基因工程的载体

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基因工程载体

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基因诊断
利用基因工程载体携带特定的检测基因或标记物, 对疾病相关基因进行快速、灵敏的检测和诊断。
应用领域与前景
农业生产
通过基因工程载体将优良性状基因导入农作物或家畜家禽的 基因组中,改良品种性状,提高产量和品质。
前景
随着科学技术的不断进步和创新,基因工程载体的研究和应 用将更加深入和广泛。未来,基因工程载体有望在个性化医 疗、精准农业、生物安全等领域发挥更大的作用,为人类健 康和生活质量的提高做出更大的贡献。
人工染色体载体
概念
人工染色体载体是一种基于天然染色体结构设计的基因工程载体,可模拟天然染色体的功 能和特性。
优点
人工染色体载体具有较大的容量,可容纳多个外源基因和调控元件。此外,人工染色体载 体还具有稳定的遗传特性和较低的免疫原性,可实现外源基因的长期稳定表达和遗传。
缺点
人工染色体载体的构建和操作相对复杂,技术难度较大,且成本较高。目前主要应用于基 础研究和临床试验阶段。
潜在生态风险分析
基因污染
基因工程载体可能通过水平基因转移等方式,将外源基因 导入非目标生物体内,造成基因污染。
生态平衡破坏
外源基因的导入可能对目标生物及其相关生物种群的生态 平衡产生不良影响,如改变种间竞争关系、影响食物链等。
生物多样性减少
基因工程载体的广泛应用可能导致生物多样性减少,特别 是对一些濒危物种和生态系统的影响更为显著。
人类健康影响评估
食品安全问题
基因工程载体在食品生产中的应用,如转基因作物,可能对人体健 康产生潜在风险,如引发过敏反应、产生毒素等。
医药安全问题
基因治疗等医疗手段的应用,可能存在潜在的安全隐患,如基因编 辑的脱靶效应、基因治疗的副作用等。

基因工程载体

基因工程载体

基因工程载体体外获得的任一DNA片段,必须插入到能够自我复制的载体内,再转入宿主细胞,才能得到复制和进行表达。

基因工程载体(Vectors)确实是携带外源基因进入受体细胞进行繁育和表达的一种工具。

载体的功能运送外源基因高效转入受体细胞为外源基因提供复制能力或整合能力为外源基因的扩增或表达提供必要的条件基因工程中3种要紧类型的载体:1.质粒载体2.噬菌体载体3.柯斯质粒〔cosmid〕载体基因工程对载体的要求〔1〕在宿主细胞内能独立复制。

〔2〕有选择性标记。

〔3〕有一段多克隆位点。

外源DNA插入其中不阻碍载体的复制。

〔4〕分子量小,拷贝数多。

〔5〕容易从宿主细胞中分离纯化。

第一节质粒(plasmid)载体质粒是一种独立于染色体外的双链闭环的DNA分子,具有自主复制和转录能力,能在子代细胞中保持恒定的拷贝数,并表达所携带的遗传信息。

质粒的复制和转录要依靠于宿主细胞编码的某些酶和蛋白质,如离开宿主细胞那么不能存活,而宿主即使没有它们也能够正常存活。

(一)质粒的构形环形双链的质粒DNA在提取过程中通常显现三种不同的构型:①共价闭合环形DNA〔cccDNA〕②开环DNA〔open circular,ocDNA〕③线形DNA〔linear,lDNA〕〔二〕质粒的转移性指质粒从一个细胞转移到另一个细胞的特性。

接合型质粒:除了带有自我复制所必需的遗传信息外,还带有一套操纵细菌配对和质粒接合转移的基因。

如:F质粒〔性质粒或F因子〕甚至能使寄主染色体上的基因随其一道转移到原先不存在该质粒的受体菌中。

不符合基因工程的安全要求。

非接合型质粒:带有自我复制所必需的遗传信息,但失去了操纵细菌配对和质粒接合转移的基因,因而不能从一个细胞转移到另一个细胞。

如R质粒〔抗性质粒〕、Col质粒〔细菌素养粒〕。

符合基因工程的安全要求。

R质粒:带有一种或数种抗生素抗性基因,使寄主获得同样的抗生素抗性性状〔resistance〕。

Col质粒:细菌素通过与敏锐细菌细胞壁的结合作用,抑制一种或数种细胞生命过程。

基因工程中常用载体及其主要特点

基因工程中常用载体及其主要特点

基因工程中常用载体及其主要特点基因工程这一话题,听起来就像科幻小说里的情节,其实离我们并不遥远。

今天咱们就聊聊基因工程中的一些常用载体,简单明了,让你听得懂,明白得了!准备好了吗?那就跟我一起走进这奇妙的基因世界吧!1. 什么是载体?首先,得先搞清楚,什么是载体。

简单来说,载体就是那些能“背负”外来基因的“快递小哥”。

它们把我们想要的基因装上,然后送到目标细胞里。

这就像是你点了一份外卖,外卖小哥把美味的食物送到你家。

没有它们,我们的基因工程可就没法开展了。

想象一下,如果没有这些小哥,基因可怎么进得了细胞的大门呢?1.1 质粒载体说到载体,质粒可算是老前辈了。

质粒就像是细菌的“USB闪存”,它能自我复制,携带外来基因,简直就是基因工程的明星。

质粒的特点是操作简单、成本低,而且它们在细菌中可以很稳定地传递下去。

想想看,若是你把一张重要的文件放在闪存里,不仅可以在一台电脑上使用,还能借给朋友,这种“共享经济”在基因界也在不断上演。

质粒载体就是这样的存在,方便又实用,真是个好帮手!1.2 噬菌体载体再说说噬菌体载体。

这个名字听起来就有点威风,实际上它就是一种能感染细菌的病毒。

噬菌体载体像个特种部队,能精准地将目标基因送到细菌里。

它的特点是能在细菌中以极高的效率进行复制。

想象一下,像忍者一样悄无声息地完成任务,真是酷毙了!当然,它的使用相对复杂,需要一定的技术支持,不过一旦掌握,可是非常厉害的工具。

2. 常见的真核载体讲完细菌的载体,咱们再来看真核细胞的载体,这可得好好聊聊了。

2.1 真核表达载体真核表达载体,是为了在真核细胞中表达外来基因而设计的。

这就像是在高档餐厅里,得有专业的厨师才能把菜做好。

真核表达载体通常含有强大的启动子、终止子和选择标记。

它们能够确保外来基因在真核细胞中顺利表达。

举个例子,就像你去商场买了新衣服,得先试穿才知道合不合适,对吧?这载体也得确保外来基因在细胞中能够“穿”得合适,才能发挥作用。

基因工程第五章-载体

基因工程第五章-载体

cccDNA在较高高的温度和PH值条件下才会变性,(较线 性和开放环结构的DNA),如果变性,由于团在一起,条 件恢复后,会很快复性,形成cccDNA,线性和环状的变 性后,复性会形成杂乱的大分子团状结构,从而从体系中 沉淀下来。
3. 质粒DNA的分子量和拷贝数:
按质粒的分子量大小,可分为量大类: 3――7kb,拷贝数多; 70-150kb,含有与质粒功能有关的更多基因,可自我传 递(可编码一套控制质粒DNA转移的基因,所以可从一 个细胞转到另一个细胞),如果一个细胞含有这种质粒, 他可以带动小质粒进行传递转移。这种质粒的拷贝数低。
质粒的拷贝数:分子的多与寡是决定产量的重要因素。
pBR322 拷贝数大于25个 ColE1 15个 产量0.23ug/ml 0.11 ug/ml
基因克隆尽量选择松弛型质粒,如果是严紧型要进行质粒 复制子改造。
质粒的大小:通常质粒越大,拷贝数也越少,所以我们 在进行基因重组时,首先要选择分子量小的质粒,其次 质粒分子量大的要使外源基因的片断长度合适,不要过 大。
பைடு நூலகம் 2、pUC质粒载体:
pUC质粒载体:是由美国加利福尼亚大学的专家构建 的。是在pBR322质粒载体的基础上,组入了一个带 有多克隆位点的LacZ’基因,而发展成为具有双功能 检测特性的质粒载体。
最常用的克隆载体,优点: 具有更小的相对分子量和更高的拷贝数。 在构建pUC质粒载体时仅留下pBR322的复制起始起 始位点和AMP抗性基因,分子大大减小,他的拷贝数 可以达到500-700个/个细胞。 适合组织化学法检测重组子。有利于检测 具有多克隆位点,便于片断的插入。
沉淀出来。
第一步:(1)在5m1含相应抗生素的LB培养基中接种 一单菌落,于37℃剧烈振荡培养过夜。(2)将1.5m1 培养物倒入Eppendorf管中,用微量离心机于4℃以 12000rpm离心30秒。 (3)吸去培养液,使细菌沉淀 尽可能干燥。(4)将细菌沉淀重悬于100μl用冰预冷的 溶液I中(溶液Ⅰ:50mmol/L 葡萄糖, 25mmol/L Tris· (pH 8.0), 10mmol/L CI EDTA(pH 8.0,溶菌酶4-5mg,酶作用环境由缓冲 液提供)。剧烈振荡。须使细菌沉淀在溶液Ⅰ中完全分 散,将两个微量离心管的管底部互相接触,室温静止5 -30min,细胞壁降解。

第三章基因工程载体

第三章基因工程载体

3个会导致Ampr基因失活
9个导致Tetr基因失活
氨苄青霉素和四环素抗性 24个单一克隆位点。
pBR322的优点
① 双抗生素抗性选择标记
抗生素抗性基因的插入失活效应是检测重 组体质粒的有效方法,分两次先后选择: 没有获得载体的寄主细胞 在Amp或Tet中都死亡。 获得重组载体的寄主细胞 在Aplasmid ):在整个细胞
周期中随时可以复制,每个细胞中有许多拷贝, 一般10-60 拷贝,如Col E1质粒。
氯霉素扩增:在抑制蛋白合成并阻断细菌染色体
复制的氯霉素存在时,松弛型质粒可继续扩增, 其拷贝数可达2000-3000个,称氯霉素扩增效应
严紧型复制质粒 (stringent plasmid ):
plasmid 接合型质粒(自我转移的 质粒):质粒可从一个细胞自发转移到另一个细胞。
Non
Conjugative plasmid 非接合型质粒
(不能自我转移的质粒):由于失去控制细菌配 对和自我转移的基因,质粒不能从一个细胞自发 的转移到另一个细胞。

结合型质粒:相对分子质量大、拷贝数小、 严紧型复制 非结合型质粒:相对分子质量小、拷贝数多、松弛型复制
① colicin E1基因的结构 cea imm 免疫基因 kil 溶菌基因
结构基因
② 杀死不含有ColE1细菌的原因 cea + kil基因产物 ③ 不被其他细菌的colicin E1所杀死的原因 imm基因
克隆位点
EcoR I
EcoR I位于E1内部,插入外源DNA导致E1 失活,使受体菌不能合成E(ColE1-),但 仍表现出对E1免疫型(ImmE1+)。
外源DNA
Colicin E1

基因工程-载体

基因工程-载体
呈超螺旋(SC)
② 开环DNA( open circular, ocDNA )
一条链上有一至数个缺口。
③ 线形DNA ( linear ,lDNA)
3. 质粒空间构型与电泳速率 同一质粒尽管分子量相同,不同的构 型电泳迁移率不同:
scDNA最快、l DNA次之、ocDNA最慢。
O的不相容性的分子机制:
两种含有不同复制子结构的不同质粒,在复制时各受自己的 拷贝数控制系统的调节,致使两种质粒的最终拷贝数恒定, 因此在经过若干复制周期和细胞分裂周期后仍能共处于同一 细胞内。
两种含有相似复制子结构的不同质粒,在复制时受到同一种 拷贝数控制系统的干扰,致使两种质粒的最终拷贝数不同, 其中拷贝数多的质粒在以后的细胞分裂周期中更具优势。
点,位于lacZ’基因的5’端。
pUC18/19
2. ColE1
(1)类型 天然质粒,属高拷贝型。 特点是在培养基中加入氯霉素抑制细菌 蛋白质合成后,质粒仍然能复制达到每 个细胞1000-3000拷贝之多!
(2)长度 6.3 kb。
(3)选择标记
大肠杆菌素(colicin)E1和对E1免疫的 基因(immE1)
① colicin E1基因的结构
唯一的克隆位点 EcoR I 正好位于这个 基因的内部。
可以通过插入失活筛选。但细菌群体容 易自发突变出抗colicin E1的细胞…….
2. 质粒载体必须具备的基本条件
(1) 具有复制起点(ORI)
(2)具有抗菌素抗性基因
是筛选的标志。理想的载体应该有两 种以上抗菌素抗性基因。 (3)若干限制性内切酶的单一位点 (多克隆位点):
6、质粒载体的构建
1. 天然质粒的局限性
(1)分子量大,拷贝数低

基因工程基因工程的载体

基因工程基因工程的载体

2020/4/4
苏州科技学院生物系
叶亚新
第三章 基因工程的载体
作为基因工程载体的基本功能
1. 运送外源基因高效转入受体细胞 2. 为外源基因提供复制能力或整合能力 3. 为外源基因的扩增或表达提供条件
2020/4/4
苏州科技学院生物系
叶亚新
第三章 基因工程的载体
作为基因工程载体必须具备的基本条件
1)标记基因与宿主细胞 2)标记基因产物的作用机制: Apr 3)标记基因的结构与适用范围: 基因启动子, 翻译起始
序列, 密码子偏爱性
4)标记基因的结构变化对功能的影响: LacZ, GUS
4. 常用的遗传标记基因
1) 四环素抗性基因(Tcr)
Tetracycline 可结合在核糖体30s亚基中的一种蛋白 质分子上,抑制核糖体的转位过程。四环素抗性基因编码 一种399 AAs蛋白质,与细菌细胞膜结合,阻止四环素分 子进入细菌细胞。
第三章 基因工程的载体
载体:携带外源基因进入受体细胞的工具 用于基因工程的载体
•细菌质粒载体 •噬菌体λ衍生载体 •Cosmid载体 •Phagemid载体
•酵母质粒载体 •真核病毒载体 •Bacmid载体 •YAC载体
2020/4/4
苏州科技学院生物系
叶亚新
发展概况
1. 第一阶段(1977年前):天然质粒和重组质粒的利用,
2020/4/4
苏州科技学院生物系
叶亚新
2) 氨苄青霉素抗性基因(Apr)
Ampicillin可抑制细菌细胞膜上参与细胞壁合成酶类的活性。Apr 抗性基因编码一种分泌到细菌细胞周间质的酶,催化β—内酰胺环的 水解,使氨苄青霉素失活。
3) 氯霉素抗性基因(Cmr)

基因工程第三章基因工程的载体

基因工程第三章基因工程的载体

基因工程载体的种类
质粒载体
质粒是一种裸露的、独立于细菌 拟核DNA之外的DNA分子,具有 自我复制能力,可携带外源DNA 片段。
病毒载体
病毒载体是指能够将外源DNA片 段插入到病毒基因组中,并利用 病毒的复制机制将外源DNA片段 导入到受体细胞中的媒介。
基因工程载体的作用
基因转移
基因工程载体能够将外源DNA片 段导入到受体细胞中,实现基因 的转移和表达。
通过优化载体结构,提高其在宿主细胞内的稳定性,降低丢失和突变 的风险。
开发NA的载体,提高基因工 程的效率和安全性。
拓展载体功能
通过基因工程技术对载体进行改造,赋予其新的功能,如表达调控、 靶向输送等。
智能化载体
利用合成生物学和纳米技术,开发具有智能响应能力的基因工程载体, 实现基因治疗的精准化和个性化。
利用基因工程载体生产食品添加剂、 酶制剂等,提高生产效率和产品质量。
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此外,噬菌体载体还可以用于疫苗研 发和生物治疗等领域。
04 人工染色体载体
人工染色体的概念与特性
人工染色体是一种通过基因工程技术 构建的染色体,具有与天然染色体相 似的结构和功能。
人工染色体具有高容量、可定制和可 调控等特性,能够承载和表达大量的 外源基因,为基因治疗、生物制药等 领域提供了新的工具。
质粒载体的应用
总结词
质粒载体在基因工程中广泛应用于基因克隆、表达和基因治疗等领域。
详细描述
质粒载体此外,质粒载体还可以用于基因治疗和疫苗研制等领域, 为疾病治疗和预防提供了新的手段。
03 噬菌体载体
噬菌体的生物学特性
基因克隆
基因工程载体可作为基因克隆的 工具,将外源DNA片段插入到载 体中,通过复制和扩增实现基因 克隆。

基因工程载体质粒

基因工程载体质粒
• ①HA • ②Luaferase • ③GFP • ④便于检测的多肽
丢失四环素抗性标记的正选择体系
原理是具有四环素抗性的细菌对亲脂的螯合剂萎蔫酸 (fusaric acid)极为敏感,因此,将外源性DNA插入到质粒 载体的四环素抗性基因的酶切位点上,在含有萎蔫酸的培 养基上筛选对四环素敏感的重组子,则是十分方便的方法。
人工质粒要素
1.质粒的基因组小好(不影响生物学功能前题) 。转化入细菌的转化率与质粒大小呈反比,当质 粒大于15kb时,转化率将成为限制因素,质粒大, 拷贝数越低。

2.质粒应易于转化。 3.质粒应有较多的拷贝数。 4.选择标记。 5.质粒DNA可插入结合较大的外源DNA
大肠杆菌质粒分子的结构示意图
环形质粒分子
环形染色体DNA
质粒DNA
大肠杆菌细胞 抗菌素抗性基因
控制质粒DNA转移的基因
质粒主要包括几个组成部分
• 复制子(reilcator) • 复制起始位点(replication origin site) • 多克隆位点(Polylink)(MCS) • 辅助序列(COS位点等) • 选择标记(LacZ,抗性等)
Merry,1983 YAC) 9,来源于P1的细菌人工染色体(P1-derived artificial
chromosome PAC, loannon,1994)、 10,哺乳动物人工染色体(MAC,mamal artificial
chromosome,Farr,1991) 11,人类人工染色体(HAC,human artificial
pUC 18 和pUC 19质粒图谱
• 质粒主要包括几个组成部分:
• 一、复制子(reilcator)
• 也就是基础复制子(basic replicon), 具有原质粒同样拷贝数的最小自主复制 单位。一般约2kb,含一个复制起始部 位Orgin(Ori)拷贝数多少和携带有 控制复制的基因信息。

基因工程载体

基因工程载体

第三章基因工程载体体外获得的任一DNA片段,必须插入到可以自我复制的载体内,再转入宿主细胞,才能得到复制和进行表达。

基因工程载体(Vectors)就是携带外源基因进入受体细胞进行繁殖和表达的一种工具。

载体的功能运送外源基因高效转入受体细胞为外源基因提供复制能力或整合能力为外源基因的扩增或表达提供必要的条件基因工程中3种主要类型的载体:1.质粒载体2.噬菌体载体3.柯斯质粒(cosmid)载体基因工程对载体的要求(1)在宿主细胞内能独立复制。

(2)有选择性标记。

(3)有一段多克隆位点。

外源DNA插入其中不影响载体的复制。

(4)分子量小,拷贝数多。

(5)容易从宿主细胞中分离纯化。

第一节质粒(plasmid)载体质粒是一种独立于染色体外的双链闭环的DNA分子,具有自主复制和转录能力,能在子代细胞中保持恒定的拷贝数,并表达所携带的遗传信息。

质粒的复制和转录要依赖于宿主细胞编码的某些酶和蛋白质,如离开宿主细胞则不能存活,而宿主即使没有它们也可以正常存活。

(一)质粒的构形环形双链的质粒DNA在提取过程中通常出现三种不同的构型:①共价闭合环形DNA(cccDNA)②开环DNA(open circular,ocDNA)③线形DNA(linear,lDNA)(二)质粒的转移性指质粒从一个细胞转移到另一个细胞的特性。

接合型质粒:除了带有自我复制所必需的遗传信息外,还带有一套控制细菌配对和质粒接合转移的基因。

如:F质粒(性质粒或F因子)甚至能使寄主染色体上的基因随其一道转移到原先不存在该质粒的受体菌中。

不符合基因工程的安全要求。

非接合型质粒:带有自我复制所必需的遗传信息,但失去了控制细菌配对和质粒接合转移的基因,因而不能从一个细胞转移到另一个细胞。

如R质粒(抗性质粒)、Col质粒(细菌素质粒)。

符合基因工程的安全要求。

R质粒:带有一种或数种抗生素抗性基因,使寄主获得同样的抗生素抗性性状(resistance)。

Col质粒:细菌素通过与敏感细菌细胞壁的结合作用,抑制一种或数种细胞生命过程。

基因工程常用的三种载体

基因工程常用的三种载体

基因工程常用的三种载体载体是基因工程中常用的一种工具,用于将外源基因导入宿主细胞中并进行表达。

常见的载体有质粒、病毒和人工染色体。

本文将分别介绍这三种载体的特点、用途和优缺点。

1. 质粒:质粒是圆形、双链DNA分子,广泛应用于基因工程中。

质粒的构建相对简单,可以通过DNA重组技术来插入外源DNA 片段。

质粒通常包含由宿主细胞识别的来源于细菌或酵母的起源序列,以实现在细胞中的复制和维持。

此外,质粒上还包含选择性标记基因和表达调控元件,以便筛选和调控目标基因的表达。

质粒在基因工程中有着广泛的应用。

首先,质粒载体可以在大肠杆菌等常见细菌中表达外源基因,用于重组蛋白的产生和纯化,或进行功能研究。

此外,质粒也可以构建用于植物和动物细胞的转染,用于基因转导和基因治疗等领域的研究。

质粒的优点在于构建简单,易于操作,并且可以在多种细胞中进行表达。

然而,质粒的转染效率较低,不适合大规模基因转导。

此外,在某些细胞中,质粒的稳定性较差,易丧失外源基因。

2. 病毒:病毒是一类依赖于细胞代谢活动的生物体,可以将外源基因导入宿主细胞并进行复制和表达。

常见的基因工程病毒载体包括腺病毒、逆转录病毒和腱实病毒等。

病毒载体的主要特点是高效的基因转导能力和细胞特异性。

由于病毒依赖于细胞进行复制和表达,因此病毒载体能够实现高效转导和表达目标基因。

此外,病毒载体还可以通过选择性修饰病毒表面蛋白来实现对特定细胞的特异性转染,进一步提高基因转导效率。

病毒载体被广泛应用于基因治疗和基因敲除等研究领域。

在基因治疗中,病毒载体能够将替代基因导入患者细胞中,以治疗某些遗传性疾病。

在基因敲除中,病毒载体则可以导入携带某种特殊序列的DNA片段,进而敲除靶基因。

然而,病毒载体也存在一些限制。

首先,病毒复制过程中可能引起细胞毒性反应,对细胞造成伤害。

其次,病毒载体的构建和生产相对复杂,需要严格的无菌操作和关键的质控步骤。

3. 人工染色体:人工染色体是一种合成的染色体模拟体,可用于将大片段基因组DNA导入宿主细胞中。

基因工程载体

基因工程载体
基因工程载体
基因工程载体是指用于携带外源基因,并在细胞内进行复制和表达的分子。 它们是改造生物的基础。
基因工程载体的类型
质粒
常用于细菌表达,包括原核生物和真核生物的质粒。
病毒载体
包括腺病毒、逆转录病毒等,常用于转导和转化细胞。
工具基因
可直接或间接编码外源蛋白质,还可辅助其他载体用于目的基因的快速识别与筛选。
用于表达重组蛋白等药物,开 发快速且经济有效的制剂工艺。
基因工程载体可用于生物药物及生产技术的研发,是生物医药领域的重要组成部分。
基因工程载体的设计和构建
1
槽式开阔系统
通过个性化定制载体的结构、比例、含量和形态,提升载体的反应性和扩散性。
2
基因簇筛选
可通过对质粒载体进行簇分析和筛选,去除异质体和残留DNA等,提升载体质 量。
3
切割与黏合
运用限制性内切酶、酶切ligase、PCR反应等技术,制备并放大载体。
基因工程载体的后续研究和发展
1 功能扩展
以基因载体为核心,引导基因工程技术的快速发展。
2 多样性构建
以创新设计为核心,开发绿色化、精简化、标准化、差异化、低耗能的基因载体构建平 台。
3 质量控制
研究基因工程质量控制的理论、方法及其结构化的过程,以期提升载体质量,并引导其 向更广泛领域扩展。
常见的基因工程载体
1
慢病毒
2
常用于生物学研究中的基因修饰技术,
有望成为治疗人类遗传病的一种有效工
3
具。
大肠杆菌BL21
用于重组表达外源蛋白,是最常用的质 粒载体。
转座子
可用于转移基因,可以使植物和动物的 产生长期、稳定、准确的基因转移。基因工程载体的特点和优势

基因工程的载体种类

基因工程的载体种类

基因⼯程的载体种类基因⼯程的载体对于外源基因的复制、扩增、传代乃⾄表达⾄关重要,其必需具备以下条件:①具有有效运载能⼒,能够进⼊宿主细胞;②对多种限制酶有单⼀或较少的切点,最好是单⼀切点,即本⾝是⼀个复制⼦,携带外源基因前后均能在宿主细胞内⾃主复制,或者能够整合到宿主细胞中;③在宿主中能控制外源基因的表达活动;④要有筛选标记,鉴定⽅便,装卸⼿续简单;⑤容易控制,安全可靠。

在基因⼯程(DNA重组)中,使⽤的载体有:①克隆载体(clone vector),即以繁殖DNA分⼦为⽬的的载体;②穿梭载体(shuttle vecto),⽤于真核⽣物DNA⽚段在原核⽣物中增殖,然后在转⼊真核⽣物细胞宿主表达;③表达载体(express vector),⽤于⽬的基因的表达。

现在对载体提出了更⾼的要求,如:⾼拷贝数、具有强启动⼦和稳定的mRNA、具有⾼的分离稳定性和结构稳定性、转化频率⾼、宿主范围⼴、插⼊外源基因容量⼤且可以重新完整地复制与转录、和宿主细胞匹配等。

此外,载体在宿主不⽣长或低⽣长速率时仍能⾼⽔平地表达⽬的基因。

但达到上述要求的载体很少,尤其是当动物细胞作为宿主细胞时,⽬前能⽤的主要时病毒,进⼊宿主的⽬的基因⼀般只能是⼀个基因,⽽以基因组或多个基因同时进⾏重组还有⼀定困难。

⼀、质粒克隆载体除酵母杀伤质粒(killer plasmid)为RNA外,其他质粒多位环状DNA分⼦,每个质粒都有⼀段DNA复制起始点的序列,帮助实现质粒的复制。

质粒⼀般决定抗⽣素的抗性、产⽣抗⽣素酶系、糖酵解酶系、降解芳⾹族化合物酶系、肠毒素及限制-修饰酶系等。

其中严紧型复制控制质粒的复制与宿主染⾊体同步,并与宿主蛋⽩质合成有关,与DNA聚合酶I活性⽆关,蛋⽩质合成停⽌,质粒与宿主染⾊体复制亦停⽌,故只有1个或少数⼏个拷贝;⽽松弛型复制控制质粒的复制与宿主染⾊体复制不同步,与蛋⽩质合成⽆关,与DNA聚合酶I活性有关,蛋⽩质合成停⽌,质粒仍可复制,故可以在宿主有10—206个拷贝。

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常用抗生素的作用方式及抗性机理
抗生素名称 氨苄青霉素 (Amp) 氯霉素 (Cm) 卡那霉素 (Kan) 链霉素 (Sm) 四环素 (Tet) 作用方式 抗性机理 一种青霉素的衍生物,通过干扰 bla抗性基因编码的一种周质酶,即β-内 细菌胞壁合成之末端反应,而杀 酰胺酶,可特异的切割amp的β-内酰胺 死生长细胞。 环,从而失去杀菌效力。 一种抑菌剂,通过同核糖体50S 亚基的结合作用,干扰细胞蛋白 质的合成,并阻止肽键的形成。 cat抗性基因编码乙酰转移酶,特异地使 氯霉素乙酰化而失活
λ噬菌体载体
结构特点: ①线性双链DNA分子 ②具非必需区(约1/3长度) ③两端具12个核苷酸单链互补粘性末端 ④可在E.coli中大量繁殖 ⑤可克隆15Kb左右的外源DNA
(2)质粒的基本特性
1) 2) 3) 4) 5) 自主复制性 不相容性 可扩增性 可转移性 携带遗传标记 野生型的质粒DNA上往往携带一个或多个遗传 标记基因,这使得寄主生物产生正常生长非必需 的附加性状,包括:抗生素、抗抗生素、抗重金 属、产生细菌毒素等。对DNA重组分子的筛选具有 重要意义。
(3)质粒DNA的转移
质粒自主转移
导入
+
自主转移
+
无DNA转移
donor
H H
H
+
辅助转移
H
+
质粒的辅助转移
H
H
+
Notransfer
质粒的重组转移
R-重组DNA分子
重组

+
DNA 转移
R
+ R
(4)质粒的命名
人工组建的质粒 第一个字母是质粒的英文名字(Plasmid)的第一 个字符p, 用小写。后面有两个字母是大写,代表质 粒的发现者和实验室名称,再后面是质粒的编号。
天然质粒载体 天然载体质粒的第一个字母大写,且质粒符号用括 号括起来。如(ColE1)。
(5)质粒的构建
天然质粒的缺陷 分子量大 拷贝数低 单一酶切位点少 遗传标记不理想 ColE1 和pSC101 是两类天然质粒的代表,人工构建 的质粒大都来自它们。
pSC101:
第一个用于基因克隆的天然质粒。宿主细菌沙门氏 菌,9.1kb,严谨型复制,1-2copy/cell,但只有一 个EcoR I切点充当克隆位点,Tetr 作为筛选标志。
依据载体的生物来源分为: 病毒载体 非病毒载体 根据载体的用途分为: 克隆载体 表达载体 按照导入的受体生物分为: 大肠杆菌载体 酵母载体 植物载体 动物载体
基因载体必须具备的特征条件: 对受体细胞的可转移性。 具有与特定受体细胞相适应的复制位点或 整合位点。 具有多种单一的核酸酶识别位点。 具有合适的选择标记。 分子量较小,多拷贝。
pUC18/19质粒载体的优点
① 更小的分子量和更高的拷贝数 如pUC18为2682bp,pUC8为2750bp; 500-700copy/cell ② 适于用组织化学方法检测重组体 X-gal显色、抗菌素双重直接选择 ③ 具有多克隆位点(MCS)区 使有两个不同粘性末端的外源DNA方便地插入 ④ 测序方便:pUC的MCS与M13噬菌体载体的MCS完全相同, 便于把外源DNA转移到M13载体上测序。
缺陷:分子量大 拷贝数低
ColE1:
宿主细菌大肠杆菌,6.5kb,松弛型复制,10003000 copy/cell。筛选标志是大肠杆菌素E1 (colicin E1)。colicin E1能杀死不含ColE1 质粒 的菌,形成“噬菌斑”。 唯一的克隆位点 EcoR I 正好位于这个基因的内部。 因此可通过插入失活筛选。但细菌群体容易自发 突变出抗colicin E1的细胞。 缺陷:筛选标志不理想
大肠杆菌质粒分子结构
(1)质粒的分类
①根据赋予的宿主的遗传性状分: F因子(性因子) R质粒(抗性因子) Col质粒(产大肠菌素因子) ②根据质粒的可转移性可分成两大类: 接合型质粒:天然条件下自发地进行细胞间接合。 非接合型质粒:不能在天然条件下独立地发生接合。
③根据复制控制类型分类 根据在每个细胞中的分子数(拷贝数)多 寡,质粒可分为两大复制类型: 严紧型复制控制的质粒 1-3 拷贝 松弛型复制控制的质粒 10-200 拷贝 在基因工程中,为提高工程菌表达效率,一般 选用松弛型复制控制的质粒。
质粒的人工构建
(1)选择合适的亲本质粒,缩短长度,切去不必要的片 段,提高导入效率,增加装载量 (2)加入易于检出的选择标记基因 (3)增加或减少合适的酶切位点,便于重组 (4)改变复制子,变严紧为松弛,变少拷贝为多拷贝 (5)关于质粒安全性的改造 (6)根据基因工程的特殊要求加工特殊的基因元件 (7)构建过程力求简单
构建方法就是重组,拼接。
常用的选择性标记 Ap (Amp): Ampicillin 氨苄青霉素 Tc (Tet): Tetracyclin 四环素 Cm: Chloromycetin 氯霉素 Kan (Km): Kanamycin 卡那霉素 Sm (Str): Streptomycin 链霉素 R (r): Resistance 抗性 S: Sensistance 敏感性 Lac: Lactose 乳糖操纵子 P: Promotor 启动子 IPTG:异丙基—巯基半乳糖苷(乳糖类似物) X-gal:5’-溴4-氯3-吲哚β-D半乳糖苷 (着色剂)
(二)大肠杆菌载体
大肠杆菌载体主要有: ①质粒载体; ②噬菌体载体; ③柯斯(粘粒)质粒
1. 质粒载体
质粒是存在于细菌细胞质中独立于染色体而自主复制的共 价、封闭、环状双链DNA分子(Covalently closed Circular DNA, ccc DNA),1-200kb以上。 并不是细菌生长所必需的,但可以赋予细菌某些抵御外界 环境因素不利影响的能力。 自身在细菌细胞中能不断复制繁殖,质粒DNA能从细菌中提 出来,又能再转入细菌,这个过程称转化。转入的质粒 DNA仍能进行复制,这种性能为DNA重组技术提供了重要的 条件,即将一种外源基因与质粒重组后,再转入细菌中去 复制繁殖,使外源基因得以增殖。
2. 噬菌体载体
噬菌体是一类细菌病毒的总称,能高效率高 特异性地侵染宿主细胞,然后或自主复制繁殖, 或整合入宿主基因组中潜伏起来,而且在一定的 条件下上述两种状态还会相互转化。 噬菌体上述特性使得它们的DNA能被开发成为基因 工程的有用载体,因为:
高效率的感染性能使外源基因高效导入受体细胞; 自主复制繁殖性能使外源基因在受体细胞中高效扩增。
质粒DNA的转移和复制
5' 3'
3'5'
1)质粒转移的必备条件 ⅰ.转移起点(oriT),它是质粒DNA转移时的复制起点— 顺式 作用(cis-action) ii. 细胞附属物—性纤毛,由蛋白质构成—反式作用 ⅲ.转移过程所需的全部酶类—反式作用
2)质粒转移类型 ⅰ.自我转移(Self-transmissible) ⅱ.辅助转移(Donation)—可转移质粒仅具备oriT, 若无辅助质粒,前者不会发生接合转移。若辅助质 粒可提供所有反式作用的蛋白质,前者便会发生接 合转移。 ⅲ.重组转移(conduction)—若质粒无oriT,该质粒 只有整合到辅助质粒DNA中,重组质粒便可转移。 因此,用于克隆外源DNA的分子克隆载体,只要 具备oriT即可,另外两类功能基因可置于辅助质粒 上,该质粒一般没有oriT,因而可以减少后者进入 另一种细胞的频率。
人工构建的质粒根据其功能及用途分为:
基因扩增的质粒:拷贝数达到每个细胞数千 测序质粒 :高拷贝数、加装测定顺序所必需的序列 整合质粒: 装有整合促进基因及整合特异序列 穿梭质粒 :能在两种不同的受体细胞中复制 表达质粒: 外源基因能在受体细胞内的高效表达 探针质粒 :筛选克隆或寻找基因元件,通常装有一个 可以定量测定其表达的标记基因,如抗性基因。
β-半乳糖苷酶作用于X-gal显色反应
X-gal也是β-半乳糖苷酶的一种底物, β-半乳糖苷酶 能把无色的化合物X-gal分解成半乳糖和一个深蓝色 的物质5-溴-4-氯靛蓝
IPTG诱导的结果:蓝白斑筛选
MCS无插入时,互补,蓝菌斑 MCS有插入时,不互补,白菌斑
通过看培养皿上的菌斑的颜色就能直接知道 是否有DNA插入。
pUC系统
美国University of California的科学家J. Messing和J. Vieria 在pBR322的基础上改造而成。有pUC7、pUC8、pUC9、 pUC10、pUC11、pUC18、pUC19等。 ① 来自pBR322质粒的 复制起点 ② 氨苄青霉素的抗性 基因 ③ 大肠杆菌β-半乳糖 酶基因的启动子及 其编码的α-肽链基 因(lacZ’) ④ 位于lacZ’基因内的 一段MCS区段(10个 连续的单酶切位点)
EcoRI
pMB9 3.5
pMB8 1.8 松弛
融合 特点:松弛、抗性
PstI HpaI
削减 特点:Tetr 、 Ampr 、松、 小
Tn3 pSF2124 7.4 Ampr Tetr pBR312 6.7
Tn3
EcoRI pBR312 5.4
Apr
Ampr
重排 去Tn3上的BamHI 特点:Tcr 、Apr 、松
pBR322的构建过程
复制起始位点:源于 ColE1衍生质粒pMB1。 Ampr基因:源于 pSF2124质粒转座子 Tn3。 Tetr:源于pSC101质 粒。
pSC101 5.8 严紧
Tetr
pBR322构建谱系
Tetr Tetr pBR322 4.3 松弛 Ampr
转位 特点:松弛、 Tetr 、 Ampr 缺点:体积大
一种杀菌剂,通过同70S核糖体 kan抗性基因编码氨基糖苷磷酸转移酶, 的结合作用,导致mRNA发生错 可对Kan进行修饰,从而阻止同核糖体 读。 之间的相互作用。 一种杀菌剂,通过同核糖体30S 亚基之间的结合作用,导致 mRNA发生错译。 一种抑菌剂,通过同核糖体30S 亚基之间的结合作用,阻止细菌 蛋白质的合成 str抗性基因编码一种特异性酶,可对链 霉素进行修饰,从而抑制其同核糖体30S 亚基的结合 tet抗性基因编码一种特异性蛋白质,可 对细菌的膜结构进行修饰,从而阻止四 环素通过细胞膜从培养基中转运到细胞 内。
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