泳特征共价闭环DNA：covalentlyclosed circular DNA,cccDNA开环的双链环状DNA：open circular DNA，ocDNA线形DNA：linear DNAL-DNA 共价闭环DNA开环的双链环状DNA 线形DNA2、常用的质粒载体具备以下特点：①在宿主细胞内必须能进行自主复制（具备复制原点）；②必须具备合适的酶切位点，供外源DNA片段插入，同时不影响其复制；③有一定的选择标记，用于筛选。
（1）pSC101，ColE1载体较大，酶切位点少﹡ 转化效率与大小成反比，大于15 kb转化效率成为限制因素；﹡ 质粒约大，约难于用限制酶切进行鉴定；﹡ 质粒约大，拷贝数越低。
改进策略：﹡ 去掉多余片段﹡ 提供多克隆位点﹡ 筛选标记﹡ 增加辅助功能：表达载体（2）pBR3224361 bpGenBank V01119,J01749 含有30多个单一位点amp r和tet r可通过插入失活进行筛选（3）pUC18，pUC19﹡ 2686 bp﹡ GenBank L08752/X02514﹡ 来自pBR322﹡ amp r﹡ MSC有10个位点﹡ α-互补﹡ 用途：cloningexpression(利用lacZ promoter)sequence(universal and reverse prime)pUC18（4）pUC118，pUC119﹡ 3162 bp﹡ GenBank U07649/U07650﹡ amp r﹡ MSC有10个位点﹡ α-互补﹡ 用途：分离ssDNA，诱变，探针，测序pUC118 pUC119（5）pBluescript M13+、M13-又叫pBluescript SK+、SK-﹡ 2960bp﹡ GenBank X52325/X52326﹡ amp r﹡ 在MCS位点两侧，含有一对T3和T7噬菌体的启动子﹡ α-互补﹡ 用途：测序，探针pBluescript SK+、SK-（6）pSP64、pSP65﹡ 2999/3005 bp﹡ amp r﹡ 含有噬菌体SP6的RNA聚合酶启动子﹡ 用途：克隆外源DNA片段探针pSP64 pSP65（7）pGEM-3Z﹡ 2743 bp﹡ amp r﹡ 含有噬菌体的T7和SP6启动子﹡ 用途：克隆外源DNA片段探针pGEM-3Z（8）pUCm-T﹡商业化的克隆载体﹡用于PCR产物的克隆﹡2773 bp﹡amp r3、质粒DNA的提取质粒DNA的小量制备（碱裂解法）（1）细菌的培养将3 ml含相应抗生素的LB培养基加入到10 ml的细菌管中，然后接入一单菌落，于37℃、150 r/min下培养过夜。
（2）细菌的收获将1.5 ml细菌培养物加入1.5 ml离心管中，于4℃、8000 r/min离心30 s，倒掉上清液，使细菌沉淀尽可能干燥。