高级动物生物化学：3-蛋白质的电泳分离-3
蛋白质分离的方法
蛋白质分离的方法引言：蛋白质是生物体内重要的基础结构和功能分子，对于研究生物学、医学等领域具有重要意义。
蛋白质分离是研究蛋白质的关键步骤之一，它可以将复杂的混合物中的蛋白质分离出来，以便进一步研究和分析。
本文将介绍几种常用的蛋白质分离方法。
一、凝胶电泳法凝胶电泳法是一种常用的蛋白质分离方法，它根据蛋白质的电荷、大小和形状差异进行分离。
常见的凝胶电泳方法包括聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和聚丙烯酰胺凝胶电泳（2D-PAGE）。
SDS-PAGE 是一种常用的单纯分子量分析方法，通过将蛋白质样品与 SDS 混合，使蛋白质带负电荷，然后在电场作用下，按照分子量大小进行分离。
2D-PAGE 结合了等电聚焦和 SDS-PAGE 两种方法，可以实现对复杂蛋白质混合物的高分辨率分离。
二、色谱法色谱法是利用物质在固定相或移动相中的吸附、分配、离子交换或分子筛作用，将混合物中的蛋白质分离出来的方法。
常见的色谱方法包括凝胶过滤色谱、离子交换色谱、亲和色谱和逆向相色谱等。
凝胶过滤色谱是根据蛋白质的大小选择性地通过孔径不同的凝胶柱进行分离，分子量较大的蛋白质在凝胶柱中滞留，分子量较小的蛋白质则通过柱床被洗脱。
离子交换色谱是利用蛋白质的电荷差异进行分离，根据蛋白质与固定相上离子交换基团之间的相互作用力进行分离。
亲和色谱则是利用蛋白质与特定配体之间的特异性结合进行分离。
逆向相色谱则是利用蛋白质在有机溶剂和水之间的亲疏性差异进行分离。
三、电泳光谱法电泳光谱法是一种结合了电泳和光谱技术的蛋白质分离方法。
它通过在电泳过程中，利用光谱仪器对蛋白质进行在线检测，可以实时了解蛋白质的分离情况。
电泳光谱法可以通过对蛋白质的吸收光谱、荧光光谱等进行监测，实现对蛋白质的高灵敏度、高分辨率分析。
四、质谱法质谱法是一种基于蛋白质的质量-电荷比（m/z）进行分离和分析的方法。
质谱法包括质谱图谱（M S）和串联质谱（M S/M S）两种主要模式。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量
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5.“SDS — 聚丙稀酰胺凝胶电 泳法测定蛋白质分子量”一实验的开 设达到了与国内同类院校相当的较高 水平。
对本科生的实验教学、本科生的 论文设计、研究生的高级生化实验等 方面都充实了内容。
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（二）特点：
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在 聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二 烷基磺酸钠）。
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蛋白质在一定浓度的含有强还原剂 的SDS溶液中，与SDS分子按比例结合， 形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物。
蛋白质丧失了原有的电荷状态形成 仅保持原有分子大小为特征的负离子团 块，降低或消除了各种蛋白质分子之间 天然的电荷差异，因此在进行电泳时，
电泳分类：移动界面电泳、区带电泳等。
区带电泳 是在半固相或胶状介质上加一个点或一薄 层样品溶液，然后加电场，分子在支持介质上或支 持介质中迁移。
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区带电泳使用不同的支持介质，有
滤纸、纤维素粉、聚氯乙烯树脂、淀 粉凝胶、琼脂凝胶、醋酸纤维素膜， 现在则多用聚丙烯酰胺（PAGE）和 琼脂糖凝胶。
球蛋白（去年完成的基金项目）
（三）纯化免疫球蛋白G DEAE-离子交换纤维素法纯化免疫球蛋白G子量（ 连续四个单项实验）。
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（1）制胶（简单叙述）（双层胶，摸索胶浓度）
A.将玻璃板用蒸馏水洗净晾干, 准备2个干 净的锥形瓶。把玻璃板在灌胶支架上固定好。
开封后溶于200µl蒸馏水，置-20℃保存，使用前室温融化，沸水浴中加热3-5分钟后上样。
。 样品1：称3mg样品1，加2 ml蒸馏水溶解
动物生物化学 第二章 蛋白质
蛋白质分子为右手-螺旋。
（1）-螺旋
-螺旋
表 几种螺旋结构参数
结构类型 残基/圈 1个氢键环的原子数 每个残基高度（nm） Φ Ψ
310螺旋 3.0
位 置
及顺序分析，
的 然后同其它方法分析的肽段进行比较，
确 确定二硫键的位置。
定
2.4 蛋白质的高级结构
2.4.1 肽单位平面结构和二面角
O
O
O
H
H
H
H2N
C
C
N H
C
C
N H
C
C
R
R
R
N端
肽单位
肽单位
O
H
H
NH C C N C COOH
H
R
R
C端
肽单位： 主肽链中的重复单位
肽键平面—由于肽键的双键性质，使得形成肽键的N、C原子以及它们相 连的四个原子形成一个平面，这个平面就叫肽键平面。
蛋白质构件分子是氨基酸。 氨基酸是蛋白质的基本单位。 自然界存在的氨基酸有300多 种，但合成蛋白质的氨基酸只 有20种，都属于α-氨基酸，其 中除甘氨酸外，其余都是L-α氨基酸。
蛋白质分子中的20种 氨基酸在DNA分子中有它 们特异的遗传密码相对应，
因而也称编码氨基酸 （Coding amino acid）。 新近发现的硒代半胱氨酸 （SeCys）也是一种编码 氨基酸。
由 两 个 氨 基 酸 组 成 的 肽 称 为 二 肽 ， 由 多 个 氨 基酸组成的肽则称为多肽。因为多肽呈链状， 所以又称为多肽链。组成多肽的氨基酸单元称 为氨基酸残基。
电泳分离蛋白质的原理
电泳分离蛋白质的原理
电泳分离蛋白质是一种常用的生物化学实验技术，它基于蛋白质在电场中的迁
移速度不同而实现蛋白质的分离。
这项技术在生物学研究、医学诊断和药物研发等领域都有着广泛的应用。
电泳分离蛋白质的原理是基于蛋白质的电荷和大小之间的差异。
当蛋白质置于
电场中时，由于蛋白质分子带有正电荷或负电荷，它们会受到电场力的作用而向电极迁移。
根据蛋白质分子的大小和电荷量，不同的蛋白质将以不同的速度向电极迁移，从而实现蛋白质的分离。
在电泳分离蛋白质的实验中，通常会使用凝胶作为分离介质。
凝胶可以限制蛋
白质的迁移速度，使得蛋白质可以在凝胶中逐渐分离。
而且，凝胶的孔隙大小可以影响蛋白质的迁移速度，从而实现对蛋白质的精确分离。
除了凝胶电泳外，还有一种叫做毛细管电泳的技术也可以用于蛋白质的分离。
毛细管电泳是利用毛细管内的电场来实现蛋白质的分离，它具有分离速度快、样品消耗少的优点。
电泳分离蛋白质的原理不仅可以用于研究蛋白质的结构和功能，还可以用于检
测蛋白质的含量和纯度。
此外，电泳分离蛋白质还可以用于寻找新的蛋白质标记物，从而为疾病的诊断和治疗提供重要的信息。
总之，电泳分离蛋白质的原理是基于蛋白质的电荷和大小之间的差异，利用电
场力和分离介质来实现蛋白质的分离。
这项技术在生物学研究和临床诊断中具有重要的应用价值，为科学研究和医学进步做出了重要贡献。
动物医学 生化实验《实验四 SDS–聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS–PAGE)》课件
动物医学生化实验《实验四 SDS–聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS–PAGE)》课件一实验目的1.掌握SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）的基本原理和操作方法。
2学习蛋白质分离纯化和鉴定方法。
2.了解SDS-PAGE技术在动物医学研究中的应用。
二、实验原理SD-PAGE是蛋白质分离纯化和鉴定的一种常用方法，它利用蛋白质分子量大小的不同，在电场作用下，通过聚丙烯酰胺凝胶进行分离。
1. SDS的作用SDS是一阴离子表面活性剂，可以与蛋白质结合，使蛋白质分子解折叠并带负电荷。
由于SDS与蛋白质的结合比例与蛋白质分子量成正比，因此SDS可以使不同蛋白质分子带相同的电密度，从而消除蛋白质分子本身电荷差异对电泳的影响。
2. 聚丙烯酰胺凝胶的作用聚丙烯酰胺凝胶是一种多孔性物质，其孔径大小可以根据丙烯酰胺和交联剂的浓度进行调节。
蛋白质分在电场作用下通过凝胶，根据其分子量大小不同，在凝胶中迁移速度也不同，从而实现蛋白质的分离。
3. 电泳原理在电场作用下，带负电荷的蛋白质分子在凝胶中向正极迁移，分子小的蛋白质迁移速度快，分子量大的蛋白质迁移速度慢，最终在凝胶中形成不同的蛋白质条带。
三、实验材料1.试剂：o SDS（十二烷基硫酸钠）o Tris（三羟甲基氨基甲烷）o甘氨酸o丙烯酰胺o交联剂（N,N’-亚甲基双丙烯酰胺）o TEMED（N,N,N’,N’-四甲基乙二胺）o过硫酸铵（APS）o考马斯亮蓝R-250o乙醇o醋酸o水o蛋白质样品2.仪器：o电泳槽o电源o微量移液器o烧杯o量筒o试管o培养皿o电泳仪o凝胶成像仪o其他实验室常用仪器四、实验步骤1. 凝胶的制备(1)制备分离胶* 根据需要分离的蛋白质分子量范围，选择合适的丙烯酰胺浓度。
o将丙烯酰胺、交联剂、Tris缓冲液、SDS、TEMED和APS混合，充分搅拌均匀。
o将混合液倒入电泳槽中，蒸馏水覆盖，静置使其聚合。
(2)制备浓缩胶：o将丙烯酰胺、交联剂、Tris缓冲液、SDS、TEMED和APS混合，充分搅拌均匀。
动物生物化学教学大纲
动物生物化学教学大纲Ⅰ课程的性质与设置目的一、课程名称：动物生物化学二、课程编号：动科02104 动医02103三、课程的性质、目的与任务本课程是农业院校动物医学、动物科学本科专业以及有关专业的一门重要专业基础课。
动物生物化学是研究动物生命的化学，是研究生物分子、专门是生物大分子相互作用、相互阻碍以表现生命活动现象原理的科学。
通过本课程的学习，不仅使学生了解生命现象的差不多知识和生命运活动的差不多规律，而且能够把握与动物生理学、动物饲养学、动物遗传学、动物育种学、药理学临床诊断学等专业基础课以及后续专业课程有关的必备差不多理论和技能。
并初步有在今后学习中运用和解决咨询题的能力。
四、教学的差不多任务按照本课程特点，在教学过程中，教师一定要把差不多概念，差不多理论讲解的清晰、易懂，对重点章节要讲深、讲透，并注重各章节的相互联系。
通过学习，使学生不仅能把握生命活动的差不多规律，而且能对物质的代谢途径、关键步骤、关键环节有深刻的认识，同时对物质的代谢又有相互关系的整体概念。
从而培养学生具有一定的分析和解决咨询题的能力。
通过实验教学培养学生具备初步的科学研究能力。
五、本课程在教学中与其它有关课程的联系与分工本课程是安排在本科二年级第一学期的一门课，在学生系统学完无机化学、分析化学、有机化学、物理学、解剖学、组织与胚胎学、生物学、生理学等课程后开设的一门课。
本课程要紧运用各种化学原理、物理原理以及解剖组织学、生物学、生理学的差不多知识来分析研究动物体内物质组成特点和生化反应规律，专门是从分子水平上研究机体代谢特点和生命活动的差不多现象。
为今后课程的学习奠定理论基础。
Ⅱ课程内容与要求一、课程理论内容绪论教学目的通过本章的学习要把握生物化学的差不多概念、研究内容及生物化学与动物医学和动物科学的关系，了解生物化学的进展史。
（二）教学内容1.生物化学的概念2.生物化学的进展3.生物化学与畜牧和兽医第二章蛋白质的结构与功能（一）教学目的通过本章学习，更加深刻懂得蛋白质在生命活动中的作用。
动物生物化学名词解释
动生化名词解释1.氨基酸的等电点：当溶液在某一特定的pH 值时，氨基酸以两性离子的形式存在，正电荷数与负电荷数相等，净电荷为零，在直流电场中既不向正极移动也不向负极移动，这时溶液的pH 值称为该氨基酸的等电点，用pI 表示。
2.肽键：是指键，是一个氨基酸的α–COOH 基和另一个氨基酸的α–NH2基所形成的酰胺键。
3.多肽链：由许多氨基酸残基通过肽键彼此连接而成的链状多肽，称为多肽链。
4.肽平面：肽链主链的肽键具有双键的性质，因而不能自由旋转，使连接在肽键上的六个原子共处于一个平面上，此平面称为肽平面。
5.蛋白质的一级结构：多肽链上各种氨基酸残基的排列顺序，即氨基酸序列。
6.肽单位：多肽链上的重复结构，如C α–CO–NH–C α称为肽单位，每一个肽单位实际上就是一个肽平面。
7.多肽：含有三个以上的氨基酸的肽统称为多肽。
8.氨基酸残基：多肽链上的每个氨基酸，由于形成肽键而失去了一分子水，成为不完整的分子形式，这种不完整的氨基酸被称为氨基酸残基。
9.蛋白质二级结构：多肽链主链骨架中，某些肽段可以借助氢键形成有规律的构象，如α–螺旋、β–折叠和β–转角；另一些肽段则形成不规则的构象，如无规卷曲。
这些多肽链主链骨架中局部的构象，就是二级结构。
10.超二级结构：在球状蛋白质分子的一级结构顺序上，相邻的二级结构常常在三维折叠中相互靠近，彼此作用，从而形成有规则的二级结构的聚合体，就是超 二级结构。
11.结构域：在较大的蛋白质分子里，多肽链的三维折叠常常形成两个或多个松散连接的近似球状的三维实体，即是结构域。
它是球蛋白分子三级结构的折叠单位。
12.蛋白质三级结构：指一条多肽链在二级结构（超二级结构及结构域）的基础上，进一步的盘绕、折叠，从而产生特定的空间结构。
或者说三级结构是指多肽链中所有原子的空间排布。
维系三级结构的力有疏水作用力、氢键、范德华力、盐键（静电引力）。
另外二硫键在某些蛋白质中也起着非常重要的作用。
生物化学课件之蛋白质(共119张PPT)
缬氨酸 valine Val V
亮氨酸 leucine Leu L
异亮氨酸 isoleucine Ile I
苯丙氨酸 phenylalanine Phe F
脯氨酸 proline Pro P
目录
2. 极性中性氨基酸
色氨酸 tryptophan Try W
丝氨酸 serine
Ser S
酪氨酸 tyrosine Try Y
第一节 蛋白质是生命的物质基础
一、什么是蛋白质?
蛋白质(protein)是由许多氨基酸 (amino acids)通过肽键(peptide bond)相连 形成的高分子含氮化合物。
二、蛋白质的生物学重要性
1. 蛋白质是生物体重要组成成分 分布广：
普遍存在于生物界，动物、植物、微生物主要是由 蛋白质构成。
蛋白质元素组成的特点
各种蛋白质的含氮量很接近，平均为16％。
由于体内的含氮物质以蛋白质为主，因此，只 要测定生物样品中的含氮量，就可以根据以下公式 推算出蛋白质的大致含量：
100克样品中蛋白质的含量 ( g % ) = 每克样品含氮克数× 6.25×100
1/16%
二、氨基酸 —— 组成蛋白质的基本单位
赖氨酸 lysine Lys K
精氨酸 arginine Arg R
组氨酸 histidine His H
目录
几种特殊氨基酸
• 脯氨酸
（亚氨基酸）
半胱氨酸
+
-HH
二硫键
胱氨酸
（二）氨基酸的理化性质
1. 两性解离性质 2. 紫外吸收性质 3. 茚三酮反应
1. 两性解离及等电点
氨基酸是两性电解质，其解离程度取决于所处溶液的 酸碱度。
《动物生物化学》课程标准
《动物生物化学》课程标准课程名称：动物生物化学课程类别：专业基础课课程学时：68学时课程学分：4学分一、课程性质与任务《动物生物化学》是将生物化学技术与生物技术有机融合的一门生命科学类的专业基础课程。
生物化学已成为生命科学的基本语言，是生命科学中发展最快并与其它课程广泛交叉与渗透的重要的核心课程，是当代生命科学各专业的重要的专业基础课程之一，也是一门实践性很强的课程。
根据高职高专技能型人才培养目标，围绕畜牧兽医等领域的知识需求进行课程内容整合，拟将专业基础课准确导向专业技术，实现“教学做合一”的教学理念。
通过本课程的学习使学生建立生物活性、酶促反应、生物转化等生物技术的基本思维观念，从而掌握“生物大分子的分离和纯化方法，糖、脂肪、蛋白质、核酸及主要次生代谢产物的定性、定量和有关生物化学性质的分析技术，酶活性测定及应用”等生化技术原理及操作手段，从而熟悉生物体内物质代谢产物积累过程及其调控，为后续专业课程的学习打下思想基础和技术基础。
本课程的教学目的是培养学生能够运用所学生物化学知识，从分子水平上认识和解释生命现象的能力。
本课程需要《动物解剖生理学》等课程为基础，同时又为《宠物营养》、《宠物疫病》等学科的学习打下基础。
二、课程目标（一）知识目标1．了解蛋白质的生物学功能、元素组成、多肽链的基本组成单位——L-a-氨基酸；必需氨基酸的概念。
准确描述肽键、多肽链、蛋白质一级结构、高级结构的概念。
理解蛋白质重要理化性质及有关的基本概念，掌握蛋白质分离纯化及测定方法。
2.掌握核酸的物质组成、组成核酸的基本单位核苷酸、细胞内重要的游离核苷酸。
掌握核酸的结构特征，了解核酸的结构与功能的关系。
了解核酸的一般性质，掌握DNA 的变性与复性及其应用。
3．了解酶的概念、命名和分类，酶的化学本质；掌握酶的特性，酶的结构和功能，酶的活性中心和必需基团。
理解酶促反应机理学说及要点。
熟记影响酶促反应动力学的几种因素，米氏常数的意义、酶活力的测定，调节酶、同工酶、酶（包括固定化酶）的制备和鉴定。
高级动物生物化学：第五章 蛋白质结构与功能的关系
4、蛋白质变性的利用与预防 、
蛋白质变性有许多实际应用。 蛋白质变性有许多实际应用。如在医疗上利用高温 高压消毒手术器械、用紫外线照射手术室、 高压消毒手术器械、用紫外线照射手术室、用70%酒精 酒精 消毒手术部位的皮肤。这些变性因素都可使细菌、 消毒手术部位的皮肤。这些变性因素都可使细菌、病毒 的蛋白质发生变性，从而失去致病作用，防止伤口感染； 的蛋白质发生变性，从而失去致病作用，防止伤口感染； 另外，在蛋白质、酶的分离纯化过程中， 另外，在蛋白质、酶的分离纯化过程中，为了防止蛋白 质变性，必须保持低温，防止强酸、强碱、重金属盐、 质变性，必须保持低温，防止强酸、强碱、重金属盐、 剧烈震荡等变性因素的影响。 剧烈震荡等变性因素的影响。
（四） 蛋白质变性与复性 1、蛋白质的变性与变性因素 、
在变性因素的作用下，蛋白质的空间结构被破坏， 在变性因素的作用下，蛋白质的空间结构被破坏， 从而引起蛋白质生物学功能的丧失和理化性质的改变， 从而引起蛋白质生物学功能的丧失和理化性质的改变，这 种现象被称为变性（ ）。变性后的蛋白质 种现象被称为变性（denaturation）。变性后的蛋白质 ）。 称变性蛋白质；没有变性的称天然蛋白质。 称变性蛋白质；没有变性的称天然蛋白质。 引起天然蛋白质变性的因素很多。 引起天然蛋白质变性的因素很多。 变性的因素很多 物理因素包括热、紫外线、 射线 超声波、高压、 射线、 物理因素包括热、紫外线、X-射线、超声波、高压、 包括热 表面张力，以及剧烈的振荡、研磨、搅拌等； 表面张力，以及剧烈的振荡、研磨、搅拌等； 化学因素（又称变性剂）包括酸、 化学因素（又称变性剂）包括酸、碱、有机溶剂（如 变性剂 有机溶剂（ 乙醇、丙酮等）、尿素、盐酸胍、重金属盐、三氯醋酸、 ）、尿素 乙醇、丙酮等）、尿素、盐酸胍、重金属盐、三氯醋酸、 苦味酸、磷钨酸以及去污剂等。 苦味酸、磷钨酸以及去污剂等。 加入巯基试剂如β-巯基乙醇、二硫苏糖醇（ 加入巯基试剂如 巯基乙醇、二硫苏糖醇（ DTT）使二 巯基乙醇 ） 硫键还原。 硫键还原。
生物化学第5章-蛋白质的三维结构(共41张PPT)
亮氨酸拉链结构，Leucin zipper；
EF手型钙结合性模序
(EF-hand Ca2+-binding motif）
肌钙蛋白的两个结构域。
七、球状蛋白与三级结构
1、定义：蛋白质的三级结构是指多肽链中全部氨基酸残基的相对空间位置，即整 条肽链的三维构象。蛋白质的三级结构是在多种二级结构的基础上进一步
早在20世纪30年代，科学家就开始有X-射线衍射方法研究了肽的结构。 1、酰胺平面：参与肽键形成的两个原子及相邻的四个原子处于同一平面
，形成了酰胺平面，也称肽键平面，又称一个肽单位；多肽链的主链 由许多酰胺平面组成，平面之间以α碳原子相隔。
肽键的键长介于C-N单键和双键之间，具有部分双键的性质，不能自由旋 转;(肽键中C-N键长0.132nm, C-N单键0.148nm,C=N键）
基酸,某些氨基酸如脯氨酸和甘氨酸经常存在其中,由于甘氨酸缺少侧链(只有一个H),在β-转
角中能很好的调整其他残基的空间阻碍,因此使立体化学上最合适的氨基酸；而脯氨酸残
基的R与其α氨基己形成吡咯环，不能形成α-螺旋，因此在一定程度上迫使β-转角形成 。
四、Protein的二级结构——无规则卷曲
random coil
侧链与介质水，主链肽基与侧链或主链肽基与水之间形成。
②稳定蛋白质三维结构的作用力——盐键
盐键又称盐桥或离子键，它是正电荷与负电荷之间的一种静电相互作用。 在近中性环境中，蛋白质分子中的酸性氨基酸残基侧链电离后带负 电荷，而碱性氨基酸残基侧链电离后带正电荷，二者之间可形成离 子键。多数情况下，可解离侧链基团分布在球状蛋白的表面，与介 质水形成水化层，稳定蛋白构象。
酰胺平面中的键长、键角是一定的；
高级动物生化实验指导
《动物生物化学实验原理与技术》实验指导实验目录一、动物血浆（清）IgG的分离纯化二、醋酸纤维薄膜电泳鉴定纯化的IGg三、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）四、Western blot五、动物组织中基因组DNA的提取六、细胞总RNA的提取及反转录合成cDNA七、PCR基因扩增八、琼脂糖凝胶电泳检测DNA九、质粒DNA的小抽提一、动物血浆（清）IgG的分离纯化[实验目的]1. 了解蛋白质分离纯化的一般思路。
2. 掌握硫酸铵盐析、凝胶过滤、DEAE-纤维素离子交换层析等技术的原理与方法[实验原理]分离纯化蛋白质的方法是利用不同蛋白质的某些物理、化学性质(如在一定条件下带电的情况、分子量、溶解度等)不同而建立起来的，其中有盐析、离子交换层析、凝胶过滤、亲和层析、制备电泳及离心等。
在分离纯化时，要根据具体情况选用几种方法相互配合才能达到分离纯化某一种蛋白质的目的。
血浆（清）蛋白质多达70余种，免疫球蛋白（Immunoglobulin，简称Ig）是血浆球蛋白的一种，免疫球蛋白G（Immunoglobulin G，简称IgG）又是免疫球蛋白的主要成分之一。
IgG的相对分子量约为15～16万，沉降系数约为7S。
要从血浆中分离出IgG，首先要尽可能除去血浆中的其他蛋白质成分，即进行粗分离，使IgG在样品中的比例大为增高，然后再精制纯化而获得IgG。
IgG作为被动免疫制剂，在兽医临床上具有广泛的应用价值。
本实验主要采用硫酸铵盐析、凝胶过滤脱盐及DEAE-纤维素离子交换层析等方法，从家畜血浆（清）中分离纯化IgG。
1、用盐析法制备血浆（清）IgG粗制品的原理在溶液中加入中性盐使生物大分子沉淀析出的过程称为“盐析”。
除了蛋白质和酶以外，多肽、多糖和核酸等也都可以用盐析法进行沉淀分离。
不同的蛋白质在同一浓度盐溶液中的溶解度不同，可利用不同浓度的盐溶液使每个蛋白质成分分别析出，通常称为蛋白质的盐析。
因此在蛋白质中加入不同浓度的中性盐可使不同蛋白成分分别析出，从而达到分离纯化抗体的目的。
蛋白质分离常用的方法
蛋白质分离常用的方法蛋白质是生物体内极为重要的生物分子，它们在维持细胞结构和功能、参与信号传导、调节基因表达等方面发挥着关键作用。
为了深入研究蛋白质的结构、功能和相互作用，需要将蛋白质从复杂的细胞或组织中分离提取出来。
本文将介绍蛋白质分离常用的几种方法。
1.裂解和离心裂解蛋白质是将细胞或组织破碎，并释放其中的蛋白质。
常用的破碎方法包括机械破碎、震动破碎、超声波破碎等。
离心则是将裂解后的细胞液或组织液通过离心机进行离心，分离出核酸、细胞碎片和脂质等无机物，从而获得较为纯净的蛋白质上清液。
2.尺寸分离蛋白质的分子量各不相同，可以通过尺寸分离方法将其分离。
凝胶过滤、凝胶层析和凝胶电泳是常用的尺寸分离方法。
其中，凝胶过滤是利用顺流式通过孔径范围适宜的滤膜，将大于膜孔径的蛋白质截留在滤膜上；凝胶层析是利用凝胶的固定孔径将蛋白质分栏，根据分子量的大小来分离蛋白质；凝胶电泳是利用蛋白质的质量与电荷比例差异，通过电场将蛋白质分离。
常见的凝胶电泳方法有聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-）、两性凝胶电泳（IEF）等。
3.电泳分离电泳方法也是常用的蛋白质分离方法。
除了凝胶电泳之外，还有薄层电泳和等电聚焦电泳等。
薄层电泳是将样品在平面介质生电泳，可以通过对比分析来确定蛋白质之间的分离情况；等电聚焦电泳是利用蛋白质的等电点差异进行分离，根据蛋白质的等电点将其分离在等电聚焦凝胶中。
4.亲和层析亲和层析是利用蛋白质与一些亲和剂之间的特异性相互作用进行分离。
亲和剂可以是抗体、金属离子、配基等。
通过将亲和剂固定在其中一种介质上（例如琼脂糖凝胶、磁珠等），蛋白质与亲和层析介质发生特异性结合，从而让非目标蛋白质通过，最终达到分离纯化目标蛋白质的目的。
5.离子交换层析离子交换层析是利用蛋白质与离子交换剂之间的电荷吸附/排斥相互作用进行分离。
离子交换剂通常是用带电的固定相，根据蛋白质的电荷性质和pH值来调节吸附和洗脱条件，使得目标蛋白质与固定相发生离子交换作用，从而实现蛋白质的分离。
高级动物生物化学
高级动物生化试题一、名词解释1、氧化磷酸化（oxidative phosphorylation）：指的是与生物氧化作用相伴而生的磷酸化作用，是将生物氧化过程中释放的自由能用以使ADP和无机磷酸生成高能ATP的作用。
2、别构效应（allosteric effect）：是指某种不直接涉及蛋白质活性的物质，结合于蛋白质活性部位以外的其他部位（别构部位），引起蛋白质分子的构象变化，而导致蛋白质活性改变的现象。
3、糖异生（gluconeogenesis）：指的是非糖化合物（乳糖、甘油、生糖氨基酸等）转变为葡萄糖和糖原的过程。
4、β-氧化（β-oxidation）：是指脂肪酸氧化生成乙酰—CoA的途径。
脂肪酸活化成脂酰—CoA后，逐步氧化脱下乙酰—CoA。
每次氧化从β碳原子开始，故称为β-氧化。
5、冈崎片段（Okazaki fragment）：是指在DNA不连续复制过程中，沿着后随链的模板链合成的新DNA片段。
6、分子病（molecular disease）：是指由于基因或DNA分子的缺陷，致使细胞内RNA及蛋白质合成出现异常、人体结构与功能随之发生变异的疾病。
7、乳糖操纵子（lac operon）：是指大肠杆菌中控制β半乳糖苷酶诱导合成的操纵子。
包括调控元件P(启动子)和O(操纵基因)，以及结构基因LacZ(编码半乳糖苷酶)、LacY(编码通透酶)和LacA(编码硫代半乳糖苷转乙酰基酶)。
二、问答题：1、试述miRNA的结构特点及其功能miRNA 的结构特点：①广泛存在于真核生物中,，是一组不编码蛋白质的短序列RNA ,，它本身不具有开放阅读框架(ORF) ；②通常的长度为20～24nt，但在3′端可以有1～2个碱基的长度变化；③熟的miRNA5′端有一磷酸基团，3′端为羟基, 这一特点使它与大多数寡核苷酸和功能RNA的降解片段区别开来；④数miRNA还具有高度保守性、时序性和组织特异性。
miRNA的功能：目前只有一小部分miRNAs生物学功能得到阐明。
蛋白质的分离工艺
蛋白质的分离工艺蛋白质的分离工艺是指将蛋白质从混合物中分离出来的过程。
蛋白质是生物体内的重要分子，具有重要的生理功能，因此对蛋白质的分离具有重要意义。
蛋白质的分离工艺主要包括溶解、沉淀、过滤和纯化四个步骤。
首先，蛋白质的分离工艺的第一步是蛋白质的溶解。
蛋白质通常在水中溶解，但一些蛋白质可能在水中不稳定或不溶解。
在这种情况下，可以使用缓冲溶液来溶解蛋白质。
常用的缓冲溶液有Tris-HCl缓冲溶液、PBS缓冲溶液等。
在蛋白质溶解的过程中，还可以添加牛磺酸、尿素等助溶剂来提高蛋白质的溶解性。
第二步是蛋白质的沉淀。
蛋白质溶液中的杂质需要去除，可以通过加入沉淀剂来使蛋白质沉淀。
常用的沉淀剂有硫酸铵、氯化铵等。
通过调节沉淀剂的浓度和溶液的pH值，可以控制蛋白质的沉淀速率和选择性沉淀。
沉淀得到的蛋白质可以通过离心将其分离出来。
第三步是蛋白质的过滤。
在蛋白质的分离过程中，常常需要通过过滤来去除大分子物质和杂质。
过滤可以使用纸滤、膜滤等不同的过滤方式。
通过选择合适的过滤膜孔径和压力，可以将蛋白质与溶液中的其他成分分离。
最后一步是蛋白质的纯化。
在蛋白质溶液中，通常会存在多种蛋白质，需要进行纯化以获得目标蛋白质。
常用的蛋白质纯化方法有电泳分离、亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤等。
这些方法可以根据蛋白质的理化性质进行分离，并逐步减少溶液中其他杂质的含量，从而获得纯净的目标蛋白质。
总结起来，蛋白质的分离工艺包括溶解、沉淀、过滤和纯化四个步骤。
这些步骤可以根据蛋白质的特性和要求进行调整和组合，以达到高效、准确地分离和纯化蛋白质的目的。
蛋白质的分离工艺对于生物制药、食品科学等领域的发展具有重要意义，为相关领域的研究和应用提供了必要基础。
高级动物生物化学：3-蛋白质的电泳分离-3
在溶液中，电场所产生的加速力被阻力平衡，即 F= F’，因此有：
Q·E/d=6π r η v
由上式可以看出，粒子在电场里运动的速度与场 强和粒子的电荷成正比，但与粒子的大小和溶液的粘 度成反比。 粒子在电场中移动的速度常用电泳迁移率来表示， 即带电颗粒在单位电场度下的泳动速度：
式中，M为迁移率；L为粒子泳动的距离；t为通电（电泳） 时间。在一定条件下，对于一定的粒子，M是一定的。因 此，它是描述物质在电泳中行为的特征参数。
F= Q ·E d
E为两个电极间的电势差; d是两个电极间的距离; E/d就是通常所指的场强; Q 为粒子所带电荷。
如果是在真空里，带电粒子的移动会很快，最后撞 到电极上。但是，在溶液里就不会是这样，因为电场对 粒子的拉力被运动的分子和溶液之间产生的阻力或摩擦 力所平衡。 根据Stoke方程，这种阻力的大小取决于粒子的 大小和形状以及粒子所通过的介质的粘度： F’=6πrηυ F’是球形粒子的阻力；r是球形分子的半径；η是溶液 的粘度；υ是粒子运动的速度。
缓冲液的种类直接影响电泳结果。用Tris-HCl分 离蛋白质时，HCl解离成Cl-,其泳动速度比蛋白 质快得多。由于样品与缓冲离子的泳动速度不一 致，引起不对称峰出现。若改用Tris-HAc和 Tris-硼酸，可消除此现象。缓冲液的pH直接影 响样品的解离程度和电荷密度。
④支持介质 介质结构对分子泳动速度有很大影响。介质对样 品颗粒的吸附可导致样品的拖尾，降低分辨率。 纸的吸附作用最大，醋酸纤维素吸附较小。有的 支持介质（如纸和淀粉胶）具有较强的电渗作用， 即电泳缓冲液相对于固体支持物的相对移动。显 然，电渗作用影响了泳动率。
但是，通过整个电泳系统的电流必须维持恒定，因此， 在快离子（Cl-）和慢离子（甘氨酸的COO-，此时仅占Gly 分子的0.1%,其余99.9%为偶离子）之间的区域的电压增加， 结果在Cl-和Gly-间产生一个很高的局部电压梯度。
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二、电泳的类型
1. 电泳基本上分为两大类：
1) 自由界面电泳 包括微量电泳、显微电泳、等点聚焦，蔗糖 密度梯度电泳及等速电泳等 。 2) 使用支持物的区带电泳 按支持物的类型又分为：纸上电泳、醋酸纤维 薄膜电泳、薄层电泳、非凝胶电泳和凝胶电泳。
2. 按使用形式分类:
水平式、垂直式、板形、柱形电泳、双向 电泳、连续流动电泳及电泳和层析（如分 子筛）相结合的技术。 3.按使用目的分类: 分析型和制备型两种。 4.按操作原理电泳可分类： 一般电泳、等速电泳、等电聚焦电泳和免 疫电泳等。
（三）凝胶等电聚焦 (Isoelectric focusing) 1. 原理 等电聚焦是利用某些两性电解质支持物在电场中 形成pH梯度，使蛋白质样品在与它们的等电点相 应的pH区域集中，等电点不同的蛋白质泳动后形 成位臵不同的区带而得到分离。
1)载体两性电解质 是用脂肪族多氨基、多羧基物质作介质， 在电场中可获得理想的平滑pH梯度。 这种物质的商品名称Ampholine，它实 际上是一系列不同等电点的脂肪族多氨基 多羧基同系物及异构物的混合物，由丙烯 酸与多乙烯多胺加成后产生的。 由于合成物的不同分子氨基和羧基的比 例不同，从而形成连续的等电点。通常的 范围在pH3-10。
凝胶与电泳缓冲液的pH和离子浓度相同，称 为连续式电泳。 这种凝胶是微孔物质、样品不易扩散，加上兼 有分子筛作用，分离效果较好。
在这种连续电泳方式的基础上，又开发了不连 续凝胶电泳，电泳带像一个薄盘嵌在凝胶柱中间， 故称盘状电泳。 由于使用的胶浓度、pH、电压都是不连续的， 所以又称不连续电泳，简称Disc电泳。
缓冲液的种类直接影响电泳结果。用Tris-HCl分 离蛋白质时，HCl解离成Cl-,其泳动速度比蛋白 质快得多。由于样品与缓冲离子的泳动速度不一 致，引起不对称峰出现。若改用Tris-HAc和 Tris-硼酸，可消除此现象。缓冲液的pH直接影 响样品的解离程度和电荷密度。
④支持介质 介质结构对分子泳动速度有很大影响。介质对样 品颗粒的吸附可导致样品的拖尾，降低分辨率。 纸的吸附作用最大，醋酸纤维素吸附较小。有的 支持介质（如纸和淀粉胶）具有较强的电渗作用， 即电泳缓冲液相对于固体支持物的相对移动。显 然，电渗作用影响了泳动率。
PAG电泳是根据物质所带电荷及其分子大小、 形状的差异，在电场作用下产生不同电泳速度而 分离的技术，它有静电效应和分子筛效应，分辨 率很高。
在PAG中加两性电解质载体便成为等电聚焦电 泳，加入SDS，即成为SDS-PAG电泳。 (一) 盘状电泳 1. 一些基本概念： PAGE有连续式和不连续式。
蛋白质也在电场中运动，不过由于其分子量大， 它们要花费更多的时间才能达到其相应的等电点位 置。所形成的pH梯度范围决定于Ampholine的组成。
已有不同pH范围的Ampholine出售：
3.5-9.5、2.5-6.0、5.0-8.5、7.5-10.5。pH 范围越窄，分辨力越高。 聚焦效果与电压密切相关，电压高、分辨力也高， 样品聚焦成很窄的带。灵敏度达到0.01-0.02个pH单 位。
F= Q ·E d
E为两个电极间的电势差; d是两个电极间的距离; E/d就是通常所指的场强; Q 为粒子所带电荷。
如果是在真空里，带电粒子的移动会很快，最后撞 到电极上。但是，在溶液里就不会是这样，因为电场对 粒子的拉力被运动的分子和溶液之间产生的阻力或摩擦 力所平衡。 根据Stoke方程，这种阻力的大小取决于粒子的 大小和形状以及粒子所通过的介质的粘度： F’=6πrηυ F’是球形粒子的阻力；r是球形分子的半径；η是溶液 的粘度；υ是粒子运动的速度。
2. 圆盘电泳的原理
通过通电后各种离子的电泳行为来理解：
上槽缓冲液中Gly既可以净电荷为零的两性离子存 在，也可以带负电的Gly-离子存在：
NH3+ CH2COO-
NH2-COO- + H+
通电时，氯化物、蛋白质、溴酚蓝和甘氨酸的阴离 子都开始向阳极移动。当甘氨酸离子进入样品缓冲液 和浓缩胶时，就遇到了低pH环境，因而使上式的平衡 向偶离子的方向移动，而偶离子在电场中是不动的。 甘氨酸偶离子停止向样品和浓缩胶移动，就造成了移 动离子的短缺，因而使电流减弱。
在溶液中，电场所产生的加速力被阻力平衡，即 F= F’，因此有：
Q·E/d=6π r η v
由上式可以看出，粒子在电场里运动的速度与场 强和粒子的电荷成正比，但与粒子的大小和溶液的粘 度成反比。 粒子在电场中移动的速度常用电泳迁移率来表示， 即带电颗粒在单位电场度下的泳动速度：
式中，M为迁移率；L为粒子泳动的距离；t为通电（电泳） 时间。在一定条件下，对于一定的粒子，M是一定的。因 此，它是描述物质在电泳中行为的特征参数。
第五节
蛋白质的电泳分离
一、电泳的基本原理 二、电泳的类型 三、聚丙烯酰胺凝胶电泳 四、凝胶免疫电泳 五、高效毛细管电泳 六、印渍转移法（Western blotting）
电泳技术是鉴定生物大分子和分析其纯度的重要方法。
一、电泳的基本原理
蛋白质是两性电解质，在一定的pH下，可以解离 成为带正电荷或带负电荷的粒子。在电场中，带正电荷 的粒子向负极移动；带负电荷的粒子向正极移动。带电 粒子在电场中所受的力：
自由界面电泳过程中扩散严重、分辨率有限， 而且设备昂贵、操作繁琐，现已基本被区带电 泳所取代。 区带电泳分辨率很高，而且设备简单、操作 方便、经济实用。
三、聚丙烯酰胺凝胶电泳
目前对蛋白质分离有着高分辨率的电泳支 持物首推聚丙烯酰胺凝胶（PAG），它电渗 作用小、孔度可以控制、物理化学性质稳定。
但是，通过整个电泳系统的电流必须维持恒定，因此， 在快离子（Cl-）和慢离子（甘氨酸的COO-，此时仅占Gly 分子的0.1%,其余99.9%为偶离子）之间的区域的电压增加， 结果在Cl-和Gly-间产生一个很高的局部电压梯度。
在这个条件下，离子的相对迁移率是：Gly-<蛋白质离 子<溴酚蓝离子< Cl-。在这个强的局部电场中，所有的阴 离子蛋白质都移动迅速。浓缩胶是大孔胶，因而不阻碍蛋 白质的前进。如果哪一个蛋白质超过快离子，那它的移动 会慢下来，因为凡有Cl-的地方，并不缺少离子，因此没 有高的电位梯度。
2. 圆盘电泳的特点是不连续性：
1)胶浓度不连续: 使用两种凝胶，上层称浓缩胶 (stock gel), 浓度一般为3%，其孔径大，高度2-3cm;下层为分 离胶（Separated gel）。 分离胶浓度根据被分离物的分子量大小而定， 一般是7.5-30%，其孔径小，高度5-6cm。
2) pH不连续: 浓缩胶pH为6.7
分离胶pH8.9
电极缓冲液的pH为8.3 3) 缓冲系统不连续： 制备凝胶用Tris-HCl缓冲液
电极缓冲液为Tris-Gly
4) 电压梯度不连续
由于Cl-和Gly-离子的泳动速度不同，造成电 压梯度不连续。 正是由于这种不连续性使盘状电泳对样品具有浓 缩作用，即使浓度很低的蛋白质（10-50μg），也 能形成一条清晰的带，因而盘状电泳具有很高的 分辨率。
3. 和常规电泳比较，SDS-PAG电泳的操作有下面 不同： 1) 缓冲液： 在0.2M pH7.2的磷酸缓冲液中加入0.2%的 SDS和0.2%的巯基乙醇； 2) 样品： 电泳前蛋白质要溶解在1%SDS和1%巯基乙醇 的0.01M pH7.2的磷酸缓冲液中，100℃加热 2-5分钟。
4. 此法的最大缺点：
这样当蛋白质快速移动到含Cl-的区域时会马上慢下来。 蛋白质在Cl-前沿的后边快速移动，当它达到前沿时又慢下 来，这种情况就导致蛋白质样品在甘氨酸离子和Cl-之间聚 集或浓缩成一个密集的圆盘。当蛋白质圆盘进入分离胶时， 由于凝胶孔度变小，因此移动变慢；而此时甘氨酸的解离 程度大大增加、带负电的离子增加到5%，所以甘氨酸泳动 速度加快、逐渐赶上和超过样品蛋白质的各个组分，消除 了电压梯度。
这可能是由于蛋白质分子大小的差别被它们 所带净电荷的差别所补偿。为了克服这个问题， Shapiro等人试图在十二烷基硫酸钠（SDS）存在 下来分离蛋白质混合物，发现，如果在PAG电泳 系统中加入SDS，则蛋白质的迁移率主要取决于 它的分子量，而与所带电荷和形状无关。
2. SDS原理： SDS是阴离子去污剂它能与蛋白质的疏水部分相 结合，并能把大多数蛋白质拆成组成它们的亚基形 式。由于大多数蛋白质与SDS的结合是按摩尔比 1.4:1进行，结合量很大，蛋白质表面电荷极大增加， 因而屏蔽了无SDS时正常存在的任何一种电荷。
2) 抗对流介质 用凝胶作抗对流介质的等电聚焦就是凝胶等电聚 焦。常用的抗对流介质是PAG, 它的作用是维持 连续性pH梯度和稳定分离后的蛋白区带。 3)电泳条件 等电聚焦电泳在通电之初，载体的电导很高， 载体两性电解质在电场中移动并形成pH梯度，这 时电导和电流都逐渐下降，而电压逐渐升高，形 成电压梯度。 电流下降到零，整个系统的电荷趋于零，达到 稳定状态，但功率始终维持不变。
1)SDS与蛋白质分子结合后，就发生构象变化， 解离成亚单位，失去原有活性。
2)有些蛋白质在SDS体系中的相对迁移率与其分 子量不呈线性关系，如某些糖蛋白，含二硫键 较多的蛋白质等的迁移率一般偏低，并不能代 表其实际分子量。 因此，一定要先用若干指示蛋白进行电泳， 绘制出logMr-M曲线。凡符合这直线关系的 蛋白质，方可用此法测分子量。
SDS与蛋白质结合后，引起了蛋白质构象的变化， 使雪茄形的蛋白质分子的轴比改变，在巯基乙醇作 用下，二硫键还原为巯基，不同蛋白质组成的短轴 趋于一致，长轴与分子量成正比。它们的泳动速度 不再取决电荷和形状，仅与蛋白质的分子量有关。
用此法测分子量时，至少要有3-4种标准蛋白质， 而且它们的分子量要分布在未知蛋白质的两侧。
影响迁移率的因素：
影响迁移率的因素概括起来有如下几种： ① 蛋白质粒子的性质 电荷越多，泳动速度越快。粒子大小和形状也影响泳 动速度。较大粒子与周围介质摩擦力增加，泳动率下降。 球蛋白粒子的摩擦力和静电作用力小于纤维蛋白粒子。 ② 电场