人骨髓间充质干细胞的分离培养及其生物学特性的研究

人骨髓间充质干细胞的分离培养

及其生物学特性的研究

易敬林1,杨海军1,丁伟荣2,柳　2,吴晓牧2,杨志刚2,陈　波2,何　丹2

(江西省人民医院1.眼科;2.中心实验室,江西南昌330006)

摘要:目的　研究人骨髓间充质干细胞(MSCs)的分离和培养条件,并探讨其生物学特性。方法　取无恶性血液病的32～65岁的成人骨髓7例,经密度梯度离心得到单个核细胞,加入含10%胎牛血清的DM EM/F12培养液,将细胞的密度调整到1×106个/mL,接种到12孔培养板中(1mL/孔)进行培养,48h后更换新鲜培养液,以后每3d 换液1次。当细胞铺满培养板底90%以上时,按常规方法进行细胞传代培养。用流式细胞术检测培养细胞的CD29、CD44、CD166、CD105、CD34、CD45、HL A2DR表达情况。并且使用脂肪细胞诱导培养液诱导培养MSCs,油红O染色检测其能否被诱导分化为脂肪细胞。结果　成人骨髓接种后24h内细胞开始聚集成细胞集落,并从集落中长出少许长梭形细胞,6～15d细胞进入快速增殖期,一般培养20～25d后细胞汇合成片铺满培养板底;而传代培养的细胞每代约需10～15d即可铺满瓶底。流式细胞术检测结果显示,此次培养的骨髓来源细胞高表达CD29、CD44、CD166、CD105,不表达CD34、CD45、HL A-DR,符合骨髓MSCs细胞的特性。油红O染色显示MSCs可以被诱导分化为脂肪细胞。结论　用密度为1.077g/mL淋巴细胞分离液作为分离液,密度梯度离心法分离培养的人骨髓MSCs增殖力强,操作简单,是一种较好的分离和培养MSCs的方法。MSCs可以被诱导分化为脂肪细胞。

关键词:骨髓;间充质干细胞;细胞培养

中图分类号:Q813.1+1 文献标识码:A 文章编号:1000-2294(2005)06-0001-04

Study of the Isolation,Culture,and Biological Properties of

H um an Bone Marrow Mesenchym al Stem Cells

YI Jing2lin1,YANG H ai2jun1,DING Wei2rong2,L IU Zhe2,

WU Xiao2mu2,YANG Zhi2gang2,CHEN Bo2,HE Dan2

(1.Dep artment of O p ht hal molog y;

2.Center L aboratory,J i ang x i Provi nce People’s Hos pit al,N anchan g330006,Chi na)

ABSTRACT:Objective　To st udy a met hod for t he isolation and cult ure of human bone marrow mesenchymal stem cells(MSCs)in vitro and explore t heir biological properties.Methods　Bone marrow aspiration samples were obtained f rom7adult human donors32to65years old wit hout severe hematopietic diseases.Mononuclear cells were acquired after density gradient cent rif uga2 tion of t he collected bone marrow aspiration.Then t hey were seeded at1×106cells/ml in DM EM/F12supplemented wit h10%fetal bovine serum(FBS)in a hole of12holes cult ure plate.The medium was changed first time after48hours,and o nce every3days t hereafter.

When t he cult ures reached nearly90%of confluence,cells were passaged wit h routine met hods.

Cell surface antigens which contain CD29,CD44,CD166,CD105,CD34,CD45,HL A2DR were detected wit h flow cytomet ry.MSCs were treated wit h adipocyte cult ure fluid,t hen t hey were detected wit h oil red stain to ascertain whet her MSCs could be induced to adipocyte or not.R esults

　A small percentage of isolated cells were adherent to t he flasks and grew as typically fibroblas2

收稿日期:2005-07-29

作者简介:易敬林(1951-),男,本科,教授,主任医师,研究方向:干细胞的基础及应用研究。

tic shape48hours after plating.Primary cells derived f ro m adult human bone marrow reached 90%of confluence in20to25days.Passaged cells reached90%of confluence in10to15days. The cult ured adherent cells typically expressed CD29,CD44,CD166and CD105,while CD34, CD45,HLA2DR of t hem were negative.The result of oil red stain showed t hat MSCs were able to be induced to adipocyte.Conclusion　The isolated and cult ured MSCs by t he met hod of density gradient centrif ugation are of singular configuration,stable growt h and rapid proliferation.This met hod is a good one to isolate and cult ure MSCs.MSCs can be induced to adipocyte.

KE Y WOR DS:bone marrow;mesenchymal stem cells;cell culture

间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是普遍存在于人体各组织中的一种成体干细胞。从骨髓、外周血、脐血、脂肪组织、骨外膜、骨小梁、肌肉、胎肺、胎肾等组织中都可以分离出间充质干细胞,其中骨髓的含量最丰富[1]。间充质干细胞是一种具有多向分化潜能的干细胞,它不但可以分化为多种中胚层间质组织细胞,如脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱和韧带;而且在一定的条件下,还可以横向分化为多种外胚层和内胚层的组织细胞,如血管内皮细胞、神经元细胞、神经胶质细胞、肝细胞、皮肤干细胞、表皮细胞等[2]。因此,间充质干细胞可以作

,在组织工程方面具有巨大的应用前景。本实验拟探讨成人骨髓间充质干细胞的分离和培养条件,并且研究其部分生物学特性,为以后深入研究MSCs的细胞特性和在组织工程方面的应用奠定基础。

1　材料和方法

1)　标本来源:经肝素抗凝的成人骨髓7份,来自本院及江西医学院二附院的骨髓穿刺室,2男5女,年龄为32～65岁,平均52.5岁,并且都经过骨髓细胞学检查排除了血液系统的恶性疾病。

2)　人骨髓MSCs的分离和培养:从成人的髂骨处抽取骨髓3mL,注入内含0.3mL肝素钠生理盐水(1200U/mL)的消毒小玻璃瓶内,轻轻摇匀,避免其凝固,用DM EM培养液(G ibco公司)3mL/ min稀释后,缓慢加入含有淋巴细胞分离液(密度为1.077g/mL,上海华精生物)6mL的离心管内,2 500rp m离心25min,抽出含有单个核细胞的白色膜状层,用PBS清洗2次,洗去其中的淋巴细胞分离液,加入含体积分数为10%的胎牛血清(G ibco公司)的DM EM/F12(v/v=1/1,G ibco公司)培养液,轻轻吹打使之成为单细胞悬液,调整细胞浓度到1×106个/mL,接种于12孔培养板中,1mL/孔,放在37℃、含体积分数为5%的CO2的饱和湿度培养箱中培养。48h后更换新鲜培养液,去除未贴壁细胞,以后每3天换液1次。每天在倒置相差显微镜下观察细胞生长情况并拍照。

3)　人骨髓MSCs的传代培养:当细胞铺满培养板底90%以上时,去除培养液,PBS冲洗3次,用0.25%胰蛋白酶(Sigma公司)室温下消化3～5 min,见细胞松动浮起时,胎牛血清终止消化,PBS 清洗3次,加入含体积分数为10%的胎牛血清的DM EM/F12培养液,调整细胞浓度到2×104个/ mL,接种于25cm2培养瓶中,5mL/瓶,放在37℃、含体积分数为5%的CO2的饱和湿度培养箱中培养,每3天换液1次。每天在倒置相差显微镜下观察细胞生长情况并拍照。

4)　人骨髓MSCs生长曲线的测定:取第1次和5次传代的细胞,接种于24孔培养板内(细胞数为2×104个/孔),放在37℃、含体积分数为5%的CO2的饱和湿度培养箱中培养,在培养的第1、2、3、4、5、6、7、8天各随机取出3孔,将细胞消化并计数,绘制人骨髓MSCs的生长曲线。

5)　人骨髓MSCs表面标记物的检测:当细胞铺满培养板底90%以上时,去除培养液,PBS冲洗3次,用0.25%胰蛋白酶(Sigma)室温下消化3～5 min,见细胞松动浮起时,胎牛血清终止消化,PBS 清洗2次,10mL PBS悬浮细胞,400目纱网过滤, 1000r/min离心5min收集细胞,用PBS重新悬浮细胞,制成1×106/mL的细胞悬液,加入流式细胞检测试管,每管250mL,在各管中分别加入以下抗体10μL:CD1052FITC/CD452PE、CD342FITC/ CD1662PE、CD442FITC/CD292PE、CD1052FITC/ HL A2DR2Pc5,室温避光孵育30min,PBS清洗3次,流式检测缓冲液1mL重悬细胞,上流式细胞仪(美国B EC KMAN COUL TER公司)检测,以同种荧光标记的Ig G1抗体作为阴性对照确定背景标记,同一条件检测其他各管的细胞,每次至少分析5000个细胞,检测阳性率。

6)　定向诱导人骨髓MSCs向脂肪细胞分化:取第4次传代的细胞,接种于有盖玻片的12孔培养