电泳条件及不同胶浓度配制

试剂配制：

（1）30%聚丙烯酰胺贮液：将聚丙烯酰胺（电泳级）150g，N,N′—甲叉双丙烯酰胺（电泳级）4g溶剂于400ml双蒸水中，补充双蒸水至500ml，滤纸过滤后，于棕色瓶中4℃避光保存。

（2）1.5mol/l Tris碱（pH8.8）：将90.75Tris碱溶解于400ml双蒸水中，用1mol/l HCl调至pH8.8，补充双蒸水定容至500ml，4℃冰箱保存。

（3）1.0mol/l Tris碱（pH6.8）：将12.1Tris碱溶解于80ml双蒸水中，用1mol/l HCl调至pH6.8，补充双蒸水定容至100ml，4℃冰箱保存。

（4）10%SDS：将10gSDS溶剂于100ml双蒸水中，混匀后，室温保存。

（5）10%过硫酸铵：将0.1过硫酸铵（电泳级）溶解于1ml双蒸水中（用时加水溶解），4℃冰箱保存。

（6）10倍电泳缓冲液（25mmolTris,192mmol甘氨酸，0.1%SDS，pH8.3）：在10L大玻璃管中加8L双蒸水，303gTris碱，1442g甘氨酸，100gSDS溶解后调pH8.3补水至10L，混匀后，室温保存。

（7）样品缓冲液：将1.6ml10%SDS，0.8ml甘油，1.0ml1.0mol/l Tris（pH6.8），加入到4.0ml 双蒸水中，加0.01%溴酚蓝，0.4ml巯基乙醇。

（8）染色液配制

0.25%考马斯亮蓝（CCB）染色液：考马斯亮蓝R-250甲醇-醋酸混合液。取1.25g考马斯亮蓝R-250，溶于227ml蒸馏水中，加甲醇227ml，再加入冰乙酸46ml（近似5:5:1）搅拌使其充分溶解，室温保存备用。

（9）脱色液配制：甲醇：水：醋酸=5:5:1混合备用。或用20%乙醇水溶液。

实验步骤

1待测蛋白样品制备

（1）根据每种方法提取的蛋白，用含SDS的样品缓冲溶液溶解，充分溶解后沸水加入3-5min，1600r/min离心5min，取3上清液进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。

（2）用不含SDS的样品缓冲液溶解蛋白，充分溶解后沸水加入3-5min，1600r/min离心5min，取上清液进行无SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。

垂直板状SDS聚丙烯酰胺凝胶的灌制

1 安装：根据电泳仪说明书安装在灌胶架上。

2根据下表配制分离胶溶液

加入1过硫酸铵，立即摇匀，将其迅速、联系地灌注在两块玻璃板的间隙中，高度据玻璃上边2cm。之后，用带有针头的注射器小心的在丙烯酰胺溶液的上部覆盖上一层去离子水（不要冲击胶面），在室温下垂直放置30min左右，使其完全聚合凝固。

吸出覆盖层溶液，用去离子水洗涤顶部1-2次，弃去多余的溶液。将配置好的浓缩胶溶

液，加入过硫酸铵后立即混合均匀，迅速灌在已聚合的分离胶的上部。随即插入干净的有机玻璃梳子（不能有气泡），梳齿前沿与分离胶间距离约为0.5cm。在室温下使其完全凝固（约10-15min）。

加样

小心将灌好胶的胶板从灌胶架上取下，安电泳说明书所示放入电泳槽中，加入稀释过的电极缓冲液（Tris-Gly，pH8.3）至高出内侧玻璃板上边约0.4cm。小心取下梳子。用微量加样器吸已经处理好的标准蛋白和待测蛋白样品液5-10ul，按预定顺序，通过缓冲液小心地把样品加入每个小槽底部。因样品比重大，可在凝胶的顶部形成致密的一层。

电泳盖好电泳槽盖，下槽为正极，上槽为负极。接通电泳仪电源，电流调至5A，样品开始进入上层胶中，逐渐被浓缩。当染料前沿进入分离胶时，调至15A，继续电泳，直至溴酚蓝接近分离胶底部，停止电泳。

拨胶卸下电泳板，将胶片直接装入盛有染色液的大培养皿中，在摇摆仪上染色两小时，然后用蒸馏水漂洗3次，然后加入脱色液，根据情况更换次数，是凝胶蓝色背景退去，显现出清晰地蛋白条带。

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电泳样品的准备:取 30μl蛋白提取液 ,根据 Bradford法测定的浓度 ,加样品缓冲液 (0.1 mol /L Tris2 HCl,含 1%SDS, 0.01 mol /L 2-巯基乙醇 , 0.1 g/L溴酚蓝,150 g/L蔗糖 , 5 mol /L脲 pH 8.0)将蛋白提取液均稀释至蛋白浓度 1μg/μl。点样前涡旋混匀。

电泳贮液的配制: (1) 丙烯酰胺单体贮液: 29.10 g丙烯酰胺 + 0.90 g N、N′ 2 甲叉双丙烯酰胺加水定容至100 ml,用棕色瓶 4℃保存。 (2)浓缩胶缓冲贮液 ( 1.0 mol /L Tris2 HCl, pH 6.80):12.10 g Tris溶于80 ml水 , 用4 N HCl 调 pH至 6.80,定容至 100 ml, 4℃保存。 (3) 分离胶缓冲贮液 (1.5 mol / L Tris2HCl, pH 8.80) : 18.15 gTris溶于 80 ml水 ,用 4 N HCl调 pH 至 8.80,定容至 100 ml, 4℃保存。 (4) 10% SDS:10 g S DS加水定容至 100ml。

(5) 10%过硫酸铵 (AP):0.1 g过硫酸铵加 1.0 ml水。 (6) 10% TEMED: 0.1 ml TEMED加 0.9 ml水。

分离胶配制:本实验采用 12%的分离胶: 12 ml 30%的丙烯酰胺单体贮液 , 7.

5 ml分离胶贮液 , 300μlSDS, 10.2 ml纯水,300μl AP, 120μl TEMED

浓缩胶的配制:本实验采用 5%的浓缩胶: 2 ml 30%的丙烯酰胺单体贮液 , 3 ml浓缩胶贮液 , 120μl SDS,6.8μl 纯水，50μl AP，50μl TEMED。

电泳:采用不连续垂直板状凝胶电，点样量 6μl,恒流电泳 ,样品在浓缩胶时电流 40 mA，进入分离胶后电流 80mA。

染色与脱色:凝胶用 0.225%的考马斯亮蓝 R2 250 (纯水:无水乙醇:冰醋酸= 50:43:7)染色 30 min,然后在脱色液 (纯水:无水乙醇:冰醋酸 = 17: 2:1)中脱色。