基因工程载体

二、噬菌体载体 （一）、λ噬菌体载体
1、λ噬菌体载体的特征
λ噬菌体颗粒中DNA为线状双链DNA分子，全长48502bp， 两端各有一段长度为12个核苷酸的互补单链（粘端），称 为cos位点。λ 噬菌体有61个基因，其中有1/3的区域是其 裂解性生长的非必需区，这一区段的缺失，或在此区段中 插入外源DNA，并不影响噬菌体的增殖，这就是λ 噬菌体 可作为基因载体的依据 。
第一节
微生物基因工程载体
克隆载体（cloning vecto载体（expression vector）：能使目的基因在宿 主细胞中表达的一类载体。这类载体既有复制子， 更要有强启动子； 穿梭载体（shuttle vector）：这类载体可以在原核细 胞中复制，也可在真核细胞中扩增和表达。
四、酵母菌载体
多数酵母中含有一种能独立复制的环状双链DNA，称为 2μ 质粒，长约6.3kb，有单一的复制起始点和一个自主 复制功能区域（ARS片段）。 根据质粒的复制方式不同将它们分为：整合型、复制型、 附加型和稳定型等类型。
共同的特点：
①含有E.coli质粒的复制起始序列，这样在外源基因转到酵 母细胞前可先在大肠杆菌中扩增。
外源基因的插入：
PstI Amp r Tet r Amp s Tet r
重组体的筛选
. .. . . . . .
涂布有Tet的培养基
.. .. . .
涂布有Amp的培养基
3、pUC系列质粒载体
（1）特点 具有更小的分子 量（2686bp）和 更高的拷贝数。 具有多克隆位点
可用组化方法鉴别：
含有一个来自于大肠杆菌的经过加工的LacZ基因 （LacZ′），它编码β -半乳糖苷酶氨基端146个氨基酸 ， 可以和β -半乳糖苷酶缺陷型的大肠杆菌实现基因内互补， 即α —互补 ，恢复分解乳糖的能力。 X-gal也是β -半乳糖苷酶的一种底物，经降解后可生成溴 氯吲哚，使大肠杆菌菌落呈蓝色。当无β -半乳糖苷酶时， X-gal不被分解，菌落呈白色。 当外源基因插入到pUC质 粒的LacZ′基因内部，则LacZ′基因受到破坏，便不能 再和缺陷型受体菌中生成有活性的β -半乳糖苷酶，因此， 菌落呈白色。 反之，非重组体为蓝色菌落。 可通过插入失活法进行筛选
共同区
2、毒性Vir 区， Vir区大约35kb，包含6个互补群，A、B、C、D、E、G。 VirA、B、D和G为致瘤性，它们的突变型为非致病性。 VirA、C、D编码专一核酸内切酶蛋白，与VirB共同 作用，与T-DNA迁移直接有关。 VirC部分决定寄主范围 VirE与菌体感染过程有关 3、代谢区 Tra，T-DNA转移功能；
3. 质粒的不相容性和不亲和群
质粒的不相容性：一般地，不同质粒不能共处在一个细 胞中，这种特性称质粒的不相容性，当它们处在一起时， 便有生存竞争，结果一种质粒繁殖，另一种逐渐被排斥， 数目变少。 不亲和群：彼此不相容的质粒组成一个不亲合群。
（二）、质粒的命名
1、人工组建的质粒
人工组建的质粒的第一个字母是质粒英文名字 （plasmid）的第一个字符p，用小写。p后有2个字母是大 写，表示质粒的作者和实验室名称，再其后为质粒的编号。 例：pXYp109；pSC101等 2、天然载体质粒 天然载体质粒的第一个字母大写，且质粒符号用括号 括起来。 如（C01E1）。农杆菌质粒用p加Ti（Tumer inducing）或 At（Agrobacterium tumefacions）表示，如pTiC58。
1. 严紧型和松驰型质粒 严紧型质粒：在宿主细胞中的拷贝数较少，一 般只有1～3个 松驰型质粒：其拷贝数较多，一般20～60个，多 的可达200～300个

2、转移型和非转移型质粒
转移型，结合型（conjugative plasmid）是指一些质粒在不 同的菌株中可以相互转移。 非转移型质粒(non-conjugative plasmid)则只能在一种寄主 中生存
②含有酵母的筛选标记，这样当重组质粒转入相应的酵母 细胞后，可用来筛选重组体。
③具有合适的供外源基因插入的限制酶切割位点。
整合型：含有酵母的筛选标记ura3，但不具有酵母的复制 起始点该质粒DNA以单拷贝形式稳定遗传，缺点是转化率 较低（1～10转化子/μ g DNA） 复制型：是酵母DNA片段插入到大肠杆菌质粒中构成的， 插入片段含有酵母的筛选标记ura3和2uDNA片段，一般以 低拷贝数维持在酵母染色体之外。复制型载体对酶母的转 化率极高（102～103转化子/μ g DNA），但是转化子不稳 定，容易丢失。 附加型：是在pBR322中插入酵母筛选标记和2uDNA的 ARS序列构建成的。这种质粒以附加体的形式存在于真核 细胞中。附加型型载体对酵母具有很高的转化活性 （102～103转化子/μ g DNA），且与复制型相比，稳定性 高，拷贝数也较高（25～100分子/ 细胞）。
（二）、Ti质粒及T-DNA的结构与功能
Ti质粒是农杆菌非染色体的环状双链DNA分子， 分子量为90×106～150×106道尔顿，有16~240kb。 致病菌株 治愈菌株
37℃培养
治愈菌株 （Ti质粒被消除）
致病菌株（重新获得Ti质粒）
与致病菌株接合
1、T-DNA区 胭脂碱型质粒T区大小约23kb，单一序列插入植物核DNA。
第四章 基因工程载体
Vesctors for Genetic Engineering

载体：这种能与目的基因结合，且有完整的复制和转录功能 的DNA大分子称之为载体（vector）。
作为一个理想的载体，应具备以下条件：
（1）能够在宿主细胞中存在并繁殖，有功能良好的复制 子和启动子，使插入基因复制和表达； （2）具有多个限制性内切酶的切点，且切点是单一的， 这样可将多个外源DNA片段插入其中； （3）具有容易检测的筛选标记； （4）载体DNA的分子量适当，可容纳较大的外源DNA片 段，又可在受体细胞内扩增较多的拷贝； （5）在细胞内稳定性高，这样可以使重组体可以稳定传 代而不易丢失。
（三）、常用质粒载体
1. pSC101
图
2. pBR322
（1）组成 它由三部分组成：
来自pSCl01的四环素 抗性基因Tetr
来自ColEl的衍生物 pMBl的松弛复制起 点ori 来自RSF2124的氨苄 青霉素抗性基因Ampr。
（2）特点
具有多个单一的限制性内切酶位点。 Tetr中有BamH1切点（G↓GATCC）和SalⅠ切点（G↓AATTC）， Ampr中有PstⅠ切点（CTGCA↓G）。 利用ColEl的复制子，所以在细胞中是多拷贝的，可通过氯霉素使质粒 拷贝数进一步扩增。 （3）重组克隆的 “插入失活”筛选方法 pBR322—→插入在Tetr中，基因型为Tets 、Ampr——→在含有氨 卞青霉素培养基上可生长，在在含有四环素培养基上不生长； pBR322—→插入在Ampr中，基因型为Tetr 、Amps、——→在含 有氨卞青霉素培养基上不生长，在在含有四环素培养基可不生长； 而在两种抗生素培养基上都生长的是非重组型。这种在一个 基因位点中插入外源DNA片段，从而使该基因活性丧失的现象叫 插入失活。
含Ampr抗性基因，可通过插入失活和颜色反应进行双重筛选。
完整的β -半乳糖苷酶
N端 C端
lacZ’
lacZ’
缺陷型大肠杆菌
（四）大肠杆菌中的表达载体 表达载体应含有：
（1）强启动子 （2）在启动子下游区和ATG上游区有一个好的SD序列。 （3）在外源基因插入序列下游区要有一个强的转录终止序 列，保证外源基因有效转录和质粒的稳定性。
λ噬菌体的改造
⑴ 切去非必须区段，在切去的同时，加载目的基因（2.5kb或更大）； ⑵ 去处太多的酶位点，每种酶只留1-2个切口； ⑶ 增加标记基因（remarke gene）。
(4) 引入无义突变．
3. λ噬菌体的主要类型 （1）插入型载体 只有1～2种限制性核酸内切酶的单一切割位点
免疫功能失活
一、质粒载体
细菌质粒 (plasmid) 载体是基因工程 中最常 用的载体, 它必须包括三种组成部分： 复制必须 区，选择标记基因和限制性核酸内切酶的酶切位 点（克隆位点，MCS). 质粒DNA分子具有三种构型： Closed circle DNA, ccDNA; supercoil; SC构型 Open circle DNA, OC构型; Liner DNA, IDNA; L构型.
+
+ RF型DNA
复制约 200copy
+ + -
+ -
+ 单链结合蛋白
+
+
以-链DNA为模 板合成+链DNA
+
+
+
+
-
三、噬菌粒载体（科斯质粒
1、构建
cosmid ）
由质粒和λ噬菌体的粘性末端构建而成的。借用cos-（粘性 尾巴）作字头，质粒的-mid作字尾，故称Cosmid，也叫粘 粒载体。 2、特点 （1） 有λ噬菌体的高效感染能力。 ⑵ 有质粒的高效复制特性。 ⑶ 有更广泛寄主。 ⑷ 有较大的容量。 ３．主要用途：用于DNA 序列分析
稳定型：在附加型载体中再插入酵母着丝粒的一个DNA 片段（CEN）。
第二节
植物基因工程载体
一、根癌农杆菌及Ti质粒
（一）、根癌农杆菌与冠瘿瘤
根癌农杆菌属根瘤菌科农杆菌属，通过伤口可感染双子叶 植物，并在创伤部位使组织恶性增生而形成植物肿瘤，叫 冠瘿瘤（crown galltumor）。 章鱼碱 冠瘿碱 胭脂碱 农杆碱 类植物激素
大肠杆菌β -半乳糖苷酶失活
（2）替换型载体
在其中央部位有一个可以被外源插入的DNA分子取代的 DNA片段的克隆载体 。这是由于构建此载体时，安排 在中央可取代片段两侧的多克隆位点是反向重复序列， 因此，当外源DNA插入时，一对克隆位点之间的DNA 片段便会被置换掉，从而有效提高了克隆外源DNA片段 的能力。