高级动物生物化学：3-蛋白质的电泳分离-3

影响迁移率的因素：
影响迁移率的因素概括起来有如下几种： ① 蛋白质粒子的性质 电荷越多，泳动速度越快。粒子大小和形状也影响泳 动速度。较大粒子与周围介质摩擦力增加，泳动率下降。 球蛋白粒子的摩擦力和静电作用力小于纤维蛋白粒子。 ② 电场
迁移率与电流和电压成正比，与电阻成反比。
③ 缓冲液和离子强度。
这样当蛋白质快速移动到含Cl-的区域时会马上慢下来。 蛋白质在Cl-前沿的后边快速移动，当它达到前沿时又慢下 来，这种情况就导致蛋白质样品在甘氨酸离子和Cl-之间聚 集或浓缩成一个密集的圆盘。当蛋白质圆盘进入分离胶时， 由于凝胶孔度变小，因此移动变慢；而此时甘氨酸的解离 程度大大增加、带负电的离子增加到5%，所以甘氨酸泳动 速度加快、逐渐赶上和超过样品蛋白质的各个组分，消除 了电压梯度。
在溶液中，电场所产生的加速力被阻力平衡，即 F= F’，因此有：
Q·E/d=6π r η v
由上式可以看出，粒子在电场里运动的速度与场 强和粒子的电荷成正比，但与粒子的大小和溶液的粘 度成反比。 粒子在电场中移动的速度常用电泳迁移率来表示， 即带电颗粒在单位电场度下的泳动速度：
式中，M为迁移率；L为粒子泳动的距离；t为通电（电泳） 时间。在一定条件下，对于一定的粒子，M是一定的。因 此，它是描述物质在电泳中行为的特征参数。
F= Q ·E d
E为两个电极间的电势差; d是两个电极间的距离; E/d就是通常所指的场强; Q 为粒子所带电荷。
如果是在真空里，带电粒子的移动会很快，最后撞 到电极上。但是，在溶液里就不会是这样，因为电场对 粒子的拉力被运动的分子和溶液之间产生的阻力或摩擦 力所平衡。 根据Stoke方程，这种阻力的大小取决于粒子的 大小和形状以及粒子所通过的介质的粘度： F’=6πrηυ F’是球形粒子的阻力；r是球形分子的半径；η是溶液 的粘度；υ是粒子运动的速度。
二、电泳的类型
1. 电泳基本上分为两大类：
1) 自由界面电泳 包括微量电泳、显微电泳、等点聚焦，蔗糖 密度梯度电泳及等速电泳等 。 2) 使用支持物的区带电泳 按支持物的类型又分为：纸上电泳、醋酸纤维 薄膜电泳、薄层电泳、非凝胶电泳和凝胶电泳。
2. 按使用形式分类:
水平式、垂直式、板形、柱形电泳、双向 电泳、连续流动电泳及电泳和层析（如分 子筛）相结合的技术。 3.按使用目的分类: 分析型和制备型两种。 4.按操作原理电泳可分类： 一般电泳、等速电泳、等电聚焦电泳和免 疫电泳等。
PAG电泳是根据物质所带电荷及其分子大小、 形状的差异，在电场作用下产生不同电泳速度而 分离的技术，它有静电效应和分子筛效应，分辨 率很高。
在PAG中加两性电解质载体便成为等电聚焦电 泳，加入SDS，即成为SDS-PAG电泳。 (一) 盘状电泳 1. 一些基本概念： PAGE有连续式和不连续式。
凝胶与电泳缓冲液的pH和离子浓度相同，称 为连续式电泳。 这种凝胶是微孔物质、样品不易扩散，加上兼 有分子筛作用，分离效果较好。
在这种连续电泳方式的基础上，又开发了不连 续凝胶电泳，电泳带像一个薄盘嵌在凝胶柱中间， 故称盘状电泳。 由于使用的胶浓度、pH、电压都是不连续的， 所以又称不连续电泳，简称Disc电泳。
3. 和常规电泳比较，SDS-PAG电泳的操作有下面 不同： 1) 缓冲液： 在0.2M pH7.2的磷酸缓冲液中加入0.2%的 SDS和0.2%的巯基乙醇； 2) 样品： 电泳前蛋白质要溶解在1%SDS和1%巯基乙醇 的0.01M pH7.2的磷酸缓冲液中，100℃加热 2-5分钟。
4. 此法的最大缺点：
为了维持恒定的功率需要有良好的冷却系统。 通常在4℃进行电泳。LKB聚焦系统有两层循环 冷却水，温度十分恒定。下表列出了在不同pH范 围内凝胶薄层等电聚焦所用的电流，电压和聚焦 时间。
在不同pH范围内凝胶薄层等电聚焦所用的电流、电压和聚焦时间 电流（mA） pH范围 开始 3.5-9.5 2.5-6.0 5.0-8.5 7.5-10.5 80 100 80 50 终止 25 30 25 15 开始 400 600 800 500 终止 1000 900 1500 1000 电压（V） 聚焦时间 （小时） 1.5 2.0 1.5-2.0 2.5
1)SDS与蛋白质分子结合后，就发生构象变化， 解离成亚单位，失去原有活性。
2)有些蛋白质在SDS体系中的相对迁移率与其分 子量不呈线性关系，如某些糖蛋白，含二硫键 较多的蛋白质等的迁移率一般偏低，并不能代 表其实际分子量。 因此，一定要先用若干指示蛋白进行电泳， 绘制出logMr-M曲线。凡符合这直线关系的 蛋白质，方可用此法测分子量。
2. 圆盘电泳的原理
通过通电后各种离子的电泳行为来理解：
上槽缓冲液中Gly既可以净电荷为零的两性离子存 在，也可以带负电的Gly-离子存在：
NH3+ CH2COO-
NH2-COO- + H+
通电时，氯化物、蛋白质、溴酚蓝和甘氨酸的阴离 子都开始向阳极移动。当甘氨酸离子进入样品缓冲液 和浓缩胶时，就遇到了低pH环境，因而使上式的平衡 向偶离子的方向移动，而偶离子在电场中是不动的。 甘氨酸偶离子停止向样品和浓缩胶移动，就造成了移 动离子的短缺，因而使电流减弱。
2) 抗对流介质 用凝胶作抗对流介质的等电聚焦就是凝胶等电聚 焦。常用的抗对流介质是PAG, 它的作用是维持 连续性pH梯度和稳定分离后的蛋白区带。 3)电泳条件 等电聚焦电泳在通电之初，载体的电导很高， 载体两性电解质在电场中移动并形成pH梯度，这 时电导和电流都逐渐下降，而电压逐渐升高，形 成电压梯度。 电流下降到零，整个系统的电荷趋于零，达到 稳定状态，但功率始终维持不变。
电渗现象
液体在电场中对于一个固体支持物的相对 移动，称为电渗现象。 例如，在纸电泳时，由于纸上带有负电荷， 而与纸接触的水溶液因为静电感应带有正电荷， 在电场的作用下溶液便向负极移动并带动着质 点向负极移动。 假如这时进行电泳，则质点移动的表面速 度是质点移动速度和由于溶液移动而产生的电 渗速度的加和。
第五节
蛋白质的电泳分离
一、电泳的基本原理 二、电泳的类型 三、聚丙烯酰胺凝胶电泳 四、凝胶免疫电泳 五、高效毛细管电泳 六、印渍转移法（Western blotting）
电泳技术是鉴定生物大分子和分析其纯度的重要方法。
一、电泳的基本原理
蛋白质是两性电解质，在一定的pH下，可以解离 成为带正电荷或带负电荷的粒子。在电场中，带正电荷 的粒子向负极移动；带负电荷的粒子向正极移动。带电 粒子在电场中所受的力：
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
这可能是由于蛋白质分子大小的差别被它们 所带净电荷的差别所补偿。为了克服这个问题， Shapiro等人试图在十二烷基硫酸钠（SDS）存在 下来分离蛋白质混合物，发现，如果在PAG电泳 系统中加入SDS，则蛋白质的迁移率主要取决于 它的分子量，而与所带电荷和形状无关。
2. SDS原理： SDS是阴离子去污剂它能与蛋白质的疏水部分相 结合，并能把大多数蛋白质拆成组成它们的亚基形 式。由于大多数蛋白质与SDS的结合是按摩尔比 1.4:1进行，结合量很大，蛋白质表面电荷极大增加， 因而屏蔽了无SDS时正常存在的任何一种电荷。
SDS与蛋白质结合后，引起了蛋白质构象的变化， 使雪茄形的蛋白质分子的轴比改变，在巯基乙醇作 用下，二硫键还原为巯基，不同蛋白质组成的短轴 趋于一致，长轴与分子量成正比。它们的泳动速度 不再取决电荷和形状，仅与蛋白质的分子量有关。
用此法测分子量时，至少要有3-4种标准蛋白质， 而且它们的分子量要分布在未知蛋白质的两侧。
蛋白质也在电场中运动，不过由于其分子量大， 它们要花费更多的时间才能达到其相应的等电点位 置。所形成的pH梯度范围决定于Ampholine的组成。
已有不同pH范围的Ampholine出售：
3.5-9.5、2.5-6.0、5.0-8.5、7.5-10.5。pH 范围越窄，分辨力越高。 聚焦效果与电压密切相关，电压高、分辨力也高， 样品聚焦成很窄的带。灵敏度达到0.01-0.02个pH单 位。
缓冲液的种类直接影响电泳结果。用Tris-HCl分 离蛋白质时，HCl解离成Cl-,其泳动速度比蛋白 质快得多。由于样品与缓冲离子的泳动速度不一 致，引起不对称峰出现。若改用Tris-HAc和 Tris-硼酸，可消除此现象。缓冲液的pH直接影 响样品的解离程度和电荷密度。
④支持介质 介质结构对分子泳动速度有很大影响。介质对样 品颗粒的吸附可导致样品的拖尾，降低分辨率。 纸的吸附作用最大，醋酸纤维素吸附较小。有的 支持介质（如纸和淀粉胶）具有较强的电渗作用， 即电泳缓冲液相对于固体支持物的相对移动。显 然，电渗作用影响了泳动率。
（三）凝胶等电聚焦 (Isoelectric focusing) 1. 原理 等电聚焦是利用某些两性电解质支持物在电场中 形成pH梯度，使蛋白质样品在与它们的等电点相 应的pH区域集中，等电点不同的蛋白质泳动后形 成位臵不同的区带而得到分离。
1)载体两性电解质 是用脂肪族多氨基、多羧基物质作介质， 在电场中可获得理想的平滑pH梯度。 这种物质的商品名称Ampholine，它实 际上是一系列不同等电点的脂肪族多氨基 多羧基同系物及异构物的混合物，由丙烯 酸与多乙烯多胺加成后产生的。 由于合成物的不同分子氨基和羧基的比 例不同，从而形成连续的等电点。通常的 范围在pH3-10。
自由界面电泳过程中扩散严重、分辨率有限， 而且设备昂贵、操作繁琐，现已基本被区带电 泳所取代。 区带电泳分辨率很高，而且设备简单、操作 方便、经济实用。
三、聚丙烯酰胺凝胶电泳
目前对蛋白质分离有着高分辨率的电泳支 持物首推聚丙烯酰胺凝胶（PAG），它电渗 作用小、孔度可以控制、物理化学性质稳定。
但是，通过整个电泳系统的电流必须维持恒定，因此， 在快离子（Cl-）和慢离子（甘氨酸的COO-，此时仅占Gly 分子的0.1%,其余99.9%为偶离子）之间的区域的电压增加， 结果在Cl-和Gly-间产生一个很高的局部电压梯度。
在这个条件下，离子的相对迁移率是：Gly-<蛋白质离 子<溴酚蓝离子< Cl-。在这个强的局部电场中，所有的阴 离子蛋白质都移动迅速。浓缩胶是大孔胶，因而不阻碍蛋 白质的前进。如果哪一个蛋白质超过快离子，那它的移动 会慢下来，因为凡有Cl-的地方，并不缺少离子，因此没 有高的电位梯度。
分离胶pH8.9
电极缓冲液的pH为8.3 3) 缓冲系统不连续： 制备凝胶用Tris-HCl缓冲液
电极缓冲液为Tris-Gly
4) 电压梯度不连续
由于Cl-和Gly-离子的泳动速度不同，造成电 压梯度不连续。 正是由于这种不连续性使盘状电泳对样品具有浓 缩作用，即使浓度很低的蛋白质（10-50μg），也 能形成一条清晰的带，因而盘状电泳具有很高的 分辨率。
2. 圆盘电泳的特点是不连续性：
1)胶浓度不连续: 使用两种凝胶，上层称浓缩胶 (stock gel), 浓度一般为3%，其孔径大，高度2-3cm;下层为分 离胶（Separated gel）。 分离胶浓度根据被分离物的分子量大小而定， 一般是7.5-30%，其孔径小，高度5-6cm。
2) pH不连续: 浓缩胶pH为6.7
这样，从蛋白质和慢离子通过浓缩胶和分离胶的交界 面之后开始，通过凝胶的电场强度就恒定的了，而且蛋白 质分离过程也就与连续电泳完全一样。
-
Tris-Gly
Gly - pH8.3
3%
Tris-HCl
Cl-
pH6.7
Tris-HCl 7.5-25%
Cl-
pH8.9
+
3. 盘状电泳的优点:
蛋白质以一个很窄的区带进入分离胶，分离 得到的区带也很窄，因此，大大提高了分辨率。 (二) SDS-PAG电泳 1. SDS-PAG电泳是专门用来测定蛋白质的分子 量的技术。 虽然蛋白质在PAG中的迁移率是它所带 电荷和它的大小的函数，但可能有这样的 情况：两个分子量不同的蛋白质以相同的 速度向阳极移动。