第四节 基因工程载体

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(6)传递性：
(7)消除性：
(8)复制类型：严紧型质粒的复制受到宿主细胞蛋 白质合成的严格控制，松弛型质粒的复制不受 宿主细胞蛋白质合成的严格控制。 (9)表现型：
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3、质: 能自我转移 如：F质粒（性质粒、或F因子） B.非接合型质粒： 不能自我转移 如：R质粒（抗性质粒） 带有一种或数种抗生素抗性基因，使寄主获 得同样的抗生素抗性性状（resistance）。
操纵序列
Z
Y
A
Z： β-半乳糖苷酶
启动序列
Y： 透酶
A：乙酰基转移酶
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2、阻遏蛋白的负性调节
阻遏基因 DNA
pol
I
P
O
Z
Y
A
mRNA
阻遏蛋白
没有乳糖存在时
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P
O
Z
Y
X
诱导物
乳糖
P O pol
Z
Y
X
Z： β-半乳糖苷酶
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乳糖操纵子模型Flash
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-半乳糖苷酶Xgal显色反应： -半乳糖苷酶能把无色的化合物 Xgal分解成半乳糖和一个深蓝色的 物质5-溴-4-氯靛蓝。 Xgal 半乳糖 5-溴-4-氯靛蓝
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1. 抗菌素选择原理 不带有抗菌素抗性基因的受体菌不能在 含有抗菌素的培养基（选择培养基）中 生长。 当带有抗菌素抗性基因的载体进入受体菌 后，受体菌才能生长。 抗性基因
死
抗菌素
活
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Amp
Tet
插入片段
pBR322
Tet平板
Amp平板
抗药性标志的选择
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2.蓝白斑试验（IPTG-Xgal 试验）
46
47
48
49
第二 噬菌体载体
一、噬菌体的一般特性
噬菌体是一类细菌病毒（Bacteriophage）
结构：
蛋白质外壳内包裹 着DNA（双链、单 链、线性、环状 等）。
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T4 Bacteriophage
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二、噬菌体的生活周期
分为两种：
1. 溶菌周期：
烈性噬菌体（virulent phage)
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大肠杆菌接合（conjunction）
16
17
二、组建理想质粒载体必须具备的条件
(一)、质粒拷贝数较高 质粒拷贝数是指生长在标准的培养基条件
下，每个细菌细胞中所含有的质粒DNA分
子的数目。
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根据宿主细胞所含的拷贝数多少， 可将质粒分成：
严紧型
低拷贝数的质粒，每个宿主细 胞中仅含有1-2份的拷贝，称这类 质粒为“严紧型”复制控制的质 粒(stringent plasmid)； 高拷贝数的质粒，每个宿主细 胞中可高达10-200份拷贝，这类 质粒被称为“松弛型”复制控制 的质粒(relaxed plasmid)。
52
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2. 溶原周期：
温和噬菌体（temperate phage)
感染细菌后，将自己的DNA整合 到细菌的染色体DNA中。形成这 一过程称为溶源化
54
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1.单链噬菌体载体
单链环状DNA的丝状大肠杆菌噬菌体： M13、f1、fd 噬菌体
M13 噬菌体
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M13载体的构建：
1）克隆区域的选定 ① 基因间隔区（intergenic region, IG区）
pBR322
pBR322
重组体的筛选
... . . . . .
涂布有Tet的培养基
.. .. . .
涂布有Amp的培养基
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2. pUC18/19：
拷贝数 2000 - 3000/cell 装有多克隆位点（MCS） 正选择颜色标记 lacZ’ 用于基因克隆和测序
EcoRI SstI KpnI SmaI BamHI XbaI SalI PstI SphI HindIII GAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTT 396 452
约100bp的自主复制序列（ARS）。 （真核生物中只有酵母菌有ARS）
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（4）克隆位点 插入失活选择： SUP4酶失活的酵母 菌落呈红色； 不失活的菌落是白 色。
位于 SUP4 基因内部。
1）有MCS，便于克隆不同的酶切片段 2）Xgal显色反应，可供直接选择 3）无包装限制，克隆能力大 4）可以克隆双链DNA分子中的每一条链
子代M13噬菌体中包含的是单链+DNA。
60
61
2.噬菌粒载体（phagemid vectors） 由质粒载体与单链噬菌体载体的复制 起点结合而成的新型载体系列。 MCS lacZ’ lacI 噬菌体ori 质粒ori Ampr
lacZ’
lacZ’
缺陷型大肠杆菌
43
pUC18 / 19：正选择标记 lacZ’ 的显色原理
Plac MCS
pUC18/19
5-溴-4-氯-3-吲哚基-b-D-半乳糖 苷
lacZ’
X-gal
b
a
Br
b-半乳糖苷酶 的a-肽段
Cl O N N Br Cl 44
3.植物Ti质粒载体
1）.
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-半乳糖苷酶
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lacZ的肽互补 1）-肽（ lacZ’ ）：
宿主编码的缺陷型-半乳糖苷酶C段
载体：-半乳糖苷酶N端的一段氨基 酸片断
4聚体
N端的11-41aa N端的11-41aa N端的11-41aa N端的11-41aa
C端大部分 C端大部分 C端大部分 C端大部分
lacZ只有在4聚体的状态下才有功能.
松弛型
19
(二)分子量较小
低分子量的质粒如下优点
•外源DNA容量较大， •容易转化，当质粒大于15kb时，将成为转 化效率的制约因素。 •遗传工程操作时容易拿捏，容易分离，不 易断裂。
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(三)带有可供选择的标记
常采用的标记是对某种抗生素的抗性，
如氨卞青霉素抗性(Ampr)、卡那霉素 抗性(Kanr)、四环素抗性(Tetr)等， 而且希望各抗性基因内有若干单一的 限制酶切点。
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M13 RF
E.coli lac基因的 HindII片断(lacI、 lacP、lacO、lacZ’）
BsuI不完全消化
各种长度的线性片断
（其中应有只在 IG上切开的线性 全长M13）
连接
M13mp1
JM101宿主
只有在IG区插入lacZ’才能存活并 在Xgal上出现互补的蓝噬菌斑
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（6） M13系列载体的优点
36
( 六) 克隆载体必须安全
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多克隆位点
polylinker
复制起始点
ori
Amp
遗传标记
基因载体
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三、常用的质粒载体
重要的大肠杆菌质粒载体
1. pBR322：
松弛型复制 氯霉素可扩增 拷贝数 50 - 100 / cell 用于基因克隆
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外源基因的插入：
PstI Amp r Tet r Amp s Tet r
T
T
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第三 大分子DNA克隆载体
一、酵母人工染色体
（yeast artificial chromosome, YAC)
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2. 染色体复制和遗传的三个基本组件： （1）DNA复制起始点（ori） （2）着丝粒（centromere，cen）
（3）两个端粒（telomeres，tel）
TEL ORI CEN
（5）容易从宿主细胞中分离纯化。
3
3. 载体的功能及特征
载体的功能
运送外源基因高效转入受体细胞 为外源基因提供复制能力或整合能力 为外源基因的扩增或表达提供必要的条件
4
4.载体的种类
1. 克隆载体（cloning vecto. 表达载体（expression vector）：能使目的 基因在宿主细胞中表达的一类载体。这类载体 既有复制子，更要有强启动子； 3. 穿梭载体（shuttle vector）：这类载体可以 在原核细胞中复制，也可在真核细胞中扩增和 表达。
TEL
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3. YAC的组成结构 （1）着丝粒区（CEN）
酵母染色体着丝粒区的保守序列:
由三个区组成 I
A A GTCACGTG
II
78-86bp
III
T TGTTTCTGNTTTCCGAAA
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（2）端粒（TEL）
两个端粒序列Tel。 酵母端粒保守序列是(G4T2)n 重复序列。
（3）复制起点（ORI）
J. Messing证明，IG区存在 M13的复制起点，但可以插入 外源DNA而不影响M13噬菌体的 活力。
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2）加入酶切位点
① 在IG区内加入单一内切酶位点 第一个M13载体：M13mp1： 在IG区内插入一个大肠杆菌的LacZ’ （-肽序列)。 利用-肽序列中的三个单一酶切位 点（Bgl II、Ava II 和 Pvu I）。
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噬菌粒载体的特点
①分子量小
约3000bp（比M13小）
②克隆能力大
能插入10kb的外源DNA。
③两种复制形式
既具有质粒的复制起点，又具有噬菌体的复制 起点。
既能在大肠杆菌中以质粒的形式双链复制， 又能在噬菌体内进行单链复制。 63
3 PCR产物克隆载体 pCR系列载体
T 载体
Invitrogen公司开发的线性噬菌粒载体。
第四节 基因工程载体
vectors
1
1. 载体 （Vectors） 在基因工程操作中，把能携带外源DNA进入 受体细胞的DNA分子叫载体。